有氧運(yùn)動(dòng)抑制高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈BKCa通道蛋白亞基表達(dá)上調(diào)

張 琳，張寒夢(mèng)，葉 芳，石麗君

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有氧運(yùn)動(dòng)抑制高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈BKCa通道蛋白亞基表達(dá)上調(diào)

張 琳，張寒夢(mèng)，葉 芳，石麗君

目的：探究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓大鼠（SHR）腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀（BKCa）通道α和β1亞基蛋白表達(dá)及血管舒縮性的影響。方法：選用12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR，n=24）以及正常血壓對(duì)照組（WKY，n=12）。將SHR隨機(jī)分組，高血壓安靜對(duì)照組（SHR，n=12）和高血壓有氧運(yùn)動(dòng)組（SHR-EX，n=12），各組大鼠先進(jìn)行1周適應(yīng)性訓(xùn)練，之后SHR-EX組進(jìn)行為期8周的跑臺(tái)訓(xùn)練。9周后，取各組大鼠的腸系膜動(dòng)脈（2～3級(jí)），進(jìn)行HE染色，離體微血管張力測(cè)定及蛋白免疫印跡分析。結(jié)果：（1）SHR組腸系膜動(dòng)脈的管壁厚度明顯高于WKY組（P＜0.01），但SHR-EX組腸系膜動(dòng)脈的管壁厚度明顯低于SHR組（P＜0.01）；（2）Iberiotoxin（10-7M）作為BKCa通道選擇性阻斷劑可誘發(fā)各組血管張力增加，增高幅度為SHR＞SHR-EX＞W(wǎng)KY，NS11021作為BKCa通道選擇性激動(dòng)劑可使血管張力下降，下降幅度為SHR＞SHE-EX＞W(wǎng)KY；（3）SHR組BKCa通道的α和β 1亞基表達(dá)上調(diào)，且以β1亞基上調(diào)更為顯著，SHR-EX組的兩亞基上調(diào)減弱，且以β1亞基變化更為顯著。結(jié)論：高血壓誘導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈BKCa通道功能增強(qiáng)，負(fù)反饋調(diào)節(jié)血管張力增加，但有氧運(yùn)動(dòng)可顯著抑制高血壓伴隨的大鼠腸系膜動(dòng)脈BKCa通道的α和β1亞基表達(dá)上調(diào)，從而改善血管功能。

有氧運(yùn)動(dòng)；腸系膜動(dòng)脈；BKCa通道；血管張力；蛋白表達(dá)

高血壓作為心血管疾病死亡的主要原因，一直以來嚴(yán)重威脅人類的健康。大量研究表明，慢性高血壓導(dǎo)致血管的緊張性增加，管壁增厚，官腔變窄，血管喪失彈性，使其硬度增加[1]。高血壓導(dǎo)致血管平滑肌離子通道的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，有氧運(yùn)動(dòng)具有降低血壓，改變血管彈性，促進(jìn)血管平滑肌的功能改善的作用，但其機(jī)制尚不明確。

BKCa通道的分子結(jié)構(gòu)由4個(gè)α和4個(gè)β亞單位組成，BKCa通道的四聚體結(jié)構(gòu)是由一個(gè)α亞單位結(jié)合一個(gè)β亞單位之后形成的[2]。BKCa通道參與細(xì)胞功能調(diào)節(jié)，如激素的分泌、平滑肌的緊張等[3]。目前已經(jīng)證實(shí)，BKCa通道的功能失調(diào)或量的改變會(huì)引起心率不齊、心肌肥大、動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等多種心血管疾病，高血壓可誘導(dǎo)BKCa通道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，如蛋白表達(dá)量增加[4-7]。有關(guān)有氧運(yùn)動(dòng)能夠降低血壓，調(diào)節(jié)血管張力，是否是通過控制甚至逆轉(zhuǎn)高血壓誘導(dǎo)的BKCa通道結(jié)構(gòu)或功能的改變來緩解高血壓還未曾涉及。本實(shí)驗(yàn)旨在探究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓誘導(dǎo)的BKCa通道結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

12周齡雄性SHR大鼠24只，WKY大鼠12只，大鼠均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（京）2013-0001。將24只SHR隨機(jī)分成2組，高血壓有氧運(yùn)動(dòng)組（SHR-EX，n=12）和高血壓安靜對(duì)照組（SHR，n=12），并與WKY安靜對(duì)照組（WKY，n=12）進(jìn)行對(duì)比。大鼠4只一籠，全部大鼠均用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。大鼠先進(jìn)行一周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，隨后SHR-EX組再進(jìn)行為期8周的正式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，以最大攝氧量的55%～65%進(jìn)行訓(xùn)練，20 m/min，60 min/d，5 d/周[8]。

1.2 主要藥物及溶液制備

Anti-KCa1.1（BKCa）和Anti-sloβ1（KCNMB1）購(gòu)自Alomone Labs（以色列），β-Actin（R-22）：sc-130657購(gòu)自SantaCruz（美國(guó)），二抗使用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Proteintech Group（美國(guó)），NE（Norepinephrine）、Iberiotoxin（IbTX）、Hepes、EDTA均購(gòu)自Sigma（美國(guó)），NaCl、KCl、MgCl2、Glucose、NaHCO3等購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。Krebs液成分（mM）：131.5 NaCl，5 KCl，1.2 NaH2PO4，1.2 MgCl2，2.5 CaCl2，11.2 glucose，13.5 NaHCO3，0.025 EDTA，持續(xù)充氧（95%O2～5%CO2），pH=7.4。4%多聚甲醛磷酸緩沖液：稱取40 g多聚甲醛混勻于500 ml 0.1M PBS后加熱至60℃，攪拌并滴加1 mol/L NaOH至溶液清晰為止，冷卻后用0.1 mol/L PBS定容至1 000 ml。蘇木素作為堿性染液對(duì)細(xì)胞核著色，伊紅作為酸性染液對(duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行著色（染液均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司）。電泳緩沖液：Tris堿3.03 g，甘氨酸14.41 g，SDS 1 g，雙蒸水溶解后定容至1 L，4℃保存。轉(zhuǎn)膜緩沖液：Tris堿3.03 g，甘氨酸14.41 g，無水甲醇200 ml，雙蒸水定容至1 L，4℃保存。

1.3 大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)的測(cè)定

各組大鼠體重、心率、基礎(chǔ)血壓在實(shí)驗(yàn)前與實(shí)驗(yàn)后各測(cè)試1次，其中心率及尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓測(cè)試采用全自動(dòng)大小鼠無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)（BP-300A，由成都泰盟科技有限公司提供）。

1.4 腸系膜2、3級(jí)動(dòng)脈橫切面的形態(tài)學(xué)分析

選取各組6只大鼠的腸系膜動(dòng)脈進(jìn)行HE染色和血管環(huán)張力測(cè)定，取大鼠的腸系膜動(dòng)脈于Na+HEPES中去除周圍脂肪，剪下部分2、3級(jí)分支（血管外徑在100～300 μm之間）血管環(huán)備用，剩余迅速將其放入4%的多聚甲醛中，4℃固定12 h，然后用流水沖洗12 h。使用70%酒精Ⅰ20 min—70%酒精Ⅱ20 min—80%酒精20 min—95%酒精Ⅰ20 min—95%酒精Ⅱ20 min—100%酒精Ⅰ20 min—100%酒精Ⅱ20 min進(jìn)行梯度酒精脫水后，經(jīng)二甲苯Ⅰ（100%）和二甲苯Ⅱ（100%）進(jìn)行透明。浸蠟后的組織進(jìn)行包埋。組織進(jìn)行冠狀切片，切片厚度為4 μm，切片放入水浴鍋展片后貼附在處理后的載玻片（載玻片提前編號(hào)）。將切片放在60℃烤箱烤2 h，取出恢復(fù)到室溫，脫蠟及水化后，先用蘇木素染細(xì)胞核3～5 min，用鹽酸酒精分化幾秒，抽插數(shù)下，直至無藍(lán)色液體流下，再用伊紅染細(xì)胞質(zhì)。最后用中性樹脂封片。

1.5 離體血管環(huán)制備及其張力的測(cè)定

各組選取6只大鼠的腸系膜動(dòng)脈2、3級(jí)分支進(jìn)行離體的血管環(huán)張力測(cè)定。腹腔麻醉大鼠成功后，打開腹腔取其腸系膜動(dòng)脈，并迅速放于4℃Krebs液中，剝離血管壁周圍脂肪，并將血管中的殘留血液擠出。剪下2、3級(jí)的分支，再將其制成2 mm血管環(huán)，進(jìn)行血管張力測(cè)定。先用0.12 mol/L KCl刺激血管收縮，以其凈收縮幅度作為100%最大收縮，之后分別再給予去甲腎上腺素（NE，10-9～10-5mol/L）、IbTX（10-7mol/L）和NS11021刺激血管環(huán)，觀察各組血管張力及反應(yīng)性的變化。

1.6 蛋白免疫印跡分析

每組剩余6只進(jìn)行腸系膜動(dòng)脈的BKCa通道α和β1亞基蛋白免疫印跡分析。麻醉成功后，取其腸系膜動(dòng)脈，除去脂肪后，立刻投入液氮中暫存，之后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中保存。稱取研磨后的100 mg組織，迅速加入500 μl RIPA裂解液，用勻漿器在冰水浴中勻漿10次，每次勻4～5 s，間隔4～5 s。將勻漿液置于4℃，在搖床上結(jié)合1 h，隨后以13 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，輕輕拿出后取上清液待測(cè)，借助BCA試劑盒配置出標(biāo)準(zhǔn)液并與上清的蛋白濃度進(jìn)行比對(duì)，從而確定提取的蛋白濃度。隨后，用一定比例的樣品緩沖液及生理鹽水對(duì)提取的上清液進(jìn)行稀釋。制備電泳緩沖液，聚丙烯酰胺凝膠（上樣量每孔保持40～50 μg，根據(jù)蛋白濃度自行調(diào)整上樣量），轉(zhuǎn)膜（BKCa α-亞基300 mA恒流1.5 h，BKCa β1亞基250 mA恒流50 min）、5%BSA封閉2 h。加一抗，用BSA稀釋一抗（Anti-KCa1.1（BKCa），1：200；Anti-sloβ1（KCNMB1），1：200；β-Actin（R-22）：sc-130657，1：200），置于4℃冰箱過夜。第2天復(fù)溫1 h，后用TBST洗3×10 min，二抗使用TBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1：8 000）孵育1 h。蛋白免疫印跡分析用image lab進(jìn)行操作，框出各個(gè)條帶，進(jìn)行灰度值的分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Image J對(duì)腸系膜2、3級(jí)動(dòng)脈血管石蠟切片HE染色圖片進(jìn)行分析，Image Lab對(duì)蛋白免疫印跡條帶進(jìn)行分析，SPSS17.0對(duì)3部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤、顯著性差異的分析，使用GraphPad Prism 5作柱狀統(tǒng)計(jì)圖。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SD）表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中WKY組和SHR組、SHR-EX組和SHR組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01有非常顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)的影響

12周齡時(shí)，WKY和SHR大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；21周齡時(shí)，3組體重均顯著性升高（P＜0.01）。與12周齡時(shí)相比，21周齡時(shí)SHR組收縮壓、舒張壓和脈壓均顯著性升高（P＜0.01），而SHR-EX組收縮壓卻顯著性降低（P＜0.05）（見表1）。

經(jīng)過9周后，SHR組的心重、心重/體重比、收縮壓、舒張壓、脈壓均顯著性高于WKY組（P＜0.01），同時(shí)心率也顯著性升高（P＜0.05）；SHR-EX組的收縮壓顯著低于SHR組（P＜0.01），舒張壓、脈壓和心率也顯著性降低（P＜0.05）（見表1）。

表1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠體重、心臟重量、心重/體重、基礎(chǔ)血壓及心率的影響Table1 Effects of aerobic exercise on the rat body weight，heart weight，heart weight/body weight，basal blood pressure and heart rate

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腸系膜動(dòng)脈管壁厚度的影響

取大鼠腸系膜動(dòng)脈的2、3級(jí)分支的橫切面進(jìn)行對(duì)比，經(jīng)過8周的有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR組的外徑與WKY組相比無顯著性差異，SHR-EX組的外徑與SHR組相比無顯著性差異。內(nèi)徑指標(biāo)中，與WKY組相比，SHR組呈顯著性低水平（P＜0.01），而與SHR組相比，SHR-EX組呈顯著性高水平（P＜0.01）；動(dòng)脈管壁厚度指標(biāo)中，SHR組高于WKY組（P＜0.01），但SHR-EX組顯著低于SHR組（P＜0.01）；內(nèi)徑/動(dòng)脈管壁厚度指標(biāo)中，SHR組低于WKY組（P＜0.01），而SHR-EX組顯著高于SHR組（P＜0.01）（見表2、圖1～圖2）。表明，高血壓可使腸系膜動(dòng)脈血管的管壁變厚、官腔變窄，但有氧運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)這種改變。

表2 大鼠腸系膜動(dòng)脈2、3級(jí)分支的形態(tài)學(xué)分析Table2 Morphology analysis of MAs in each group

圖1 大鼠腸系膜動(dòng)脈2、3級(jí)分支橫切面的HE染色圖Figure1 Mesenteric artery cross-sections（HE staining）

圖2 大鼠腸系膜動(dòng)脈2、3級(jí)分支HE染色統(tǒng)計(jì)圖Figure2 The statistical of HE in MAs

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腸系膜動(dòng)脈血管收縮性的影響

2.3.1 高鉀誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng) KCl（0.12 mol/L）可誘發(fā)各組腸系膜動(dòng)脈收縮，SHR、SHR-EX和WKY組大鼠的最大收縮張力（Kmax）分別為（15.1±1.8）×10-3N、（14.6±1.6）×10-3N和（14.4±1.5）×10-3N。由數(shù)據(jù)可知，3組之間無差別（P＞0.05）（見表3）。

2.3.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NE誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)的影響 去甲腎上腺素（NE）作為一種腎上腺素受體激動(dòng)藥物，具有收縮血管、升高血壓的作用。本實(shí)驗(yàn)采用10-9～10-5mol/L濃度梯度的NE誘發(fā)腸系膜動(dòng)脈收縮。與SHR組相比，NE對(duì)SHR-EX組腸系膜的最大收縮具有顯著下降的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)中，為了防止內(nèi)皮功能的干預(yù)，單純地對(duì)血管平滑肌的功能進(jìn)行檢測(cè)，使用內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的抑制劑L-NAME（100 μM）對(duì)腸系膜動(dòng)脈孵育20 min后再加NE進(jìn)行刺激，觀察血管的收縮情況。NE誘發(fā)的3組腸系膜動(dòng)脈最大收縮力分別為WKY（105.8± 7.2%Kmax）、SHR（128.5±8.0%Kmax）、SHR-EX（112.6±7.8%Kmax）。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出，高血壓使動(dòng)脈NE誘導(dǎo)血管收縮作用增強(qiáng)，但有氧運(yùn)動(dòng)使高血壓大鼠的腸系膜動(dòng)脈對(duì)NE的敏感性下降（見表3）。

表3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR大鼠腸系膜動(dòng)脈血管收縮性的影響Table3 Effects of aerobic exercise on the vascular contractility in MAs from SHR

2.3.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)IBTX誘發(fā)的離體腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)的影響 IbTX（10-7mol/L）作為BKCa通道的特異性阻斷劑，可誘發(fā)大鼠腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)。在WKY、SHR、SHR-EX 3組中，IbTX誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)增加，SHR組比WKY呈顯著性增加（P＜0.01），但SHR-EX組與SHR組相比則明顯減少（P＜0.01）（見表3、圖3）。

圖3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)IbTX誘發(fā)的離體腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)的影響Figure3 Effects of aerobic exercise on IbTX-induced vascular tension in MAs from SHR

2.3.4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NS11021誘發(fā)的離體腸系膜動(dòng)脈舒張反應(yīng)的影響 BKCa通道的特異性激動(dòng)劑NS11021誘發(fā)大鼠腸系膜動(dòng)脈舒張。NS11021（10-5mol/L）降低血管張力的程度為SHR＞SHR-EX＞W(wǎng)KY。與WKY相比，SHR組中NS11021（10-5mol/L）誘導(dǎo)的血管舒張程度更為顯著（P＜0.05），而與SHR組相比，SHR-EX組中NS11021誘導(dǎo)的血管舒張程度則呈顯著性低水平（P＜0.05），但仍高于WKY組（見表3、圖4）。由數(shù)據(jù)可知，高血壓使BKCa的貢獻(xiàn)率增加，而有氧運(yùn)動(dòng)緩解了高血壓BKCa的貢獻(xiàn)率上調(diào)。

圖4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NS11021誘發(fā)的離體腸系膜動(dòng)脈舒張反應(yīng)的影響Figure4 Effects of aerobic exercise on NS11021-induced vascular tension in MAs from SHR

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腸系膜動(dòng)脈BKCa通道α和β1亞基表達(dá)量的影響

4 個(gè)α亞單位和4個(gè)β亞單位組成BKCa通道的分子結(jié)構(gòu)。用α、β1的特異性抗體檢測(cè)α（125kDa）、β1（28 kDa）蛋白的表達(dá)量。與WKY組相比，SHR組的α和β1亞基表達(dá)均上調(diào)，β1亞基的升高更為顯著（P＜0.05）；與SHR相比，SHR-EX組α和β1亞基表達(dá)均下調(diào)，β1亞基的下調(diào)更為顯著（P＜0.05）（見表4、圖5）。表明，高血壓伴隨著腸系膜動(dòng)脈BKCa通道α和β1亞基的蛋白表達(dá)量增加，但有氧運(yùn)動(dòng)可抑制這種改變，使α和β1亞基的蛋白表達(dá)量下降。

表4 有氧運(yùn)動(dòng)逆轉(zhuǎn)SHR腸系膜動(dòng)脈BKCa通道α和β1亞基表達(dá)量上調(diào)Table4 Aerobic exercise reversed the up-regulation of protein expression of α-and β1-subunit of BKCachannel in mesenteric arterial myocytes

圖5 有氧運(yùn)動(dòng)抑制SHR腸系膜動(dòng)脈BKCa通道α和β1亞基表達(dá)量上調(diào)Figure5 Aerobic exercise reversed the up-regulation of protein expression of α-and β1-subunit of BKCachannel in mesenteric arterial myocytes

3 分析與討論

高血壓的基本病理生理機(jī)制是阻力動(dòng)脈的血管張力持續(xù)增加，而血管張力的調(diào)節(jié)主要取決于VSMCs離子通道尤其是K+通道的活動(dòng)[9]。VSMC各離子通道的正常調(diào)節(jié)作用是血管平滑肌興奮收縮過程的關(guān)鍵，K+通道是作為調(diào)節(jié)VSMC膜電位的重要離子通道，具有穩(wěn)定膜電位的作用。激活K+通道可以誘發(fā)K+外流，導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，從而抑制電壓門控Ca2+通道，使血管平滑肌舒張[10]。研究表明，高血壓的發(fā)病過程中，各類K+通道的結(jié)構(gòu)和功能都發(fā)生了變化，其中BKCa這一通道對(duì)血管張力的調(diào)節(jié)起著重要負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。之前的研究顯示，8周有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道活性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)以3月齡的雄性SHR與WKY作為研究對(duì)象，并對(duì)SHR實(shí)施為期8周的有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)導(dǎo)了長(zhǎng)期規(guī)律性有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa離子通道的有利調(diào)節(jié)作用。有氧運(yùn)動(dòng)除了可以降低血壓，同時(shí)還可以抑制高血壓誘導(dǎo)的BKCa離子通道的重構(gòu)。

有氧運(yùn)動(dòng)作為不涉及藥物的單純性物理療法被大家廣泛接受。大量研究證明，有氧運(yùn)動(dòng)會(huì)使心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生一系列有利的適應(yīng)性改變，使迷走張力增加出現(xiàn)竇性心動(dòng)徐緩[11]。運(yùn)動(dòng)前，SHR組的收縮壓、脈壓都明顯高于WKY組。8周正式運(yùn)動(dòng)后，SHE-EX組的體重、收縮壓、脈壓和心率都明顯低于SHR組，表明有氧運(yùn)動(dòng)可以起到有效減輕體重，降低血壓的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)下的腸系膜動(dòng)脈血管形態(tài)學(xué)也進(jìn)行了研究。正常情況下，動(dòng)脈血管管壁光滑，富有彈性，血流速度通暢。但當(dāng)高血壓發(fā)生后，血管的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生一系列惡性變化，如管壁硬度增加、彈性下降，嚴(yán)重時(shí)管壁增厚，使得管腔變窄，甚至內(nèi)膜出現(xiàn)鈣化和脂類物質(zhì)沉積，堵塞血管。研究表明，增齡伴隨的血管結(jié)構(gòu)和功能的退行性改變可以通過長(zhǎng)期規(guī)律性的有氧運(yùn)動(dòng)得到改善，同時(shí)有氧運(yùn)動(dòng)也可使動(dòng)脈管壁增厚的速率減慢，延緩動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)的衰老[12]。本實(shí)驗(yàn)中的形態(tài)學(xué)觀察可知，高血壓導(dǎo)致腸系膜動(dòng)脈的血管壁增厚、官腔變窄，但有氧運(yùn)動(dòng)可以抑制這種管腔變化的發(fā)生。長(zhǎng)期規(guī)律性的有氧運(yùn)動(dòng)可以抑制腸系膜動(dòng)脈管壁的增厚、管腔變窄，維持管壁應(yīng)有的彈性結(jié)構(gòu)。

有氧運(yùn)動(dòng)可使內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)增多，刺激內(nèi)皮細(xì)胞，從而使NO生成增多，進(jìn)而使血管舒張功能增強(qiáng)[13]，有氧運(yùn)動(dòng)可以提高腸系膜動(dòng)脈eNOS的生物利用率[14]。為了排除內(nèi)皮功能的干擾，研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血管平滑肌的影響，首先用L-NAME（eNOS的阻斷劑）進(jìn)行處理，再對(duì)血管張力進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)選取3組大鼠的腸系膜2、3級(jí)動(dòng)脈血管，NE通過與血管平滑肌上的α腎上腺素能受體結(jié)合，使血管收縮，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，并且NE所誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)是呈濃度依賴性的。隨年齡的增加，大鼠腸系膜動(dòng)脈對(duì)NE的敏感性和最大收縮反應(yīng)都顯著降低[15]。和正常鼠相比，高血壓使得NE誘導(dǎo)的血管收縮程度顯著增加，但有氧運(yùn)動(dòng)后使得NE誘導(dǎo)的血管收縮幅度下降，這表明高血壓導(dǎo)致血管平滑肌功能下降，彈性收縮減弱，但堅(jiān)持長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能夠改善血管平滑肌功能，恢復(fù)血管彈性。

目前為止，已發(fā)現(xiàn)4種不同類型的鉀通道存在于血管平滑肌細(xì)胞上，在VSMC上表達(dá)密度最高的離子通道是大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa），它的生理作用是控制細(xì)胞膜電位，負(fù)反饋調(diào)節(jié)膜的去極化水平。當(dāng)BKCa離子通道被激活，K+就會(huì)外流，從而引起細(xì)胞膜超極化，電壓依賴性鉀通道就會(huì)受到抑制，內(nèi)流的Ca2+將會(huì)減少，使得細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低，導(dǎo)致平滑肌舒張[16]。R.QUINLANT等[17]研究表明，高血壓使VSMCs的BKCa通道功能增強(qiáng)的機(jī)制可能是當(dāng)血壓升高時(shí)，BKCa通道負(fù)反饋地抑制血管張力增加，從而阻止血壓升高，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，選用BKCa的特異性阻斷劑IbTX來觀察有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)BKCa通道調(diào)節(jié)血管張力作用的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，BKCa通道特異性阻斷劑IbTX（10-7M）可誘發(fā)各組腸系膜動(dòng)脈張力增加的幅度為SHR＞SHR-EX＞W(wǎng)KY。同時(shí)，選用BKCa通道的激動(dòng)劑NS11021，其可誘發(fā)各組腸系膜動(dòng)脈張力下降的幅度為SHR＞SHR-EX＞W(wǎng)KY。S.J.CHEN[18]研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)不僅能提高腸系膜動(dòng)脈NO的利用率，同時(shí)還可以提高BKCa通道的活性，使其起到舒張血管的作用。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，高血壓使BKCa通道在維持血管基礎(chǔ)張力中的貢獻(xiàn)率顯著增加，但長(zhǎng)期有規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能抑制此變化，緩解高血壓BKCa的貢獻(xiàn)率上調(diào)。這可能是有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)血管張力，有效緩解高血壓的重要生理機(jī)制。

一個(gè)完整的BKCa通道是由4個(gè)構(gòu)成通道結(jié)構(gòu)對(duì)稱排列的α亞基（編碼基因KCNMA1）和4個(gè)具有調(diào)控功能的β亞基（編碼基因KCNMB1-4）組成[2]。其中，BKCa通道的四聚體孔道結(jié)構(gòu)正是由每個(gè)α亞基和每個(gè)β亞基結(jié)合后形成的。目前為止，α亞基只發(fā)現(xiàn)了一種，但它有不同的剪接變異體，是BKCa通道的小分子組分，約由1 200個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為125 kDa。雖然β亞基存在4種不同的亞型，但VSMCs中只有β1亞型，β1由191個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為28 kDa。C.M.NIMIGEAN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)BKCa通道對(duì)Ca2+的敏感性、減慢BKCa通道的激活動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)是β1亞基與α亞基的共表達(dá)。有研究表明，衰老通過顯著降低β1亞基功能（即α亞基和β1亞基非1：1下降）使BKCa通道的電壓敏感性和鈣敏感性下降，平均開放概率降低[16]。本實(shí)驗(yàn)中，猜想高血壓同樣導(dǎo)致α亞基和β1亞基的上調(diào)，且以β1亞基的上調(diào)為主，但有氧運(yùn)動(dòng)可抑制這種上調(diào)趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)采用蛋白免疫印跡分析法，觀察正常大鼠和高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈BKCa通道α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)量，以及對(duì)高血壓大鼠進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，檢測(cè)BKCa通道α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)量的變化。由本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，高血壓大鼠的BKCa通道α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)量都要高于正常大鼠，且β1亞基蛋白表達(dá)量上調(diào)更為顯著。SHR-EX組和SHR組相比，BKCa通道α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)量均明顯下調(diào)，其中以β1的下調(diào)更為顯著。由此可知，高血壓使BKCa通道α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)量上調(diào)，且以β1亞基蛋白表達(dá)量上調(diào)為主，有氧運(yùn)動(dòng)可使BKCa通道α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)量下調(diào)，且以β1亞基蛋白表達(dá)量下調(diào)為主。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高血壓導(dǎo)致BKCa通道的代償作用增加，這可能是一種病理性的變化，而有氧運(yùn)動(dòng)可以減緩BKCa通道作用的代償性增加，從而起到降低血壓的效果。這也為有氧運(yùn)動(dòng)可調(diào)節(jié)高血壓誘導(dǎo)的BKCa通道重構(gòu)，從而起到降血壓的作用提供分子依據(jù)。

本研究從整體水平、組織水平和分子水平對(duì)高血壓大鼠、高血壓運(yùn)動(dòng)大鼠以及正常血壓大鼠的腸系膜動(dòng)脈的BKCa結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓導(dǎo)致BKCa通道在維持血管基礎(chǔ)張力中的貢獻(xiàn)率顯著增加，這可能是病理性代償?shù)慕Y(jié)果，但BKCa通道功能的代償性增加可通過有氧運(yùn)動(dòng)得以緩解。在細(xì)胞分子水平上觀察，BKCa通道的結(jié)構(gòu)蛋白α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)量在高血壓病的誘導(dǎo)下呈上調(diào)趨勢(shì)，且以β1上調(diào)更為顯著，但有氧運(yùn)動(dòng)能抑制高血壓誘導(dǎo)的BKCa通道結(jié)構(gòu)的改變，其中以β1的下調(diào)為主。這也為運(yùn)動(dòng)可降低血壓，重新恢復(fù)腸系膜動(dòng)脈的功能提供理論依據(jù)，這也進(jìn)一步證實(shí)對(duì)于高血壓的病理性治療，有氧運(yùn)動(dòng)可以作為一種有效的非藥物治療手段。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以降低血壓的一個(gè)重要機(jī)制為抑制高血壓誘導(dǎo)的BKCa通道病理性代償作用的增加，從而引起B(yǎng)KCa通道的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重構(gòu)。

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Aerobic Exercise Inhibits Protein Expression Level of BKCa Channel in Mesenteric Arteries from Spontaneous?lyHypertensiveRats

ZHANG Lin，ZHANG Hanmeng，YE Fang，SHI Lijun
（Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China）

Objective：The present study was designed to investigate the effects of chronic exercise on the molecular expression of α-and β1-subunit of large-conductance Ca2+-activated K+（BKCa）channels and vascular contractility in rat mesenteric arterial smooth muscle cells from spontaneously hyperten?sive rats.Methods：Three-month-old male normotensive Wistar-Kyoto rats（WKY，n=12）and SHRs（n=24）were used.SHRs（n=24）were separated into a sedentary group（SHR）and an exercise group（SHR-EX）at random（n=12 in each group）.After a 1-week acclimation period，rats in SHR-EX were sub?jected to aerobic exercise on a motor-driven treadmill.After 8 weeks，HE staining was used to analyze the vascular morphology change.Mesenteric arterial tensions were measured in vitro.Immunohistochemistry and Western blots assay were also conducted.Results：1）Compared with WKY，the systolic blood pressure and pulse pressure were significantly increased with hypertension（P＜0.01）.However，they significantly dropped in SHR-EX compared with its sed?entary group（P＜0.01）.2）The wall thickness of mesenteric artery in hypertension group was obviously increased，but it effectively decreased in SHR-EX compared with SHR.Selective BKCa channel blocker（Iberiotoxin10-7M）induced a marked increase of vascular tension in MAs in all three groups.Howev?er，these effects were greatly increased in SHR group.3）Selective BKCa channel activator（NS11021）induced concentration-dependent vasorelaxation in MAs precontracted with norepinephrine.However，these effects were greatly decreased in SHR group.4）Western blotting showed that the protein expression of BKCa α-and β1-subunit was significantly increased with hypertension，and the increase of β1 subunits was larger than that of α subunits，whereas aero?bic exercise could effectively ameliorate the changes.Conclusions：Hypertension is associated with an increase of BKCa channel protein expression，which is a negative feedback to regulate vascular contractility，whereas aerobic exercise can significantly weaken this hypertension-associated pathological up-regula?tion of BKCa channels to improve the vascular function.

aerobic exercise；mesenteric arteries；BKCa channels；vascular contractility；molecular expression

G 804.5

：A

：1005-0000（2015）01-042-05

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2015.01.008

2014-10-02；

2014-12-21；錄用日期：2014-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：31371201）；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：5132017）；新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：NCET-11-0850）

張 琳（1991年-），女，山東聊城人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管生理學(xué)。

北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理教研室，北京100084。