EZH2對HSC-T6細胞增殖活化的影響及其部分機制研究

陳小霞，謝 娟，黃 成，孟曉明，李 俊

（安徽醫(yī)科大學藥學院，安徽醫(yī)科大學肝病研究所，安徽省高校產業(yè)共性技術研究院，安徽合肥 230032）

EZH2對HSC-T6細胞增殖活化的影響及其部分機制研究

陳小霞，謝 娟，黃 成，孟曉明，李 俊

（安徽醫(yī)科大學藥學院，安徽醫(yī)科大學肝病研究所，安徽省高校產業(yè)共性技術研究院，安徽合肥 230032）

中國圖書分類號：R-332；R322.47；R329.24；R341；R575.202.2

摘要：目的 探討Zeste基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）表達沉默對大鼠肝星狀細胞HSC-T6細胞增殖活化的影響，及其部分調控機制。方法 應用EZH2的抑制劑DZNep（3-Deazaneplanocin A）作用于TGF-β1誘導活化的HSC-T6細胞，采用Western blot法檢測蛋白EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA的表達；根據EZH2的堿基序列設計并合成小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），通過脂質體LipofectamineTM2000轉染到HSC-T6細胞內，應用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測HSC-T6細胞的增殖變化，Western blot法檢測蛋白EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA的表達。結果 將DZNep加入TGF-β1誘導活化的HSC-T6細胞后，EZH2蛋白水平明顯降低，同時p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白水平亦明顯降低；將EZH2-siRNA轉染活化的HSC-T6細胞內，HSC-T6細胞的增殖可明顯被抑制，同時EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白水平亦明顯降低。結論 抑制EZH2的表達可明顯抑制HSC-T6細胞的增殖活化，EZH2可能是潛在的治療肝纖維化的靶點。

關鍵詞：組蛋白甲基化；肝星狀細胞；Zeste基因增強子同源物2；DZNep；肝纖維化；p-ERK；p-AKT；α平滑肌肌動蛋白

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．010．html

肝纖維化是持續(xù)性肝臟損傷的共同病理改變過程，主要表現為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在肝臟中的大量沉積，其持續(xù)發(fā)展可形成肝硬化和肝細胞癌［1］。肝纖維化的形成機制目前尚不清楚，研究表明肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的增殖活化是肝纖維化形成的關鍵，抑制HSC的增殖活化成為防治肝纖維化的重點［2］。有文獻報道，Zeste基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）在纖維化形成中起重要作用［3］。肝纖維化形成過程中，MAPK／ERK和PI3K／AKT通路被激活并起重要作用。研究發(fā)現，EZH2能夠激活MAPK／ERK和PI3K／AKT通路，從而引起疾病［4］。本研究擬應用EZH2的抑制劑DZNep和小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制EZH2的表達，考察其對HSC增殖活化的調控作用，探究其調控機制，以期為肝纖維化的防治提供新的靶點。

1　材料

1．1細胞株 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1．2試劑與儀器 DZNep購于Selleckchem公司；TGF-β1購于Peprotech公司；噻唑藍MTT購于Sig-ma公司；DMSO購于Sigma公司；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基為Hyclone公司產品；胎牛血清購于杭州四季青公司；山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術有限公司；脂質體Lipofectami-neTM2000、Opti-MEM購于Invitrogen公司；EZH2、p-ERK、ERK、p-AKT和AKT抗體購于Cell Signaling公司；α-SMA抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；β-actin抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；酶標儀（bio-tekEL）。

2　方法

2．1HSC-T6細胞的培養(yǎng) 應用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下進行細胞培養(yǎng)，待細胞長至70%～80%密度時進行細胞傳代。

2．2DZNep的應用 加入DZNep 24 h前，將細胞傳代至6孔培養(yǎng)板，每孔2×105細胞。實驗分正常組、應用TGF-β1刺激的模型組、TGF-β1刺激并加入DZNep的恢復組。正常組不做任何處理；模型組加入TGF-β1刺激終濃度為10 μg·L－1，TGF-β1作用于細胞的時間為48 h；恢復組加入TGF-β1刺激終濃度為10 μg·L－1，并加入DZNep刺激終濃度為1 μmol·L－1，DZNep作用于細胞的時間為24 h。

2．3siRNA的合成 根據siRNA設計原則，設計針對EZH2基因的siRNA序列，在GenBank表達序列標簽（EST）數據庫應用BLAST檢索，并確認所設計siRNA序列的唯一性，靶向目的基因EZH2的序列設計的兩條鏈，正義鏈：5′-GGGCAUCUUUAU-CAAAGAUTT-3′；反義鏈：5′-AUCUUUGAUAAAGAU GCCCTT-3′。同樣方法構建陰性對照組的兩條鏈，正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，與任何編碼序列無同源性，由吉瑪制藥有限公司合成有效siRNA干粉制劑。

細胞培養(yǎng)及siRNA轉染HSC-T6細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)。轉染24 h前，傳代至6孔培養(yǎng)板，每孔2×105細胞。實驗分正常組、模型組、陰性對照組和EZH2-siRNA實驗組。正常組不做任何處理；模型組加入TGF-β1；陰性對照組轉染FAM標記的陰性對照siR-NA并加入TGF-β1；實驗組轉染EZH2-siRNA并加入TGF-β1。用Opti-MEM和脂質體作為轉染試劑進行轉染，使siRNA終濃度均為100 pmol·L－1，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱轉染6 h后，每組加入完全培養(yǎng)基含TGF-β1使刺激終濃度為10 μg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細胞。采用熒光倒置顯微鏡觀察各組轉染后的細胞形態(tài)并判斷轉染效果。

2．4細胞增殖實驗 以MTT法檢測HSC-T6細胞的增殖，分組同上。將培養(yǎng)的HSC-T6細胞以10%胎牛血清的DMEM制備成1×108·L－1的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，過夜，待細胞貼壁后進行細胞轉染，轉染后6 h換液，每孔加入完全培養(yǎng)基200 μL含TGF-β1使刺激終濃度為10 μg· L－1，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，然后每孔加0.5%MTT貯存液20 μL繼續(xù)孵育4 h，最后棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解細胞內結晶，置于恒溫震蕩器上震搖10 min，應用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度值，以空白對照組作為對照組，其細胞存活率為100%，其余各組按：存活率／%＝［（各實驗組吸光度值-本底吸光度值）／（對照組吸光度值－本底吸光度值）］×100%。

2．5Western blot檢測EZH2、p-ERK、p-AKT、α-SMA蛋白表達 細胞的培養(yǎng)、分組、處理同上。DZNep作用24 h或者轉染EZH2-siRNA 48 h后，分別提取細胞總蛋白，應用BCA法測定蛋白濃度。應用10%SDS-PAGE凝膠進行電泳，在200 mA恒定電流下應用PVDF膜進行轉膜，TBST洗膜后，使用5%牛奶封閉非特異性結合位點，TBST洗膜后，在4℃于一抗（1∶500）中孵育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠或抗兔二抗（1∶10 000）室溫中孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光劑反應20 s，電腦顯影成像，實驗重復3次或以上。

2．6統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數據以±s表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

Fig 1 Protein expression of EZH2（A），p-ERK，p-AKT（B）and α-SMA（C）detected by Western blot after application of DZNep

3　結果

3．1Western blot法檢測應用DZNep后HSC-T6細胞中EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白表達變化 加入TGF-β1的模型組EZH2蛋白表達水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性（P＜0.01），加入TGF-β1和DZNep的恢復組EZH2蛋白表達水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01），見Fig 1A；同時，模型組p-ERK和p-AKT蛋白表達水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性（P＜0.01），恢復組p-ERK和p-AKT蛋白表達水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01），見Fig 1B；與此同時，模型組α-SMA蛋白表達水平明顯升高，與正常組相比差異有顯著性（P＜0.01），恢復組α-SMA蛋白表達水平明顯降低，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01），見Fig 1C。

3．2MTT法檢測HSC-T6增殖活性 MTT實驗結果顯示，EZH2-siRNA瞬時轉染對TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的增殖有明顯的抑制作用，EZH2-siR-NA實驗組作用12 h細胞抑制率與陰性對照組、模型組之間差異無顯著性（P＞0.05）；EZH2-siRNA實驗組作用24、48、72 h細胞抑制率明顯高于陰性對照組、模型組（P＜0.05）。同時，作用24、48、72 h時模型組、陰性對照組與正常組之間差異有顯著性（P ＜0.05），見Fig 2。

3．3Western blot法檢測siRNA轉染后HSC-T6細胞中EZH2、p-ERK、p-AKT和α-SMA蛋白表達變化 瞬時轉染EZH2-siRNA 48 h后，EZH2蛋白表達明顯降低，與陰性對照組相比差異有顯著性（P＜0.01），陰性對照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性（P＜0.01），見Fig 3A；同時，EZH2-siRNA實驗組p-ERK和p-AKT蛋白表達也明顯降低，與陰性對照組相比差異有顯著性（P＜0.01），陰性對照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性（P＜0.01），見Fig 3B；與此同時，EZH2-siRNA實驗組α-SMA蛋白表達也明顯降低，與陰性對照組相比差異有顯著性（P＜0.01），陰性對照組、模型組與正常組相比差異亦有顯著性（P＜0.01），見Fig 3C。

Fig 2 Proliferation of HSC cells determined by MTT after transfection with siRNA of EZH2

4　討論

HSC的增殖活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC的增殖活化成為預防和治療肝纖維化的重要手段之一［5］。近些年研究發(fā)現［6－9］，表觀遺傳學（包括DNA甲基化、microRNA和組蛋白修飾等）在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。組蛋白修飾是指在組蛋白相關酶的作用下，組蛋白發(fā)生乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等修飾的過程。組蛋白的甲基化修飾是由組蛋白甲基轉移酶來實現的，組蛋白的甲基化可發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，最終可導致基因的轉錄沉默或轉錄激活。研究發(fā)現［10］，組蛋白的甲基化修飾與HSC的狀態(tài)及轉歸密切相關。EZH2是一個重要的組蛋白甲基轉移酶，通過特異性甲基化基因啟動子區(qū)域組蛋白H3賴氨酸27，廣泛參與了基因的轉錄沉默。在癌癥的發(fā)生發(fā)展中，EZH2被認為是一個促癌基因，在子宮內膜癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤中高表達［11－13］。有研究發(fā)現，EZH2在肝纖維化形成中扮演重要角色，但是其具體機制尚不清楚。

Fig 3 Protein expression of EZH2（A），p-ERK，p-AKT（B）and α-SMA（C）detected by Western blot after transfection with EZH2 siRNA

有文獻報道［14－15］，在生長因子TGF-β1等的刺激下，MAPK／ERK和PI3K／AKT信號通路被激活，進而影響到大鼠肝星狀細胞HSC-T6的增殖活化。有研究發(fā)現，EZH2能夠激活MAPK／ERK和PI3K／AKT信號通路從而引起疾病的發(fā)生。那么EZH2能否影響TGF-β1誘導的HSC的增殖活化，EZH2通過何種機制影響其增殖活化，目前尚未見文獻報道。在該項研究中，應用TGF-β1誘導HSC增殖活化，同時應用EZH2的抑制劑DZNep和siRNA技術，抑制HSC-T6中EZH2的表達，觀察EZH2表達下調后對TGF-β1誘導的HSC增殖活化的影響，及其對MAPK／ERK和PI3K／AKT信號通路的影響。應用EZH2的siRNA后，與陰性對照組比較，EZH2-siRNA實驗組EZH2蛋白表達水平明顯降低，表明瞬時轉染實驗成功。MTT法是評估細胞增殖的一種有效方法，MTT的結果表明，通過siRNA沉默EZH2的表達可明顯抑制TGF-β1誘導的HSC-T6細胞的增殖。α-SMA是HSC活化的特征性標志，Western blot檢測結果顯示，應用抑制劑DZNep后，可明顯降低α-SMA蛋白的表達；靶向干擾HSC-T6細胞中EZH2的表達，可明顯降低α-SMA蛋白的表達。表明抑制EZH2的表達能影響TGF-β1誘導的HSC的增殖活化。結果進一步表明，應用TGF-β1刺激HSC-T6細胞可明顯升高EZH2蛋白表達水平，也可明顯升高p-ERK、p-AKT蛋白表達水平。應用抑制劑DZNep后可明顯降低EZH2蛋白表達水平，也可明顯降低p-ERK和p-AKT蛋白表達水平。靶向干擾HSC-T6細胞中EZH2基因的表達，可明顯降低EZH2蛋白表達水平，也可降低p-ERK和p-AKT蛋白表達水平。表明抑制EZH2的表達能影響TGF-β1誘導的HSC中MAPK／ERK和PI3K／AKT信號通路的激活。抑制EZH2的表達能影響MAPK／ERK和PI3K／AKT信號通路的激活，是影響TGF-β1誘導的HSC增殖活化的機制。

綜上，抑制HSC-T6細胞中EZH2基因的表達，能影響TGF-β1誘導的HSC中MAPK／ERK和PI3K／AKT信號通路的激活，從而抑制HSC的增殖活化。本研究從細胞分子水平闡明EZH2對HSC的增殖活化的調控作用及其可能的潛在調控機制。揭示了EZH2在肝纖維化發(fā)展中的重要作用，可能成為防治肝纖維化的潛在新靶點，還需要通過其它實驗進一步驗證。肝纖維化的形成過程非常復雜，EZH2如何調控基因的沉默，尚需進一步深入研究。

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EZH2 plays a role in HSC-T6 cell proliferation and activation affecting MAPK／ERK and PI3K／AKT pathway

CHEN Xiao-xia，XIE Juan，HUNANG Cheng，MENG Xiao-ming，LI Jun
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Institute of Liver Diseases of Anhui Medical University，Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032，China）

Abstract：Aim To investigate the effects of cell pro-liferation and activation in HSC-T6 cells by inhibiting the expression of EZH2，and its partial relevant mech-anism．Methods By introducing the inhibitor DZNep in activated HSC-T6 cells stimulated by TGF-β1，the protein expression levels of EZH2，p-ERK，p-AKT and α-SMA were detected by Western blot．The siRNA targeting EZH2 was designed and synthesized according to its nucleotide sequence，and their corresponding ex-pression vectors were constructed and transfected into HSC-T6 cells with LipofectamineTM2000．The prolifer-ation of HSC-T6 cells was determined by MTT．And the protein expression levels of EZH2，p-ERK，p-AKT and α-SMA were measured by Western blot．Results By introducing the inhibitor DZNep in activated HSC-T6 cells stimulated by TGF-β1，it effectively de-creased the protein levels of EZH2 and also the protein levels of p-ERK，p-AKT and α-SMA．By introducing EZH2-siRNA in activated HSC-T6 cells，it effectively inhibited the cell proliferation，and also the protein levels of EZH2，p-ERK，p-AKT and α-SMA．Conclu-sion Silencing EZH2 expression inhibits HSC-T6 cell proliferation and activation，and EZH2 may be a poten-tial therapeutic target gene for hepatic fibrosis．

Key words：histone methylation；hepatic stellate cells；enhancer of zeste homolog 2；3-deazaneplanocin A；hepatic fibrosis；p-ERK；p-AKT；alpha-smooth muscle actin

作者簡介：陳小霞（1987－），女，碩士，研究方向：抗炎免疫藥物的篩選及其作用機制，E-mail：chenxiaoxiahuhongd＠163．com；李 ?。?960－），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：臨床藥理學、抗炎免疫藥理學，通訊作者，Tel：0551-65161001，E-mail：lijun＠ahmu．edu．cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81273526）；博士點基金資助項目（No 20123420120001）；安徽省教育廳基金資助項目（No KJ2012A156）；安徽省自然科學基金資助項目（No 1308085MH145）；安徽醫(yī)科大學基金資助項目（No XJ201118）

收稿日期：2015－03－07，修回日期：2015－04－12

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1061－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．007