水濕困脾證與線粒體的關(guān)系研究*

★　林海鳴第一作者：林海鳴(975—)，男，碩士，講師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail：flashlhm@tom.com?！∴嵜赭胪ㄐ抛髡撸亨嵜赭?。E-mail：809040@qq.com?！∪钤?shī)瑋　董衛(wèi)國(guó)　謝永財(cái)　李長(zhǎng)征　(.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院　福州 350；.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院　福州 350004)

*基金項(xiàng)目：福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013-ZQN-ZD-26)；福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2000Z154)；福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(wzy0902)。

水濕困脾證與線粒體的關(guān)系研究*

★林海鳴1*第一作者：林海鳴(1975—)，男，碩士，講師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail：flashlhm@tom.com。鄭敏麟1*通信作者：鄭敏麟。E-mail：809220140@qq.com。阮詩(shī)瑋2董衛(wèi)國(guó)1謝永財(cái)1李長(zhǎng)征1(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院福州 350004)

*基金項(xiàng)目：福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013-ZQN-ZD-26)；福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2000Z154)；福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(wzy0902)。

摘要：目的：探討水濕困脾證的病理學(xué)基礎(chǔ)，以期對(duì)中醫(yī)脾的實(shí)質(zhì)與線粒體的關(guān)系做更深入的研究。方法：利用SD大鼠行5/6腎切除術(shù)，制備水濕困脾動(dòng)物病理模型，實(shí)驗(yàn)分組為假手術(shù)組、培土制水方大劑量治療組、培土制水方小劑量治療組、模型組。治療組給予培土制水方干預(yù)，觀察各組Scr、BUN、MDA、SOD值，以及心和小腸超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：培土制水方大、小劑量組Scr、BUN、MDA均顯著低于模型組(P<0.05)；培土制水方大、小劑量組SOD均顯著高于模型組(P<0.05)。電鏡觀察心、小腸超微結(jié)構(gòu)，模型組的病變最重，部分線粒體明顯腫脹；培土制水方大、小劑量組的病變輕，線粒體形態(tài)無明顯改變。結(jié)論：培土制水方能減少“水濕困脾”證大鼠心肌及小腸細(xì)胞線粒體的損傷，推測(cè)其具有清除和減少產(chǎn)生自由基、降低膜脂過氧化反應(yīng)，從而減少線粒體和組織細(xì)胞受到毒素?fù)p害而起到保護(hù)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證“脾”的微觀實(shí)質(zhì)是細(xì)胞器之線粒體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水濕困脾；培土制水；慢性腎功能衰竭；尿毒癥毒素；線粒體

2002年筆者曾提出了“中醫(yī)藏象實(shí)質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)假說”(以下簡(jiǎn)稱“藏象假說”)，指出中醫(yī)藏象的微觀實(shí)質(zhì)是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中，中醫(yī)“脾”的實(shí)質(zhì)是線粒體，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了腎小管細(xì)胞線粒體是“脾制水”的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1-5]。那么，什么是“脾惡濕”、“水濕困脾”的病理學(xué)基礎(chǔ)呢？該病理學(xué)基礎(chǔ)與線粒體相關(guān)性如何？揭示“脾”藏象中醫(yī)證型的微觀病理學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步理解中醫(yī)藏象的實(shí)質(zhì)有重要意義。

本研究通過制作5/6腎切除大鼠動(dòng)物模型，使其水液代謝障礙、代謝廢物潴留而產(chǎn)生“水濕困脾”之證，然后觀察“水濕”的程度(以血肌酐、尿素氮水平為代謝廢物衡量指標(biāo))、與各系統(tǒng)器官(以心、小腸組織為代表)的實(shí)質(zhì)細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)變化，以及“培土制水”法方藥的干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，來闡明“脾惡濕”、“水濕困脾”和“脾制水”與線粒體的相關(guān)性，以期闡明“中醫(yī)藏象脾的實(shí)質(zhì)是線粒體”這一假說中關(guān)于“水濕困脾”證的病理學(xué)本質(zhì)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠32只，由中科院上海動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，清潔級(jí)，體重180-220g。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施為福建中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,清潔級(jí)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物培土制水方顆粒主要包括太子參、白術(shù)、茯苓、山楂、大黃等藥味，原藥材由福建省醫(yī)藥公司購(gòu)買，福建省人民醫(yī)院制劑室進(jìn)行制劑，每克顆粒含原生藥1克。

1.3主要試劑和儀器儀MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；低溫高速離心機(jī)(BECKMAN 64R,美國(guó))；全自動(dòng)生化分析儀(BECKMAN-CX5,美國(guó))；透射電鏡(日立Hu-12A，日本)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物造模及實(shí)驗(yàn)分組32只SD雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，隨機(jī)分為手術(shù)組24只、假手術(shù)組8只，手術(shù)組大鼠行5/6腎切除術(shù)，假手術(shù)組按上述手術(shù)程序進(jìn)行，但不切除腎臟。手術(shù)組在術(shù)后1個(gè)月按隨機(jī)分組原則分成培土制水方大、小劑量治療組和模型組，每組各8只。

2.2藥物治療培土制水方大、小劑量組分別予以喂服培土制水方20g/kg·d、10g/kg·d，以蒸餾水2.5mL溶解喂服，模型組和假手術(shù)組喂服蒸餾水2.5mL/d。各組喂服2個(gè)月后，分別取材，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)及電鏡觀察。

2.3標(biāo)本取材及處理、血：內(nèi)眥靜脈叢取血4mL，靜置，2000r/min離心10min，取血清于EP管中備用。心、小腸組織：在采集血標(biāo)本后迅速采集，用4℃的1.5%多聚甲醛-3%戊二醛-0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液固定后再切成1×1×1 mm3的小塊，置于電鏡固定液的瓶中保存，備做電鏡檢查。

2.4觀察項(xiàng)目和檢測(cè)方法

2.4.1Scr、BUN、MDA、SOD檢測(cè)檢測(cè)腎功能指標(biāo)Scr、BUN及氧化損傷指標(biāo)MDA、抗氧化損傷指標(biāo)SOD。黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)S0D，硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法檢測(cè)MDA，尿酶法檢測(cè)BUN，速率法檢測(cè)Scr。

2.4.2電鏡觀察電鏡取材標(biāo)本置于4℃的固定液(同前)前固定4h后，用1%鋨酸后固定1.5h，梯度丙酮脫水后，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡(日立Hu-12A型)進(jìn)行觀察。

3統(tǒng)計(jì)方法

4結(jié)果

4.1各組Scr、BUN、MDA、SOD比較模型組與假手術(shù)組相比，腎功能指標(biāo)明顯升高，符合CRF造模的結(jié)果，且MDA明顯升高，SOD明顯降低；培土制水方大、小劑量組分別與模型組相比，腎功能指標(biāo)明顯下降，顯示藥物干預(yù)后大、小劑量治療組均有治療作用，且MDA明顯降低，SOD明顯升高。見表1。

±s)

注：與模型組比較＊P<0.05,＊＊P<0.01。

4.2電鏡觀測(cè)各組心肌、小腸超微結(jié)構(gòu)變化

4.2.1心肌(1)模型組：可見多數(shù)心肌細(xì)胞的肌絲肌節(jié)整齊且Z帶清晰，較少量的心肌細(xì)胞見輕度水腫且肌絲排列扭曲、稀疏，肌原纖維的間隙增大，少數(shù)心肌細(xì)胞呈局灶性溶解壞，少數(shù)肌質(zhì)網(wǎng)見擴(kuò)張，線粒體體積增大、腫脹明顯，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)心肌細(xì)胞間質(zhì)。見圖1。(2)培土制水方治療組：和模型組比較，超微結(jié)構(gòu)形態(tài)較好，絕大多數(shù)的心肌細(xì)胞肌絲肌節(jié)整齊且Z帶清晰，較少的心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫，極少數(shù)心肌細(xì)胞呈局灶性溶解壞死。肌質(zhì)網(wǎng)及線粒體無明顯改變，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)心肌細(xì)胞間質(zhì)。見圖2。

4.2.2小腸(1)模型組：可見小腸粘膜的上皮層比較完整，大多數(shù)小腸柱狀上皮細(xì)胞微絨毛排列較規(guī)則，少數(shù)柱狀上皮細(xì)胞微絨毛見缺失，粘膜層可見浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞，數(shù)量較多的線粒體體積增大、腫脹明顯，及其基質(zhì)內(nèi)電子致密顆粒減少。見圖3。(2)培土制水方治療組：與模型組比較，小腸粘膜的上皮層完整，無潰瘍、糜爛。柱狀上皮細(xì)胞排列規(guī)則，粘膜層偶見少量浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞。多數(shù)上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體形態(tài)正常，極少數(shù)線粒體見輕度腫脹、嵴減少，及其基質(zhì)內(nèi)電子致密顆粒減少。見圖4。

圖1　模型組：心肌膜下肌絲溶解，個(gè)別線粒體腫脹(×10000)

圖3　模型組：小腸線粒體腫脹(×7000)

5討論

5.1慢性腎功能衰竭(Chronic Renal Failure, CRF)與“水濕困脾”證腎臟的基本功能之一是對(duì)水液(包括代謝廢物、水及電解質(zhì))的代謝調(diào)節(jié)。當(dāng)慢性腎臟疾病導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)持續(xù)損害、健存腎單位的數(shù)目不足以維持正常的水液代謝時(shí)，就進(jìn)入了CRF的失代償期，其直接后果是導(dǎo)致了各種代謝廢物無法通過腎臟排出體外，而在體內(nèi)大量潴留。在CRF的尿毒癥期，有明顯的水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂，體內(nèi)有200多種潴留的物質(zhì)，其中許多是具有生物活性的有毒化合物(尿毒癥毒素)，通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)全身，引起全身多系統(tǒng)、多臟器的形態(tài)學(xué)損害和機(jī)能障礙，但其毒素致病機(jī)理尚未完全闡明。

中醫(yī)有“脾制水”和“脾惡濕”的理論，如《素問·至真要大論》說：“諸濕腫滿，皆屬于脾?！眳菎嬙凇夺t(yī)方考》中說：“濕淫于內(nèi)者，脾土虛弱不能制水而濕內(nèi)生也?！薄毒霸廊珪つ[脹》指出：“蓋水為至陰,故其本在腎……水唯畏土，故其制在脾?！庇衷啤敖衿⑻搫t土不制水而反克?！敝嗅t(yī)理論認(rèn)為，當(dāng)津液無法正常運(yùn)化而潴留時(shí)，就形成病理產(chǎn)物“水濕痰飲”；其聚于身體局部的為“痰”為“飲”，彌漫周身者為“水”為“濕”。因此，按照中醫(yī)理論，這些潴留在體液內(nèi)的代謝廢物(即所謂的尿毒癥毒素)，就是“水濕”之邪，而尿毒癥毒素引起全身各系統(tǒng)的損害和功能障礙、代謝障礙所表現(xiàn)出來的身體困重?zé)o力、納少便溏等臨床癥狀，按中醫(yī)辨證屬“水濕困脾”證。

5.2“藏象假說”線粒體是中醫(yī)藏象“脾”的微觀實(shí)質(zhì)[1-5]

5.2.1中醫(yī)藏象實(shí)質(zhì)的細(xì)胞生物學(xué)假說2002年筆者提出了“藏象假說”[1-2]，指出藏象的本質(zhì)是在細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，中醫(yī)“五藏”的微觀實(shí)質(zhì)是細(xì)胞的五個(gè)不同功能系統(tǒng)，對(duì)應(yīng)為五個(gè)不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即中醫(yī)之“心”-離子通道，中醫(yī)之“肝”-配體-受體-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，中醫(yī)之“脾”-線粒體，中醫(yī)之“肺”-細(xì)胞膜，中醫(yī)之“腎”-染色體。

5.2.2中醫(yī)藏象中“脾”的微觀實(shí)質(zhì)是線粒體線粒體是細(xì)胞氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場(chǎng)所，線粒體的三羧酸循環(huán)是三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(糖類、脂類、蛋白質(zhì))分解的共同途徑和最終通路。機(jī)體從消化系統(tǒng)(中醫(yī)之“胃腑”)攝入的三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(中醫(yī)之“水谷精微”)，通過線粒體的氧化磷酸化合成能源物質(zhì)ATP(中醫(yī)之“氣”),為細(xì)胞乃至機(jī)體提供了能量。這一過程體現(xiàn)了“脾主運(yùn)化”的機(jī)能中最重要的一方面，即營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在線粒體中的生物氧化及產(chǎn)生能量的過程。此外，三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，為細(xì)胞其他合成代謝提供小分子前體，因此，線粒體是細(xì)胞乃至整個(gè)機(jī)體生命活動(dòng)的樞紐和核心。這與中醫(yī)理論認(rèn)為“脾胃為后天之本,氣血生化之源”的認(rèn)識(shí)是一致的。線粒體又是對(duì)體液環(huán)境高度敏感的細(xì)胞器，病變時(shí)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞外液中PH值、滲透壓改變、缺氧及各種毒素等(水濕之邪)，都可能損害線粒體的結(jié)構(gòu)及功能，這又與中醫(yī)“脾惡濕”的特性相契合。

所有代謝旺盛、對(duì)能量需求高的臟器，其組織細(xì)胞內(nèi)都富含有線粒體，如肌肉的收縮、腎小管的重吸收、肝臟參與的物質(zhì)代謝等均要消耗大量能量，相應(yīng)的，這些臟器的組織細(xì)胞(肌細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、肝細(xì)胞)內(nèi)線粒體數(shù)量眾多，這與中醫(yī)理論中“脾主肌肉四肢”、“脾制水”、“脾主運(yùn)化水谷精微”的觀點(diǎn)密切相關(guān)。目前已有學(xué)者[6]從線粒體生物合成中能量代謝方面探討線粒體與“脾主肌肉”相關(guān)性研究，其它方面有待更深入的實(shí)驗(yàn)研究探討。

5.3“水濕困脾”證、“培土制水”法與線粒體

5.3.1“水濕困脾”證與線粒體線粒體是內(nèi)毒素的作用靶位[7-9]，內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機(jī)制中，可見細(xì)胞線粒體內(nèi)源性氧自由基產(chǎn)生增加及其對(duì)線粒體呼吸功能造成氧化損傷，線粒體功能障礙在感染性休克及多器官衰竭的發(fā)生發(fā)展中都起到了重要作用。雖然目前的實(shí)驗(yàn)研究并未闡明內(nèi)毒素和尿毒癥毒素對(duì)機(jī)體具有相同的損傷機(jī)制，然而研究顯示CRF末期也出現(xiàn)自由基的明顯升高[10-11]及組織細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能異常[12-13],作為尿毒癥毒素之一的甲狀旁腺激素(PTH)，能使氧化磷酸化耦聯(lián)分離，并損傷心肌細(xì)胞線粒體[14]。此外，CRF一直都存在水、電解質(zhì)及酸堿平衡失調(diào)，而線粒體是一種對(duì)體液環(huán)境敏感的細(xì)胞器，容易受其變化而出現(xiàn)異常[15]。無論是自由基的增多還是體液穩(wěn)態(tài)的失調(diào)均與細(xì)胞器線粒體有密切的關(guān)系，因此內(nèi)毒素及尿毒癥毒素有可能是同一致病機(jī)理，即尿毒癥毒素可能也是通過無差別地?fù)p害全身組織細(xì)胞的線粒體，從而引起全身多系統(tǒng)的廣泛損傷。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CRF模鼠心和小腸細(xì)胞線粒體出現(xiàn)明顯腫脹，體內(nèi)氧化損傷指標(biāo)MDA升高、抗氧化損傷指標(biāo)SOD下降，顯示自由基清除酶活性下降，自由基生成過多，引起膜不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化及代謝產(chǎn)物MDA增加，且MDA升高的程度與尿素氮、肌酐的水平呈正相關(guān)。血清自由基增多是全身組織細(xì)胞自由基增多的間接表現(xiàn)，因CRF時(shí)腎小管呈高代謝狀態(tài)，而其他組織器官無高代謝，因此可能是由于全身組織細(xì)胞的線粒體氧化磷酸化效率下降，使自由基的產(chǎn)生增多。

因此筆者推測(cè)，線粒體(中醫(yī)之脾)可能是尿毒癥毒素(水濕之邪)的作用靶位。其機(jī)理可能與細(xì)菌內(nèi)毒素的致病機(jī)理相似，即在尿毒癥毒素作用下?lián)p傷了線粒體的功能，使自由基生成過多，進(jìn)而引起線粒體膜或線粒體DNA(mtDNA)氧化損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，而出現(xiàn)全身多系統(tǒng)、多器官病變的表現(xiàn)，表現(xiàn)為“水濕困脾”之證。

5.3.2“培土制水”法與線粒體培土制水方以太子參、白術(shù)、茯苓、生黃芪、陳皮、山楂、大黃、桑椹、當(dāng)歸、玉竹等藥味組成，太子參、白術(shù)、茯苓、生黃芪健脾益氣，陳皮、山楂助脾運(yùn)化，大黃泄脾濁，桑椹、當(dāng)歸、玉竹補(bǔ)脾陰，全方具培土制水之功。

實(shí)驗(yàn)顯示，本方可減輕心和小腸細(xì)胞受尿毒癥毒素的損害，能減少線粒體形態(tài)異常，降低CRF患者血清自由基水平；推測(cè)是因?yàn)楸痉接刑岣呒?xì)胞線粒體氧化磷酸化效率，減少自由基產(chǎn)生的藥理作用，從而起到保護(hù)組織細(xì)胞線粒體，減輕受到尿毒癥毒素?fù)p害的結(jié)果。

研究表明，中藥太子參、黃芪、白術(shù)等均能改善細(xì)胞線粒體的功能，清除氧自由基[16-18]。大黃能延緩慢性腎功能衰竭的進(jìn)展[19]，其藥理機(jī)制就是大黃素、大黃酸等大黃的有效成份影響了線粒體呼吸功能，從而抑制了腎臟高代謝，減少生成自由基，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用[20]。本實(shí)驗(yàn)表明，培土制水方能保護(hù)組織細(xì)胞的線粒體(“培土”)，所以明顯減輕尿毒癥毒素對(duì)心和小腸細(xì)胞及其線粒體的損傷，起到了治療“水濕困脾”證的作用。

5.4小結(jié)中醫(yī)藏象“脾”的微觀實(shí)質(zhì)是線粒體。機(jī)體水液代謝的異常導(dǎo)致組織間隙中的組織液的成份異常，即“水濕”。由于機(jī)體組織細(xì)胞對(duì)組織液的成份高度敏感和依賴，組織液成份的異常導(dǎo)致了組織細(xì)胞線粒體的形態(tài)和功能異常，這就是“水濕困脾”證的病理學(xué)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)表明“培土制水”方能保護(hù)線粒體、改善線粒體形態(tài)和功能，從而達(dá)到治療“水濕困脾”證的療效。

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The Research Between "Water Wet Trapped Spleen" Syndrome and the Mitochondria

LIN Hai-min1, ZHENG Min-lin1, RUAN Shi-wei2, DONG Wei-guo1, XIE Yong-cai1, LI Chang-zheng1

1.InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China;

2.TheAffiliatedPeople'sHospital,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China.

Abstract:Objective:To explore the essence of the TCM "spleen" relationship with the mitochondria by studying the pathological basis of the "water wet trapped spleen" syndrome. Methods：Made Model of the rat of "water wet trapped spleen" syndrome by 5/6 nephrectomy. Randomly divided into model group、High-dose treatment group、Small dose treatment group and Sham operation group. Comparison between groups of Scr、BUN、MDA、SOD of change,Observation the change of ultrastructure of heart and small intestine. Results：Results of Scr、BUN、MDA in High-dose treatment group and Small dose treatment group were lower than model group(P<0.05).Result of SOD higer than model group(P<0.05).Ultrastructure of heart and small intestine in electron microscope showed the most lesions in model group.Part of the mitochondria swollen markedly. The mitochondria morphology of treatment group has no obvious change.Conclusion：Speculated that the granule protected the mitochondria and tissue cells by Reducing the membrane lipid peroxidation and free radicals.To test the theory that TCM "Spleen" micro-substance was cell mitochondria provided the experimental basis.

Key words:Water Wet Trapped Spleen; Strengthening Earth to Control Water; Chronic Renal Failure Uremic Toxins; Mitochondria

收稿日期：(2014-12-25)編輯：王河寶

中圖分類號(hào)：R256.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B