朱槿花苞提取物治療皮膚癤癰潰瘍及其機(jī)制研究

姜霽洋，徐 涵，白雪婷，程，林艷玲，凌 震，陳一村，石剛剛

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東汕頭 515041）

朱槿花苞提取物治療皮膚癤癰潰瘍及其機(jī)制研究

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東汕頭 515041）

中國圖書分類號(hào)：R-332；R282．71；R284．1；R632.053.1

摘要：目的 研究朱槿花苞提取物對小鼠皮膚癤癰潰瘍模型的治療作用，并對其可能作用機(jī)制進(jìn)行探討。方法 將昆明小鼠分為模型組、陽性藥組和朱槿花苞正丁醇萃取物（HrBN）組，采用小鼠癤癰模型，觀察給藥后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將昆明小鼠分為模型組、陽性藥組和HrBN低、中、高劑量組，采用小鼠全層切除模型，觀察給藥后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)檢測朱槿花苞提取物抗菌MIC和抑菌圈。通過碳粒廓清實(shí)驗(yàn)測定朱槿花苞提取物對小鼠巨噬細(xì)胞廓清作用的影響，計(jì)算K和α值。結(jié)果 HrBN對癤癰潰瘍修復(fù)效果明顯，并呈現(xiàn)量效關(guān)系。HrBN、朱槿花苞乙酸乙酯萃取物（HrBE）及AB-8樹脂體積分?jǐn)?shù)0.3乙醇段、0.6乙醇段的抗菌作用明顯。HrBN及朱槿花苞乙醇提物（HrBA）高劑量能夠增加K和α值。結(jié)論 HrBN在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)了良好的皮膚癤癰潰瘍修復(fù)作用，其療效與抗菌活性和免疫增強(qiáng)作用可能有關(guān)。

關(guān)鍵詞：朱槿花苞；正丁醇萃取物；癤癰模型；全層缺失模型；抗菌；碳粒廓清

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．015．html

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，♀♂各半，購于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。恒溫恒濕飼養(yǎng)。

1．1．2供試菌株 標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌ATCC29213和銅綠假單胞菌ATCC27853由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附一醫(yī)院檢驗(yàn)科贈(zèng)送，恒溫隔水培養(yǎng)箱中35℃過夜培養(yǎng)，使用無菌生理鹽水配制為0．5麥?zhǔn)蠞舛染骸？咕鷮?shí)驗(yàn)所使用器具均經(jīng)高溫高壓無菌處理。

1．1．3儀器與試劑 上海亞榮生化儀器廠RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海浦東榮豐科學(xué)儀器公司101A-1型烘箱，沈陽譽(yù)德電子儀器公司電腦自動(dòng)脫水機(jī)，廣州先尼儀器公司Nikon顯微鏡，恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱，蘇州凈化設(shè)備公司超凈臺(tái)，Molecular Device酶標(biāo)儀SpectraMax M2e 200-100，ZHENGDAER-5758剃毛器。AB-8大孔樹脂，體積分?jǐn)?shù)為0．95乙醇（西隴化工有限公司），乙酸乙酯（西隴化工有限公司），氯仿（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），正丁醇（西隴化工股份有限公司），DMSO（西隴化工有限公司），質(zhì)量濃度為4 g·L－1多聚甲醛，巴豆油（Sigma公司），松節(jié)油（廣州新港化工廠），一得閣墨汁，肝素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），百多邦軟膏（中美史克有限公司），鹽酸左旋咪唑（廣東華南藥業(yè)有限公司）。

1．1．4藥材與藥物 朱槿花苞采摘于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院花圃，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院鑒定。鑒定人：廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥用植物教研室彭光天博士。鑒定植物為錦葵科木槿屬朱槿Hibiscus rosa-sinensis Linn。

取鮮藥500 g，剪碎，1.5 L體積分?jǐn)?shù)0.7～0.8乙醇80℃加熱1h后過濾，重復(fù)2次，加入1.5 L乙醇加熱30 min后過濾，合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上45℃蒸干，得朱槿花苞乙醇提取物（HrBA）。將醇提物配制為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03的水溶液，按1∶1相比分別使用正丁醇、乙酸乙酯萃取7～8次，分別于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮蒸干得HrBN、HrBE浸膏。

AB-8大孔樹脂經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.95乙醇及HCl溶液、NaOH溶液預(yù)處理后，用大量純化水洗凈后濕法裝柱。加朱槿花苞醇提液（150 g·L－1）于柱頂，以1 mL·min－1的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附平衡后，同等流速下先使用適量水洗脫，再使用2BV體積分?jǐn)?shù)分別為0.3乙醇液、0.6乙醇液、0.95乙醇液洗脫，收集各段洗脫液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮即得各洗脫產(chǎn)物浸膏。

2.2.1 病蟲災(zāi)害防治要求 有機(jī)農(nóng)業(yè)植物保護(hù)在有機(jī)產(chǎn)品的生產(chǎn)及加工規(guī)定中，不能在植物栽培過程中使用化學(xué)農(nóng)藥，并要求嚴(yán)格控制基因工程產(chǎn)品的使用，限制使用石灰及波爾多液等含有真菌的化學(xué)農(nóng)藥。另外，推薦在有機(jī)農(nóng)業(yè)植物保護(hù)中使用醋、乙醇或軟皂等環(huán)保物質(zhì)；倡導(dǎo)利用小黑隱翅甲等害蟲天敵防治辦法，或采用展板等捕殺害蟲的工具。

1．2方法

1．2．1實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在藥理實(shí)驗(yàn)肉芽腫模型的基礎(chǔ)上［7］，改良癤癰動(dòng)物模型：小鼠腹腔注射質(zhì)量濃度100 g·L－1水合氯醛（0.4 mg·g－1）麻醉，背部褪毛（3 cm×3 cm），使用含體積分?jǐn)?shù)0.002巴豆油的松節(jié)油合劑，1 mL胰島素注射器于每只小鼠背中部脊椎處皮內(nèi)注射0.06 mL，以出現(xiàn)白色癤癰伴紅腫，且膿包上切面高出周圍皮膚1～2 mm為造模完成標(biāo)準(zhǔn)。

全層切除皮膚創(chuàng)傷模型［8］：小鼠腹腔注射質(zhì)量濃度100 g·L－1水合氯醛（0.4 mg·g－1）麻醉，背部褪毛（3 cm×3 cm），醫(yī)用酒精清潔小鼠皮膚，使用直徑4 mm的打孔器于小鼠背部脊椎處切除同樣直徑的圓形皮膚組織，以露出筋膜為準(zhǔn)。

1．2．2朱槿花苞正丁醇萃取物（HrBN）對癤癰模型小鼠作用研究 昆明小鼠30只，♀♂各半，隨機(jī)分為模型組、百多邦組、HrBN組（150 g·L－1），每組10只。造模3 h后于造模癤癰處給藥1次，分別涂抹溶劑0.3 mL、百多邦約0.2 g、HrBN藥液0.3 mL，造模次日記錄為給藥d 1，d 1～3每日給藥2次，d 4 ～9每日給藥1次，共用藥9 d，d 10觀察康復(fù)情況。

1．2．3HrBN對創(chuàng)傷潰瘍模型小鼠作用研究 昆明小鼠150只，♀♂各半，隨機(jī)分為模型組、百多邦組、HrBN低、中、高濃度組（40、80、160 g·L－1），每組30只。采用全層切除小鼠模型，造模3 h后于造模創(chuàng)傷處給藥1次，分別涂抹溶劑0.3 mL，百多邦約0.2 g，HrBN低、中、高濃度藥液0.3 mL，造模次日記錄為給藥d 1，d 1～3每日給藥2次，d 4～9每日給藥1次，共給藥9 d，d 10觀察各組創(chuàng)口修復(fù)情況。

1．2．4皮膚樣本組織切片觀察 各組小鼠于d 10觀察康復(fù)情況后處死，取造模處皮膚肉芽組織或瘢痕組織（約1 cm2）于包埋盒中，用質(zhì)量濃度為40 g ·L－1多聚甲醛固定24 h，后用0.1 mol·L－1的PBS液沖洗浸泡，沖水后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、鏡檢，分別在×4倍和×40倍顯微鏡下攝取圖像，觀察皮膚組織樣本縱切面結(jié)構(gòu)。

1．2．5朱槿花苞提取物抗菌作用研究 采用肉湯常量稀釋法測定各提取物對兩種菌株的最低抑菌濃度（MIC）。實(shí)驗(yàn)組：HrBA、HrBN、HrBE、AB-8柱水段，使用體積分?jǐn)?shù)0.05的DMSO溶劑配制600 g· L－1藥液，取AB-8柱體積分?jǐn)?shù)0.3乙醇段、0.6乙醇段配制160 g·L－1藥液，取朱槿花苞鮮藥搗爛得汁液（原汁液），加紅糖搗爛得紅糖原汁液。對照組：體積分?jǐn)?shù)0.05的DMSO溶劑，紅糖對照組：600 g· L－1紅糖溶液。陽性藥組：苯唑西林250 mg·L－1和頭孢他啶4 000 mg·L－1。各組藥液均經(jīng)0.22 μm無菌濾器過濾后使用。向96孔板中分別加入肉湯培養(yǎng)液、菌液和供試藥物，從1號(hào)孔至10號(hào)孔依次進(jìn)行倍比稀釋，將96孔板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中，18 h后觀察。

分別取兩菌株接種于MH瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上均勻放置4個(gè)牛津杯，杯中注入20 μL各提取物藥液。HrBN、HrBE、AB-8柱體積分?jǐn)?shù)0.3醇段、0.6醇段藥液，濃度均為100 g·L－1，且各組藥液均經(jīng)0.22 μm無菌濾器過濾，將培養(yǎng)皿放置35℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，20 h后觀察。

1．2．6朱槿花苞提取物對免疫細(xì)胞碳粒廓清作用研究 昆明小鼠60只，♀♂各半，隨機(jī)分為對照組（CMC混懸液）；鹽酸左旋咪唑組（0.03 mg·g－1，濃度1.5 g·L－1）；HrBA低劑量（0.3 mg·g－1，濃度20 g·L－1），高劑量（0.6 mg·g－1，濃度40 g· L－1）；HrBN低劑量（0.3 mg·g－1，濃度20 g· L－1），高劑量（0.6 mg·g－1，濃度40 g·L－1）。以上各組均灌胃給藥，每天1次，每次0.015 mL· g－1，連續(xù)給藥10 d，末次給藥后0.5 h，每只小鼠尾靜脈注射經(jīng)稀釋的碳粒墨汁0.01 mL·g－1，于5min（t1）和15 min（t2）后分別從眼眶靜脈叢取血20 μL，加到1.5 mL質(zhì)量濃度1 g·L－1Na2CO3溶液中震蕩搖勻，使用酶標(biāo)儀在680 nm下檢測OD（OD1和OD2）值。小鼠處死后摘取肝、脾，測量肝、脾重，按照公式K＝（logOD1－logOD2）／（t2－t1），α＝體重／肝、脾重×K1／3，計(jì)算廓清指數(shù)k和吞噬指數(shù)α。

2　結(jié)果

2．1HrBN對癤癰模型小鼠的影響 肉眼觀察結(jié)果顯示，對比模型組，HrBN可明顯促進(jìn)造模處癤癰康復(fù)，見Fig 3A。組織切片鏡檢顯示，對比模型組，HrBN可有效減小癤癰創(chuàng)口寬度和加速壞死組織清除，且×4倍鏡下觀察造模處修復(fù)良好，見Fig 3B?！?0倍鏡HrBN組可見較多新生肉芽組織、新生毛細(xì)血管和較少的炎癥細(xì)胞和壞死組織等，見Fig 3C。采用藥效等級評分法［9］，分為康復(fù)、有效、進(jìn)步和無效4級，給藥9 d后評分結(jié)果顯示，HrBN組分?jǐn)?shù)明顯高于模型組（P＝0.014，P＜0.05），結(jié)果見Fig 1。

Fig 1 Score of boils and carbuncles recovery

2．2HrBN對全層切除模型小鼠的影響 肉眼觀察結(jié)果顯示，對比模型組，實(shí)驗(yàn)組可明顯促進(jìn)皮膚修復(fù)，見Fig 4A。組織切片鏡檢結(jié)果顯示，HrBN可明顯減小創(chuàng)口的深度和寬度，×4倍鏡檢圖像見Fig 4B。×40倍鏡檢可見HrBN組上皮組織修復(fù)完好以及可見新生肉芽組織和毛細(xì)血管等，見Fig 4C。給藥9 d后各組進(jìn)行藥效等級評分［9］，HrBN組藥效評分分?jǐn)?shù)均高于模型組，低、中、高3濃度實(shí)驗(yàn)組藥效分?jǐn)?shù)呈遞增趨勢，3組間差異具有顯著性（P＝0.039，P＜0.05），其中高濃度組藥效分?jǐn)?shù)明顯高于低濃度組（P＜0.05）。模型組、百多邦組、HrBN低、中、高濃度組康復(fù)率分別為7.14%、24.14%、20%、30%、46.67%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)P＝0.013，各組康復(fù)率差異有顯著性，且藥效隨藥物濃度增加具有量效關(guān)系，結(jié)果見Fig 2。

Fig 2 HrBN chart of dose-recovery rate

2．3朱槿花苞提取物對金葡菌和綠膿桿菌的影響

Tab 1 Results of anti-staphylococcus aureus

Tab 2 Results of anti-pseudomonas aeruginosa

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AB-8柱體積分?jǐn)?shù)0.3乙醇段對金黃色葡萄球菌的抑制作用效果明顯，其MIC相對較小，結(jié)果見Tab 1。HrBE對銅綠假單胞菌的抑制作用最為明顯，其MIC相對較小，結(jié)果見Tab 2。金葡菌抑菌圈結(jié)果顯示：①HrBN抑菌圈較小，②HrBE無明顯抑菌圈，③AB-8柱體積分?jǐn)?shù)0.3乙醇段抑菌圈明顯，④AB-8柱體積分?jǐn)?shù)0.6乙醇段抑菌圈明顯，但小于③。抑菌圈圖見Fig 5A。銅綠假單胞菌抑菌圈結(jié)果顯示：（A）HrBN可見抑菌圈，（B）正丁醇水部位未見抑菌圈，（C）HrBE抑菌圈明顯，（D）AB-8柱體積分?jǐn)?shù)0.6乙醇段可見抑菌圈，但小于（C）。抑菌圈圖見Fig 5B。

2．4正丁醇萃取物對巨噬細(xì)胞碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，HrBN在300、600 g·L－1濃度下可明顯提高吞噬細(xì)胞碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α（P＜0.05）。HrBA 在300、600 g·L－1濃度下對比對照組，可提高吞噬細(xì)胞碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α（P＞0.05）。結(jié)果見Tab 3。

Tab 3 Results of carbon clearance test（±s，n＝10）

Tab 3 Results of carbon clearance test（±s，n＝10）

*P＜0.05 vs control

Group　Weight index／mg·g－1　　α　K／10－2Control　2．511±0．618　4．378±1．541　1．691±1．238 Positive control　2．777±0．331　4．548±0．8797　2．059±1．029 HrBA 300 g·L－12．673±0．540　5．263±0．5027　2．444±1．032 HrBA 600 g·L－12．524±0．449　5．011±0．6617　2．561±1．001 HrBN 300 g·L－12．587±0．614　5．455±0．8843*　2．623±0．9862*HrBN 600 g·L－12．916±0．337　5．469±0．6325*　2．712±0．5241*

3　討論

癤癰為皮膚及其附屬器官感染細(xì)菌而引起的病癥，潰瘍?yōu)槠つw或黏膜組織缺失或潰爛病癥，均為常見皮膚疾癥，臨床多使用抗生素如百多邦等防治感染。相對西醫(yī)療法，中醫(yī)藥發(fā)揮了相對的優(yōu)勢，中藥除了防治感染還能夠控制炎癥、疼痛及促進(jìn)組織再生等?！吨芏Y》有“瘍醫(yī)下士八人，掌腫瘍、潰瘍之祝藥覿殺之齊?！毖芯匡@示，部分中藥及其外用制劑能夠有效緩解模型動(dòng)物創(chuàng)傷處的炎癥和疼痛［10］。且有研究者總結(jié)不少單味中藥同時(shí)具有抗菌消炎、去腐生肌的作用［11］。

Fig 4 Pictures of full-thickness loss model mice

Fig 5 Pictures of inhibition zone

癤癰癥研究多采用皮內(nèi)注射一定濃度菌液而形成的動(dòng)物模型，此模型重現(xiàn)了由細(xì)菌感染所致的皮膚癤癰癥，但是其所含菌種較為固定和單一，與自然形成的癤癰有一定差異。且在預(yù)試實(shí)驗(yàn)中，采用此動(dòng)物模型出現(xiàn)了若干問題，一是造模12～24 h后未出現(xiàn)明顯癤癰膿腫，二是造模12 h后小鼠出現(xiàn)大量死亡。相對而言，本實(shí)驗(yàn)使用的化學(xué)合劑刺激引起的癤癰模型，不僅較好模擬了癤癰膿腫，并且降低了死亡率，所感染的菌種與自然形成癤癰相似，均不固定。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的全層切除潰瘍模型，此模型可用于研究皮膚組織的再生和修復(fù)，本實(shí)驗(yàn)的操作環(huán)境均為自然環(huán)境，因此較好地模擬了伴有一定感染的創(chuàng)傷潰瘍，且可同時(shí)考察藥物的皮膚修復(fù)作用。

中藥發(fā)揮療效往往是從多個(gè)方面共同達(dá)到治愈疾病的目標(biāo)，且1種藥材尤其花類藥材可同時(shí)具有多個(gè)活性，如常見藥材玫瑰花除美白、抗氧化之外，其中的多酚類物質(zhì)還能夠有效地對抗疲勞［12］?，F(xiàn)今中藥外用作用研究已涵蓋抗菌、促進(jìn)血液循環(huán)、增強(qiáng)免疫功能等多方面［11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AB-8樹脂體積分?jǐn)?shù)0．3醇、0．6醇段、HrBN、以及HrBE具有較好抗菌活性，HrBN的MIC大于AB-8樹脂體積分?jǐn)?shù)0．3醇段，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮最佳療效的卻是正丁醇萃取物。由此可知抗菌作用可能是其作用機(jī)制之一，但不是主要作用機(jī)制。碳粒廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HrBN在低、高劑量下均提高了巨噬細(xì)胞廓清能力，證明朱槿花苞免疫增強(qiáng)作用也可能是其作用機(jī)制之一，尤其是生肌、修復(fù)方面。然而，朱槿花苞具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，提取物HrBN在實(shí)驗(yàn)d 3可見超過半數(shù)的小鼠造模處結(jié)痂，于d 5，可見約3／4小鼠造模處組織生長良好，部分小鼠可見愈合瘢痕。而模型組則在d 5和d 8才分別達(dá)到上述康復(fù)程度。綜上所述，朱槿花苞提取物促進(jìn)皮膚癤癰潰瘍修復(fù)的作用不僅補(bǔ)充了朱槿花系列研究，同時(shí)對于后期研發(fā)和成為功能型產(chǎn)品奠定了一定的基礎(chǔ)。

（致謝：鳴謝中國中醫(yī)科學(xué)院中藥所林娜教授在實(shí)驗(yàn)過程中的支持與幫助。）

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Research in skin healing and repair function and mechanism of Hibiscus rosa-sinensis Linn bud extract

JIANG Ji-yang，XU Han，BAI Xue-ting，CHENG He，LING Yan-ling，LING Zhen，CHEN Yi-cun，SHI Gang-gang
（Pharmacology Division of Shantou University，Shantou Guangdong 515041，China）

Abstract：Aim To test the skin healing and repairing efficacy and the mechanism of Hibiscus rosa-sinensis L bud extract by using the animal models．Methods KM mice were randomly divided into three groups：the model group，the positive control group，and the n-bu-tyl alcohol extract（HrBN）group．Using the boils and carbuncles model，the healing condition of all the animals were observed．KM mice were kept in thebook=1091,ebook=60SPF condition room and divided into five groups：the model group，the positive control group，and the low，middle，high dose groups．Using the full-thickness loss model，the repairing results of all the mice were ob-served．Through the antimicrobial test，the results of MIC and inhibition zone were obtained．The carbon clearance test was used to collect the blood at the time 5min and 15min，and get the liver and spleen，and the results of K and α were obtained．Results In vivo ex-periments showed there was significant difference be-tween groups；the HrBN extract had the outstanding ef-ficacy in healing and repairing skin boils and full-thickness loss models．It had higher recovery rate than other ethanol extract，such as ethyl acetate extract and chloroform extract．In vitro experiments showed that the HrBN extract，ethyl acetate extract（HrBE），AB-8 macroporous resin 30%alcohol part and 60%alcohol part had obvious antimicrobial efficacy．The carbon clearance test showed HrBN had a good effect in im-proving immune function，and it can increase the K and α．Conclusion HrBN in animal models exerts good skin healing and repairing efficacy，which might be related to its antibacterial activity and immunologic enhancement function．

Key words：Hibiscus rosa-sinensis Linn bud；n-butyl alcohol extract；boils and carbuncles model；full-thick-ness loss model；antimicrobial；carbon clearance test

作者簡介：姜霽洋（1990－），女，碩士，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：tianhexingji＠126．com；石剛剛（1957－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：ggshi＠stu．edu．cn

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金－團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No 9351503102000001）；中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)資金

收稿日期：2015－05－18，修回日期：2015－06－14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1085－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．012