草酸鈣腎結(jié)石大鼠腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)及溫腎化石湯調(diào)節(jié)*

草酸鈣腎結(jié)石大鼠腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)及溫腎化石湯調(diào)節(jié)*

*基金項(xiàng)目：江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20122BAB205082)。

摘要：目的：研究草酸鈣腎結(jié)石大鼠腎組織TH蛋白的表達(dá)，并用中藥溫腎化石湯調(diào)節(jié)，探討該方防治腎結(jié)石復(fù)發(fā)的作用機(jī)制。方法：雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組、腎結(jié)石組、溫腎化石湯組，每組各20只，腎結(jié)石組和溫腎化石湯組以含有0.5%的乙二醇和0.5%的氯化銨的混合溶液致石劑代替飲用水，溫腎化石湯組同時(shí)每日灌服中藥溫腎化石湯，二周后處死大鼠，解剖觀察腎臟剖面結(jié)石形成，并用免疫組織化學(xué)法測(cè)定腎組織TH蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：腎結(jié)石組腎臟成石程度最重，與溫腎化石湯組比差異顯著，對(duì)照組腎組織TH蛋白表達(dá)最強(qiáng)，其次為溫腎化石湯組，腎結(jié)石組，三組相比差異顯著。結(jié)論：TH蛋白可以抑制腎結(jié)石形成，中藥溫腎化石湯可以恢復(fù)大鼠腎組織TH蛋白表達(dá)量，推測(cè)此可能為該方防治腎結(jié)石復(fù)發(fā)的重要作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：腎結(jié)石；TH蛋白；溫腎化石湯

腎結(jié)石發(fā)病率高，治愈后復(fù)發(fā)率高，故研究腎結(jié)石的病因病機(jī)，尋求有效的防治方法，成為國(guó)內(nèi)外泌尿外科研究的重要課題[1]。Tamm-Horsfall(TH)蛋白是尿中主要的粘蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其可影響草酸鈣結(jié)石成核、生長(zhǎng)、聚集及其與腎上皮細(xì)胞粘附，與腎結(jié)石形成密切相關(guān)[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)中藥溫腎化石湯對(duì)腎結(jié)石形成與復(fù)發(fā)具有良好防治作用[3]。研究實(shí)驗(yàn)性草酸鈣腎結(jié)石模型腎組織中TH蛋白的表達(dá)，并用中藥溫腎化石湯進(jìn)行調(diào)節(jié),從中、西醫(yī)角度進(jìn)一步探討含鈣腎結(jié)石的形成機(jī)制，闡明溫腎化石湯的防治機(jī)理。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組雄性SD大鼠60只，SPF級(jí)，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào):SCXK(湘)2011-0003，體重250g左右。隨機(jī)分成對(duì)照組、腎結(jié)石組、腎結(jié)石加溫腎化石湯組(簡(jiǎn)稱(chēng)中藥組)，每組20只。

1.2草酸鈣腎結(jié)石動(dòng)物模型制作[4]以含有0.5%的乙二醇和0.5%的氯化銨的混合溶液為致石劑代替飲用水，二周后處死大鼠，解剖腎臟，解剖顯微鏡下即可觀察到腎臟剖面有腎結(jié)石形成。

1.3中藥溫腎化石湯制備熟地12g, 山藥10g，山茱萸10g，澤瀉10g，茯苓10g，丹皮10g，桂枝6g，制附片6g，金錢(qián)草16g，茜草10g。涼水浸泡40min后煎煮2次，每次30min，兩次煎液合并，濃縮至100mL，含生藥1g/mL。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ恐兴幘?gòu)自江西省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。

1.4處理方法對(duì)照組只喂普通凈化飲用水，腎結(jié)石組與中藥組以致石劑代替飲用水，中藥組同時(shí)灌服溫腎化石方煎劑1mL/100g體重，每天灌胃一次。為使三組大鼠實(shí)驗(yàn)條件保持一致，對(duì)照組與腎結(jié)石組每日同時(shí)用等量?jī)艋辔?次。二周后處死大鼠，解剖取出腎臟，沿腎門(mén)長(zhǎng)軸剖開(kāi)，部分腎組織用10%甲醛固定，其余腎組織用解剖顯微鏡觀察腎臟表面形態(tài)、腎剖面結(jié)石形成情況，以腎臟剖面有無(wú)明顯結(jié)晶沉淀物、游離結(jié)石作為判斷有無(wú)結(jié)石的標(biāo)準(zhǔn)。并根據(jù)結(jié)晶結(jié)石形成的量分為四級(jí)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1大鼠腎臟成石觀察根據(jù)解剖顯微鏡觀察腎臟表面和剖面結(jié)石、結(jié)晶形成量的多少分為四級(jí)。0級(jí):表面和剖面無(wú)結(jié)石、結(jié)晶形成；1級(jí):表面與剖面有少量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野3個(gè)以下；2級(jí):表面與剖面可見(jiàn)較多結(jié)石、結(jié)晶，每個(gè)視野3至5個(gè)；3級(jí):表面與剖面見(jiàn)多量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野5至10個(gè)；4級(jí):表面與剖面皮、髓質(zhì)內(nèi)均見(jiàn)大量結(jié)石、結(jié)晶形成，每個(gè)視野10個(gè)以上。

1.5.2腎組織TH蛋白表達(dá)[5]采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定腎組織TH蛋白的相對(duì)表達(dá)量。使用BOSTER公司生產(chǎn)的SV0002-兔IgG兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒，按其說(shuō)明操作進(jìn)行。順序?yàn)榧兹┕潭I組織脫水浸蠟包埋，3μm厚切片，3.3%H2O2,室溫10min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗2min 3次。滴加封閉液,室溫10min，甩去多余液體, 滴加適當(dāng)稀釋的一抗(兔IgG)，20～37 ℃ 1～2 h，0.01M PBS 洗2min 3次，滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(SV-0002)， 37℃孵育30min，PBS沖洗，2min 3次，DAB顯色試劑盒(AR1022)顯色，蘇木素輕度復(fù)染、脫水,透明,封片、光學(xué)顯微鏡下觀察，染色呈深棕黃色為+++，黃色為++，淺黃色為+，對(duì)其分級(jí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS13.0 for windows專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件，采用KrusKal-Walls非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)三組大鼠腎臟成石程度和腎臟TH蛋白表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)三組大鼠腎臟成石程度和腎臟TH蛋白表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2結(jié)果

2.1腎臟成石分級(jí)概況見(jiàn)表1。結(jié)果所示，對(duì)照組與其它二組大鼠腎臟成石程度差異極為顯著(P﹤0.01)，中藥組與腎結(jié)石組大鼠腎臟成石程度差異顯著(P﹤0.05)。腎結(jié)石組腎臟成石程度最重，表明本模型致石率高，中藥組腎臟成石程度要輕，表明中藥溫腎化石湯可防治草酸鈣腎結(jié)石形成。

表1　腎臟成石分級(jí)比較

注：與對(duì)照組比較**P﹤0.01；與腎結(jié)石組比較#P﹤0.05。

2.2腎組織TH蛋白表達(dá)見(jiàn)表2。結(jié)果所示，對(duì)照組腎組織TH蛋白表達(dá)最強(qiáng)，其余二組與其比較差異極為顯著(P﹤0.01)，中藥組比腎結(jié)石組腎組織TH蛋白表達(dá)強(qiáng)度要強(qiáng)，二組相比差顯著(P﹤0.05)。

表2　腎組織TH蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較

注：與對(duì)照組比較**P﹤0.01；與腎結(jié)石組比較#P﹤0.05。

3討論

3.1腎結(jié)石與TH蛋白尿過(guò)飽和度增高、抑制活性下降、促進(jìn)活性增強(qiáng)和顆粒滯留是尿石形成的四個(gè)主要因素[6]。腎石形成抑制物和促進(jìn)物正常情況下二者處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)促進(jìn)物增加，抑制物減少，則尿中即可形成尿石。Tamm-Horsfall(TH)蛋白是尿中主要的粘蛋白，其可影響腎石主要礦物草酸鈣結(jié)石成核、生長(zhǎng)、聚集及其與腎上皮細(xì)胞粘附[7]，故TH蛋白與腎石形成密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，草酸鈣腎結(jié)石大鼠腎組織中TH蛋白的表達(dá)下降，與對(duì)照組相比，差異極為顯著，TH蛋白可以抑制草酸鈣腎結(jié)石的形成，可以認(rèn)為是結(jié)石形成的主要抑制物。

3.2溫腎化石湯調(diào)節(jié)TH蛋白腎結(jié)石屬中醫(yī)石淋、腰痛、血尿等病范疇?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》謂“陽(yáng)化氣，陰成形”，張景岳釋“陽(yáng)動(dòng)而散，故化氣；陰?kù)o而凝，故成形”。臨床發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石復(fù)發(fā)的患者未發(fā)病時(shí)平素多表現(xiàn)為形寒肢冷、腰膝酸軟、舌淡、脈沉細(xì)等腎陽(yáng)虧虛之候[9]，腎陽(yáng)虧虛，陰寒凝聚是腎結(jié)石形成的中醫(yī)病機(jī)，下焦?jié)駸崞鋵?shí)是腎石形成之后的病理產(chǎn)物[10]。本研究方中金匱腎氣丸溫腎化氣治腎陽(yáng)虧虛之本，金錢(qián)草、茜草清利濕熱，活血化瘀，以防結(jié)石形成之濕、熱、瘀之標(biāo)，溫腎化氣，活血利尿，標(biāo)本兼治。實(shí)驗(yàn)研究顯示，腎結(jié)石組大鼠腎組織中TH蛋白表達(dá)減弱，加用中藥溫腎化石湯后腎組織中TH蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，腎臟結(jié)石、結(jié)晶形成明顯減少，與腎結(jié)石組比差異極為顯著。推測(cè)溫腎化石湯防治腎結(jié)石形成機(jī)制可能是通過(guò)恢復(fù)結(jié)石形成抑制物TH蛋白的表達(dá)量，從而抑制尿中結(jié)晶的成核、生長(zhǎng)、聚集。

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Tamm-Horsfall Protein Expression in Renal Tissue of Rats with Calcium Oxalate Stones and the Regulation of Wenshen Huashi Decoction

YANG Liu, CHEN Bao-guo, QIU Li-ying, YE Jing, LIU Cui-fang

TheaffiliatedhospitalofJiangxiUniversityofTCM,Nanchang330006,China.

Abstract:To study the expression of TH-protein in Renal Tissue of Rats with Calcium Oxalate Stones and the regulation of Wenshen Huashi Decoction, and explore the mechanism of prevention and cure the recurrence of kidney stones for this therapy. Method:60 male SD rats were randomly divided into three groups, which were control group, kidney stone group, Wenshen Huashi Decoction group, each group of 20 rats. Instead of drinking water, kidney stones group and Wenshen Hua shi Decoction group drunk the mixed solution which lead to stone water that were contain 0.5% of glycol and 0.5% of ammonium chloride, at the same time Wen Shen Hua Shi Decoction group fed the Wenshen Huashi Decoction daily. Rats were killed after two weeks, observed the formation of stone on the kidney profile, and then tested the relative expression amount of TH-protein in renal tissue which used the immunohistochemistry method. Results: Kidney stone group were the most severity in stone formation, and there were a significant difference than the Wenshen Huashi Decoction group. TH-protein were strongest expressed in contral group,and then Wen shen Huashi Decoction group and kidney stone group, significant difference in TH-protein expression among three groups. Conclusion: TH-protein can inhibit the formation of kidney stones, Wenshen Huashi Decoction can restore the TH-protein expression in rats kidney tissue, thus speculated that this may be the important role in the mechanism of prevention and cure the recurrence of kidney stones for Wenshen Huashi Decoction.

Key words:kidney stone; TH-protein; Wen Shen Hua Shi Decoction

收稿日期：(2014-11-13)編輯：曾文雪

中圖分類(lèi)號(hào)：R692.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

通信作者:★楊柳陳寶國(guó)*陳寶國(guó)(1962—)，男，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)臨床基礎(chǔ)。邱麗瑛葉菁劉翠芳(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南昌 330006)