鈍化NF-κB的活化對(duì)免疫性肝損傷大鼠CYP2E1的影響

賈金雪，秦金東，李學(xué)峰，康曉琳，高洪波，薛永志

（包頭醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060）

鈍化NF-κB的活化對(duì)免疫性肝損傷大鼠CYP2E1的影響

賈金雪，秦金東，李學(xué)峰，康曉琳，高洪波，薛永志

（包頭醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R322.47；R345.99；R575.02；R593.02；R977.3；R977.6

摘要：目的 研究核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）在免疫性肝損傷大鼠模型中的作用及對(duì)細(xì)胞色素P450總含量，亞型2E1（cytochrome P450 2E1，CYP2E1）表達(dá)、代謝活力的影響。方法 采用尾靜脈注射BCG（125 mg ·kg－1）14d制備免疫性肝損傷大鼠模型。采用雙光束紫外可見分光光度法測(cè)定肝勻漿中CYP450總含量，通過(guò)肝臟組織HE染色和血清中ALT和AST水平測(cè)定觀察大鼠肝損傷情況。采用Western blot方法檢測(cè)大鼠肝組織中CYP2E1蛋白表達(dá)；通過(guò)HPLC法檢測(cè)CYP2E1的探針?biāo)幬锫冗蛏匙诘难獫{藥物濃度，從而反映特異性代謝酶CYP2E1的代謝活力。結(jié)果 大鼠尾靜脈注射BCG 14 d后，可引起肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝重、脾重增加，血清轉(zhuǎn)氨酶ALT及AST水平明顯升高，CYP450總含量降低，CYP2E1表達(dá)和代謝活力明顯降低。采用吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）鈍化NF-κB活化，可抑制CYP450總含量的降低，減緩CYP2E1蛋白表達(dá)和代謝活力的下調(diào)。結(jié)論 免疫損傷刺激明顯下調(diào)CYP2E1，鈍化NF-κB活化可明顯抑制免疫性肝損傷大鼠肝組織中CYP2E1的下調(diào)，NF-κB可能參與CYP2E1下調(diào)機(jī)制。

關(guān)鍵詞：肝損傷；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；吡咯烷二硫氨基甲酸；細(xì)胞色素P450 2E1；大鼠；細(xì)胞色素P450；卡介苗

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．013．html

病毒感染導(dǎo)致的免疫性肝損傷和致癌物質(zhì)導(dǎo)致的DNA突變是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要機(jī)制［1］。細(xì)胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，CYP2E1）是主要在肝臟表達(dá)的細(xì)胞色素P450酶重要的亞型，通過(guò)氧化前致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)，促進(jìn)肝癌的形成。有研究發(fā)現(xiàn)［2］，肝炎以及肝癌發(fā)病過(guò)程中CYP2E1下調(diào)，參與病理過(guò)程。以往關(guān)于CYP2E1的研究主要集中在酒精性肝損傷過(guò)程中氧化應(yīng)激損傷［3－4］，但在病毒性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌等免疫性肝損傷過(guò)程中的作用和下調(diào)機(jī)制尚未清楚。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)及細(xì)胞存活的重要因子［5］，也涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。炎癥和組織損傷過(guò)程中，NF-κB激活，調(diào)控大量下游炎性細(xì)胞因子，可能參與損傷過(guò)程。吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）可以通過(guò)抑制IκB的磷酸化從而發(fā)揮抑制NF-κB的作用［6］，因此可以阻止NF-κB向核內(nèi)移位，減少下游細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究以尾靜脈注射BCG制備大鼠免疫性肝損傷模型，觀察CYP2E1的代謝活性、蛋白表達(dá)有何變化，采用PDTC抑制NF-κB活化，觀察對(duì)CYP2E1氧化代謝活力和肝功能的影響，深入探討NF-κB在免疫性肝損傷中的作用及其作用環(huán)節(jié)，為免疫性肝損傷藥物治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)♂SD大鼠，內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量（250±20）g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（蒙）2005－0001。BCG凍干粉（每支60 mg，1 g·L－1），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：2013－01。PDTC，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：851002。組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、CYP2E1兔抗大鼠多克隆抗體、β-actin鼠多克隆抗體，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1．2主要儀器 高效液相色譜儀，Thermo Finnigon公司生產(chǎn)；DF-D型恒壓恒流電泳儀，北京市六一儀器廠；DYY-TB型轉(zhuǎn)移電泳儀，北京市六一儀器廠；Sartorius分析天平，北京塞多利斯儀器有限公司；形態(tài)分析系統(tǒng)，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；7600－020型自動(dòng)生化分析儀，日本；UV765型紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1．3動(dòng)物分組及免疫性肝損傷動(dòng)物模型的制備SD大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，稱重、編號(hào)后，按隨機(jī)數(shù)字表分為Control、BCG、BCG＋PDTC（50 mg· kg－1）、BCG＋PDTC（100 mg·kg－1）、BCG＋PDTC （200 mg·kg－1）組，每組12只。BCG、BCG＋PDTC（小、中、大）組尾靜脈注射BCG 125 mg·kg－114 d制備免疫性肝損傷大鼠模型，Control組尾靜脈注射等體積NS。采用NF-κB特異性抑制劑對(duì)BCG＋PDTC（小、中、大）組進(jìn)行干預(yù)（d 11、12、13的16時(shí)腹腔注射PDTC各1次，劑量分別為50、100、200 mg ·kg－1）。d 14用于HPLC方法測(cè)定CYP2E1代謝活力實(shí)驗(yàn)，隨后將大鼠頸椎脫臼處死，迅速剖取肝臟、脾臟，稱重。將部分肝組織浸泡于事先配好的甲醛酒精（甲醛∶酒精＝1∶9）固定液中，做石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。稱取部分肝組織用于CYP450總含量測(cè)定，另稱取部分肝組織凍存用于Western blot檢測(cè)。

1．4高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定大鼠CYP 2E1代謝活性 實(shí)驗(yàn)d 14，Control、BCG、BCG＋PDTC （100 mg·kg－1）3組大鼠單次ig氯唑沙宗50 mg· kg－1，分別于給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6 h從眼內(nèi)眥靜脈叢采血，每次采血0.2 mL于肝素化試管中，3 000 r·min－1離心5 min，取血漿，保存在－20℃冰箱后待測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)［3］方法，測(cè)定血漿中CYP2E1探針?biāo)幬锫冗蛏匙跐舛鹊慕?jīng)時(shí)變化。用藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件3P97對(duì)血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得出AUC、T1／2、Cmax、Tmax、Ke等各項(xiàng)藥代參數(shù)。通過(guò)測(cè)定血漿中探針?biāo)幬锫冗蛏匙谒帲瓡r(shí)曲線及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化，檢測(cè)CYP2E1代謝活性。

1．5大鼠肝組織勻漿中CYP450全酶含量的測(cè)定BCG刺激2周后（d 14晨），各組動(dòng)物均取定量12只肝臟制備肝勻漿樣本，按1∶4比例向肝組織勻漿樣本中加入預(yù)冷的0.15 mol·L－1Tris-HCl緩沖液，通入CO氣體2 min，聯(lián)二亞硫酸鈉還原樣本后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定490 nm、450 nm處光密度差值。采用BCA法測(cè)定肝勻漿樣本中蛋白的含量，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每mg蛋白中CYP450全酶含量。

1．6肝組織CYP2E1免疫印跡分析（Western blot） 肝組織稱重后，勻漿制備蛋白抽提物，用BCA法作蛋白定量，SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，放入0.02 mol·L－1TBS緩沖液配制的5%脫脂奶粉和1%的BSA混合的封閉液內(nèi)，搖床搖動(dòng)，室溫封閉2 h，漂洗，CYP2E1兔多克隆抗體、β-actin鼠多克隆抗體雜交，加二抗，顯色，X線片曝光，用紫外透視成像系統(tǒng)對(duì)X線片進(jìn)行光密度分析。

1．7血清肝功能谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)d 14，取上述各組大鼠眶靜脈叢取血，靜置30 min，3 500 r·min－1離心5 min分離血清，使用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2　結(jié)果

2．1PDTC對(duì)BCG誘導(dǎo)的免疫性肝損傷大鼠肝臟病理組織學(xué)、肝重／體重、脾重／體重、血清轉(zhuǎn)氨酶含量的影響 尾靜脈注射BCG 5～7 d后，大鼠攻擊性增強(qiáng)，激惹易怒，相互撕打，嚙咬；2周后，光鏡下觀察到肝實(shí)質(zhì)及匯管區(qū)周圍有大量單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，形成大小不等且彌漫性分布的大量肉芽腫團(tuán)塊為特征的免疫性肝損傷，見Fig 1B；肝臟、脾臟重量明顯增大（P＜0.05）；血清AST、ALT均升高（P ＜0.01）。給予PDTC進(jìn)行干預(yù)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)團(tuán)塊減少，見Fig 1C；可降低肝臟、脾臟重量的增加（P＜0.05）；降低AST、ALT的升高（P＜0.05），見Tab 1。

Tab 1 Effect of PDTC on liver and spleen weight relative to body weight ratio（%），serum levels of ALT and AST in BCG induced hepatic injury rats in vivo（±s，n＝12）

Tab 1 Effect of PDTC on liver and spleen weight relative to body weight ratio（%），serum levels of ALT and AST in BCG induced hepatic injury rats in vivo（±s，n＝12）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0．01 vs BCG

Group　Liver weight／body weight／%　Spleen weight／body weight／%　ALT／U·L－1　AST／U·L－1Control　5．0±0．6　0．4±0．0　65．2±8．6　85．8±9．1 BCG　8．5±0．5*　1．2±0．2**　195．8±12．3**　150．6±16．3**BCD＋PDTC 50 mg·kg－1　8．1±1．1*　1．0±0．2**　172．3±15．4**　143．8±14．2**BCG＋PDTC 100 mg·kg－1　7．8±0．5*＃　0．8±0．1*?！?45．9±13．7*?！?32．5±14．5*＃BCG＋PDTC 200 mg·kg－1　7．6±0．6*＃＃　0．7±0．1*＃?！?10．1±12．7*＃?！?21．5±12．4*＃＃

Fig 1 Pathological features in liver（HE×200）

2．2PDTC對(duì)BCG免疫刺激的大鼠肝勻漿樣本中CYP450總含量的影響 與空白對(duì)照組相比，尾靜脈注射BCG 14 d后，肝臟CYP450全酶含量明顯減少（P＜0.01）。在BCG刺激的基礎(chǔ)上給予PDTC進(jìn)行干預(yù)，則可劑量依賴性地減緩肝臟CYP450全酶含量減少，見Tab 2。

Tab 2 Effect of PDTC on CYP450 total content in BCG stimulated rats in homogenate sample（±s，n＝12）

Tab 2 Effect of PDTC on CYP450 total content in BCG stimulated rats in homogenate sample（±s，n＝12）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs BCG

Group　CYP450 content／μmol·g－1Pro Control　1．68±0．35 BCG　0．72±0．16**BCD＋PDTC 50 mg·kg－1　0．77±0．14*BCG＋PDTC 100 mg·kg－1　0．95±0．12*BCG＋PDTC 200 mg·kg－1　1．32±0．25＃

2．3各組大鼠CYP2E1代謝活力的變化 Control、BCG、BCG＋PDTC（100 mg·kg－1）3組大鼠經(jīng)口單次給予經(jīng)CYP2E1代謝的探針?biāo)幬锫冗蛏匙冢?0 mg ·kg－1），經(jīng)HPLC測(cè)得大鼠血漿中氯唑沙宗血藥濃度的經(jīng)時(shí)變化，BCG組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血藥濃度均高于Control組，BCG＋PDTC組0.5、1 h時(shí)間點(diǎn)血藥濃度低于BCG組（P＜0.05），見Fig 2。經(jīng)3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件計(jì)算各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)行房室擬合，符合一室模型。3組表觀分布容積V（c）相近，BCG組Ke、Tmax、CL均小于Control組，Cmax、AUC、T1／2均高于Control組（P＜0.05）。BCG＋PDTC組CL高于BCG組，Cmax、AUC均低于BCG組（P＜0.05），如Tab 3所示。

Fig 2 Plasma chlorzoxazone levels in all groups

Tab 3 Plasma chlorzoxazone pharmacokinetic levels in all groups

2．4各組大鼠CYP2E1表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果可見，內(nèi)參β-actin各條帶密度均一，提示蛋白定量基本準(zhǔn)確，各組蛋白上樣量基本一致。在Con-trol組肝臟組織中有CYP2E1的基礎(chǔ)表達(dá)，BCG組中CYP2E1表達(dá)明顯減少，給予PDTC干預(yù)，可使CYP2E1表達(dá)恢復(fù)，見Fig 3。

Fig 3 CYP2E1 expression in all groups

3　討論

免疫性肝損傷是因免疫應(yīng)答所導(dǎo)致的，免疫應(yīng)答在清除病毒的同時(shí)，肝細(xì)胞也受到損傷，是病毒性肝炎、肝硬化最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌的重要發(fā)病機(jī)制之一［6］。經(jīng)尾靜脈注射BCG 2周后，觀察到肝實(shí)質(zhì)及匯管區(qū)周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝脾腫大及肝功受損，表明免疫性肝損傷大鼠模型成功建立，與人類病毒性肝炎的病理及血生化改變頗為一致。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，BCG免疫損傷刺激導(dǎo)致大鼠肝臟CYP450酶總含量降低，給予工具藥抑制NF-κB激活，可減緩肝藥酶全酶的含量降低。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，免疫損傷過(guò)程中，占CYP450酶系7%左右的CYP2E1表達(dá)和代謝活力下調(diào)，鈍化NF-κB激活可抑制其下調(diào)，推測(cè)CYP2E1的下調(diào)可能與NF-κB調(diào)節(jié)有關(guān)。BCG免疫刺激可激活肝內(nèi)的巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞，KC），誘生大量?jī)?nèi)源性的炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致免疫性肝損傷，上述炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或肝KC表達(dá)iNOS，繼而生成大量NO。NO作用于CYP2E1的鐵蛋白中心，使CYP2E1破壞增加，使其下調(diào)［5，7］。NF-κB能與許多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因啟動(dòng)子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。免疫性肝損傷的誘因很多［8］，最常見的是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染肝細(xì)胞后發(fā)生肝細(xì)胞病變后，KC可以被細(xì)胞變性、壞死釋放的脂質(zhì)過(guò)氧化物、細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)激活而分泌大量的細(xì)胞因子、趨化因子等促炎介質(zhì)，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、NO、iNOS及活性氧等激活，趨化中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，這些物質(zhì)可啟動(dòng)或加劇肝臟炎癥反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化并降解，NF-κB移位進(jìn)入胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性。

本室以往研究表明，免疫損傷性刺激導(dǎo)致iNOS大量誘生，NO合成增加?；钚匝酰≧OS）可能是所有刺激物激活NF-κB共同機(jī)制和LPS誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)的核心，ROS增殖能減少巰基來(lái)增加細(xì)胞被氧化比例，調(diào)節(jié)NF-κB激活，NF-κB可以增加氧化信號(hào)通路的敏感性，導(dǎo)致基因產(chǎn)物的增多［9－10］。iN-OS既是NF-κB的激活物，同時(shí)，又受到NF-κB的調(diào)控，抑制NF-κB的活化可以減少NO的誘生，減緩CYP2E1的下調(diào)。有關(guān)免疫性肝損傷過(guò)程中CYP2E1代謝活力的調(diào)控是否經(jīng)由NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可否通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控代謝酶活力干預(yù)損傷過(guò)程有待進(jìn)一步深入研究。

（致謝：本研究在包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)中心藥物代謝研究室和藥理學(xué)教研室完成，得到國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目等資助，在此表示感謝?。?/p>

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Effect of blunting NF kappa B activation on CYP2E1 in immunological liver injury rats

JIA Jin-xue，QIN Jin-dong，LI Xue-feng，KANG Xiao-lin，GAO Hong-bo，XUE Yong-zhi
（Dept of Pharmacology，Baotou Medical College，Baotou Inner Mongolia 014060，China）

Abstract：Aim To determine the function of nuclear factor-κB（NF-κB）in immunological liver injury of rat model and its effect on CYP2E1 expression，content and metabolic activity．Methods The immunological liver injury rat model was prepared by injection of Ba-cillus Calmette Guérin（BCG，125 mg·kg－1）for 14 days．The hepatic tissue injury was revealed by hema-toxylin and eosin（HE）method and serum concentra-tion of alanine aminotransferase（ALT），aspartate ami-notransferase（AST）respectively．CYP450 total con-tent in hepatic homogenate was determined by spectro-photography．The expression of CYP2E1 protein was detected by Western blot analysis．The enzyme kinetics of CYP2E1 probe drug chlorzoxazone was evaluated by high-performance liquid chromatography（HPLC）as-say．Results The results showed that BCG-pretreat- ment（125 mg·kg－1）significantly increased the weight of liver and spleen，serum levels of ALT and AST（P＜0.01），and decreased CYP2E1 expression，content and metabolic activity（P＜0.05）．Adminis-tration of ammoniumpyrrolidine dithiocarbamate （PDTC）（50，100，200 mg·kg－1）reversed the a-bove hepatic injury stimulated by BCG in vivo．Moreo-ver，PDTC dose-dependently inhibited the down regu-lation of CYP2E1（P＜0.05）．Conclusion Passiva-tion of NF-κB can inhibit the down regulation of CYP2E1 in liver tissue of immunological liver injury rats；NF-κB may be involved in CYP2E1 down-regula-tion．

Key words：liver injury；NF-κB；PDTC；CYP2E1；rat；cytochrome P450；Bacillus Calmette-Guerin

作者簡(jiǎn)介：賈金雪（1991－），女，碩士生，研究方向：藥物代謝與肝臟分子藥理學(xué)，E-mail：sxk7008＠163．com；薛永志（1968－），男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物代謝與肝臟分子藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：xyzhxyzh68＠sohu．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 30760289，81460567）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 2009MS1104，2014MS0813）；內(nèi)蒙古教育廳資助項(xiàng)目（No NJ03148，NJZY13244）；內(nèi)蒙古衛(wèi)生廳項(xiàng)目（No 201302099）

收稿日期：2015－04－07，修回日期：2015－05－08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1076－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．010