種植模式對土壤酶活性和真菌群落的影響

陳丹梅，陳曉明，梁永江，霍新建，張長華，段玉琪，楊宇虹，袁玲*

(1.西南大學資源環(huán)境學院，重慶400716；2.貴州省遵義市煙草公司，貴州 遵義563000；3.云南省煙草農業(yè)科學研究院，云南 昆明 650031)

種植模式對土壤酶活性和真菌群落的影響

陳丹梅1，陳曉明2，梁永江2，霍新建2，張長華2，段玉琪3，楊宇虹3，袁玲1*

(1.西南大學資源環(huán)境學院，重慶400716；2.貴州省遵義市煙草公司，貴州 遵義563000；3.云南省煙草農業(yè)科學研究院，云南 昆明 650031)

摘要：試驗選擇黔北具有代表性的灰?guī)r黃壤，在實施秸稈還田的基礎上，設置烤煙-小麥(T-W)和烤煙-油菜(T-C)連作，以及烤煙-小麥-玉米(T-W-M)和烤煙-油菜-玉米(T-C-M)輪作處理。利用常規(guī)分析和454-高通量測序，連續(xù)種植10年后研究了不同種植模式對土壤酶和真菌的影響。結果表明，輪作使土壤有機質比起始時增加11.23%~16.06%，微生物量碳、微生物量氮含量提高，土壤脫氫酶活性增強，有益于保持土壤肥力和生產力。輪作顯著提高真菌的18S rDNA序列數(shù)、種類(OTUs)和多樣性指數(shù)，優(yōu)勢度指數(shù)和前20種優(yōu)勢菌株的豐富度之和降低，說明輪作改善了土壤生態(tài)環(huán)境，使之適合多種真菌的繁殖生長，種群數(shù)量增加。多種真菌共同存在，互相制約，可防止病原真菌過度繁殖，抑制病害的發(fā)生。而在連作土壤中，真菌種群數(shù)相對減少，優(yōu)勢種群突出，導致作物真菌病害的發(fā)生幾率增加。此外，在土壤真菌中，子囊菌超過75%。實施不同種植模式10年之后，前20種優(yōu)勢菌株中仍有8株共同存在于各處理的土壤中；在T-C處理的土壤中，這些優(yōu)勢真菌均可在其他3種種植模式之一的土壤中出現(xiàn)。說明土壤環(huán)境與真菌種群結構密切相關，但又因作物種植而變化。

關鍵詞：輪作；連作；土壤酶；真菌

我國土地資源緊缺，連作現(xiàn)象十分普遍。研究發(fā)現(xiàn)，長期連作會導致地力降低、產量和質量下降、病蟲害嚴重發(fā)生等一系列問題。例如，在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)，通常采用一年三熟或兩年五熟的高強度土壤利用模式，并大量施用化肥，導致土壤有機質減少，結構破壞，肥力降低，病害嚴重。西瓜(Citrulluslanatus)根系能分泌酚類物質，產生自毒害作用，降低產量品質。在大豆(Glycinemax)長期連作的土壤中，磷酸酶、脲酶、脫氫酶、蔗糖酶的活性改變，鉬含量和有效性降低，一方面抑制固氮結瘤，另一方面減少開花結夾。在馬鈴薯(Solanumtuberosum)根際土壤中，鐮孢菌引起根腐病，其數(shù)量隨連作年限的延長而遞增。玉米(Zeamays)連作年限不同，根際微生物的數(shù)量、種群結構和多樣性也不一樣，連作時間越長，根際微生物的數(shù)量越少，種群多樣性越低[6-7]。在棉花(Gossypiumspp.)-小麥(Triticumaestivum)輪作的土壤中，微生物量碳、細菌多樣性、G-細菌比棉花連作增加，但G+細菌降低。草原土壤轉化為農業(yè)土壤后，擬桿菌(Bacteriodetes)豐富度提高，但酸桿菌(Actinobacteria)和放線菌(Actinomycetes)降低。此外，烤煙(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopersiconesculentum)和辣椒(Capsicumannuum)連作使土壤養(yǎng)分失衡，微生物群落改變，青枯病和黑脛病大量發(fā)生。而輪作中斷了病原菌寄主，作物病害發(fā)生率顯著低于連作[9-11]。將長期連作馬鈴薯的土壤改種牧草后，土壤真菌/細菌可降低50.72%,說明微生物種群結構從真菌型向細菌型轉化[2]，此外，合理輪作有益于植物修復土壤[13]。由此可見，種植作物對土壤理化和生物學性質的影響十分復雜，因氣候、土壤、作物、耕作、施肥等不同而異。由于種植模式的研究持續(xù)時間長，工作量大，干擾因素多，有關研究尚待深入。

土壤微生物是土壤的重要組成成分，釋放土壤酶，參與有機質降解、腐殖質合成、養(yǎng)分循環(huán)等生物化學過程[14]。此外，土壤微生物與土傳病害發(fā)生密切相關[15]?？緹煛⒂衩?、油菜(Brassicacampestris)和小麥是我國西南地區(qū)重要的經濟、糧食和油料作物，種植方式對土壤養(yǎng)分和微生物群落結構影響的研究較少。為此，本研究選擇貴州省遵義市煙草科技園開展長期定位試驗，利用常規(guī)分析和454-高通量測序技術研究了不同種植模式對土壤養(yǎng)分和真菌種群的影響，為建立科學的種植模式，探索土傳真菌病害發(fā)生機理，保持地力，可持續(xù)利用土地資源提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　試驗地概況

貴州省遵義市煙草農業(yè)科技園位于北緯27°42′，東經106°55′，海拔1030 m。年均溫度13.1℃，平均氣溫1月最低(8.4℃)，8月最高(28.7℃)，年降雨量1300 mm，53%~65%集中于6-9月。試驗開始于2004年，供試土壤為三疊紀石灰?guī)r發(fā)育的典型、具有代表性的黃壤。土壤的(0~15 cm)pH、有機質、有效氮、磷、鉀見表1。

1.2　試驗處理

試驗設置烤煙-油菜連作(T-C)、烤煙-小麥連作(T-W)、烤煙-油菜-玉米輪作(T-C-M)和烤煙-小麥-玉米輪作(T-W-M)4種種植模式。小區(qū)面積6 m×11 m，重復4次，隨機區(qū)組排列?？緹熀陀衩?月初移栽，小麥和油菜秋末播種。收獲小麥、玉米和油菜后，秸稈全部切碎還田。在種植烤煙時，基肥施用900 kg/hm2N∶P2O5∶K2O=9∶9∶24烤煙專用肥，播種時施用500 kg/hm2左右的糞水，移栽后7~10 d和35~40 d分別追施300 kg/hm2(N∶P2O5∶K2O=9∶0∶24)烤煙專用追肥。小麥和油菜分別施用600 kg/hm2(N∶P2O5∶K2O=20∶10∶0)復合肥作為基肥，播種時施用1000 kg/hm2糞水。在種植玉米時，基肥施用600 kg/hm2(N∶P2O5∶K2O=20∶15∶10)復合肥，播種時施用800 kg/hm2糞水，在移栽后40 d左右施用300 kg/hm2尿素。其余同當?shù)卮筇锷a。

1.3　土樣采集與分析

在2013年烤煙旺長期，采集0~20 cm的耕層土壤，揀去雜物，取部分土壤晾干，采用電位法測定土壤pH值；重鉻酸鉀容量法測定土壤有機質；堿解擴散法測定土壤堿解氮；NaHCO3提取法測定土壤有效磷；NH4Ac-火焰光度法測定土壤有效鉀；土壤脫氫酶活性采用TTC比色法測定，酶活性以24 h后1 g土中TPF(三苯基甲月替)的毫克數(shù)表示；脲酶活性用苯酚鈉-次氯酸鈉顯色法測定，酶活性以24 h后1 g土中NH4+-N的毫克數(shù)表示；磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測定，酶活性以24 h后1 g土壤中釋放的酚的毫克數(shù)表示[16-17]。另取部分土壤立即用液氮冷凍，用于測定微生物碳氮量和真菌

表1　不同種植模式對土壤pH、有機質和有效養(yǎng)分的影響

注：在同列中，不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。T-C：烤煙-油菜連作；T-W：烤煙-小麥連作；T-C-M：烤煙-油菜-玉米輪作；T-W-M：烤煙-小麥-玉米輪作。下同。

Note:In each column, different small letters indicate significant differences among systems atP<0.05. T-C:Flue-cured tobacco-canola succession;T-W:Flue-cured tobacco-wheat succession; T-C-M:Flue-cured tobacco-canola-maize rotation; T-W-M: Flue-cured tobacco-wheat-maize rotation. The same below.18S rRNA基因序列。微生物碳氮量用氯仿熏蒸 0.5 mol/L K2SO4提取，K2Cr2O7氧化法測定提取液中微生物碳，靛酚藍比色法測微生物氮[18]。真菌18S rRNA基因測序在上海美吉生物科技有限公司進行。參照454高通量測序方法，提取、擴增、純化、定量和均一化真菌18S rRNA基因，利用Roche Genome Sequencer FLX平臺進行測序[19]。然后，對有效序列進行去雜、修剪、去除嵌合體序列等過濾處理，得到優(yōu)化序列，通過聚類分析形成分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，采用BLAST程序對比GenBank(http://ncbi.nlm.nih.gov)中的已知序列，根據(jù)97%的相似度確定18S rRNA基因序列對應的真菌名稱。

1.4　數(shù)據(jù)處理

利用土壤真菌種類數(shù)(OTUs)和18S rDNA序列數(shù)(Reads)計算土壤真菌的種群特征值，包括多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)等。Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)的計算公式為：H=-∑PilnPi，式中，Pi=Ni/N，Ni為i種真菌的18S rDNA序列數(shù)，N為i種真菌所在門的18S rDNA的序列數(shù)。Pielou均勻度指數(shù)(J)的計算公式為：J=-∑PilnPi/lnS，式中，S為OTUs總數(shù)。Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)的計算公式為：D=1-∑Pi2[20]。真菌豐富度為某種真菌的18S rDNA讀數(shù)占真菌18S rDNA總讀數(shù)的百分數(shù)[21-22]。

采用Excel進行計算，SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性水平為P=0.05。

2結果與分析

2.1　土壤有機質與養(yǎng)分

由表1可知，不同種植模式對土壤pH無顯著影響。與原始土壤相比，T-C-M和T-W-M顯著提高土壤有機質含量，分別增加11.23%和16.06%；T-W顯著降低土壤有效氮，T-C和T-C-M 顯著增加土壤有效磷；4種種植模式均顯著提高土壤有效鉀，但不同種植方式之間無顯著差異。

表2　不同種植模式的土壤中土壤酶活性變化

2.2　土壤酶活性

輪作顯著提高土壤脫氫酶活性，但脲酶和磷酸酶活性因種植模式不同而異(表2)。脫氫酶活性T-W-M>T-C-M>T-W>T-C，高低相差4倍以上。脲酶活性T-W最低，T-C-M最高，在27.30~54.60 mg NH4+-N/(g·24 h)之間。磷酸酶活性T-W-M最高，達到3.14 mg 酚/(g·24 h)，T-C-M顯著高于T-C，后者僅1.24 mg 酚/(g·24 h)。

2.3　微生物生物量

由圖1可見，微生物碳含量T-C-M最高，達到292 mg/kg，T-W-M次之，為222.5 mg/kg，T-W最低，僅163.0 mg/kg，T-C與T-W-M和T-W之間無顯著差異。此外，微生物氮含量的變化趨勢類似于微生物碳含量；微生物碳氮比變化于11.7~13.6，處理之間無顯著差異。

圖1　種植模式對土壤微生物碳氮量的影響Fig.1　Influence of cropping on microbial C and N in soil

2.4　土壤真菌

在T-C、T-W、T-C-M和T-W-M處理的土壤中，454-高通量測序分別獲得了3081，3416，4452和4014個18S rDNA 序列，分別代表221，238，253和271種真菌(OTUs)，分屬于子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)和未知類型 (圖2)。其中，子囊菌門占絕大多數(shù)，超過75%；其次是未知類型，超過15%；壺菌門、擔子菌門和接合菌門合計約占10%。此外，序列數(shù)為1的真菌占60%以上。

圖2　土壤各門真菌所占的比例Fig.2　Proportion of each soil fungi

在連作處理的土壤中，20種優(yōu)勢菌株的豐富度之和顯著超過輪作，前者高達土壤真菌總量的75.19%~80.82%， 后者僅為51.41%~60.27%。 值得注意的是，在20種優(yōu)勢菌株中，尚待鑒定的菌株為6~9株，豐富度累計高達11.40%~24.95%。

由表3可知，在20種優(yōu)勢菌株中，有8種真菌共同存在于4種種植模式的土壤中，它們是待定真菌-1、待定子囊菌-1、待定真菌-2、格胞腔菌目、待定真菌-3、待定真菌-4、待定真菌-5和待定真菌-6。除上述8種共同真菌之外，T-C和T-W之間還有9種真菌相同，它們是隱球菌、待定子囊菌-2、待定子囊菌-3、鐮刀菌、盤菌目-1、火絲菌科-1、小棵囊菌、火絲菌科-2和盤菌目-2；T-C和T-C-M之間還有3種相同，它們是長極鏈格孢菌、黃孢原毛平革菌和待定真菌-7；T-W和T-W-M還有4種相同，它們是枝孢菌、肉坐菌目-1、黃孢原毛平革菌和待定真菌-7。在T-C處理的土壤中，前20種優(yōu)勢真菌均可在其他3種種植模式的土壤中發(fā)現(xiàn)；在T-W的土壤中，菌炭角菌目為獨有真菌；在T-C-M的土壤中，獨有的真菌包括隱球菌屬、待定真菌-9、待定真菌-8和柄孢殼菌等4種；在T-W-M的土壤中，獨有的真菌包括壺菌門和待定子囊菌-4 2種。

表3　在不同輪作土壤中20種優(yōu)勢真菌的豐富度

2.5　真菌群落特征

由表4可見，土壤真菌的多樣性指數(shù)輪作高于連作，T-C-M和T-W-M分別為3.163和3.379，T-C和T-W為2.413和2.785。相反，優(yōu)勢度指數(shù)T-C顯著高于T-C-M，T-W顯著高于T-W-M。此外，均勻度指數(shù)各處理之間無顯著差異。

3討論

實施T-C-M和T-W-M輪作，每年有大量的作物秸稈還田，包括春季的油菜和小麥秸稈，以及秋季的玉米秸稈等。因此，輪作10年后，土壤有機質含量比原始土壤顯著提高，說明即使在高強度種植條件下，實施秸稈還田也能保持土壤肥力和土地生產力，提高作物對養(yǎng)分的利用效率[23]。此外，在烤煙種植過程中，大量施用鉀肥，施用量高達216 kg K2O/hm2，這可能是土壤有效鉀顯著提高的重要原因之一。

表4　種植模式對土壤真菌群落特征的影響

土壤有機質是微生物的碳源和氮源。在實施輪作的土壤中，由于上茬作物秸稈歸還量大，還田秸稈腐解所釋放的有機碳組成具有多樣性，可滿足多種微生物，尤其是異養(yǎng)型微生物-真菌對碳源和養(yǎng)分的多種需要，使微生物量碳氮和真菌18S rDNA序列數(shù)和種類(OTUs)增加，說明輪作促進土壤微生物(包括真菌)的生長繁殖[24]。眾所周知，土壤微生物分泌土壤酶，參與土壤生物化學反應，如有機質分解、腐殖質合成、養(yǎng)分轉化、生物固氮、污染物清除等[14]。因此，土壤微生物量通常與脫氫酶、脲酶和磷酸酶活性呈顯著正相關[25]。在本項研究中，T-C-M和T-W-M顯著提高土壤脫氫酶活性，T-W-M處理的土壤脲酶和磷酸酶活性最高，其原因可能與土壤微生物數(shù)量增加，活性增強，分泌酶較多相關[26]。

子囊菌占土壤真菌的絕大多數(shù)，超過總數(shù)的75%。在前20種已鑒定的優(yōu)勢真菌中，僅1株為結合菌，其余全部為子囊菌。實施不同種植模式10年之后，各處理土壤的前20種優(yōu)勢菌株中仍有8株相同，表明土壤環(huán)境與真菌種群結構密切相關；在T-C處理的土壤中，這些優(yōu)勢真菌均可在其他3種種植模式之一的土壤中出現(xiàn)，說明土壤真菌又因種植作物而改變。需要指出的是，土壤真菌參與土壤有機質礦化，分解進入土壤的作物殘體和有機肥中的有機質，供給植物營養(yǎng)[27]。但是，大多數(shù)真菌同時也為植物病原菌，引起多種真菌病害。例如，子囊菌引起根腐、莖腐、果(穗)腐和枝枯等；鐮刀菌普遍為植物真菌性病害；葡萄肉坐菌幾乎能危害所有果樹，如香蕉蕉腐病、桃樹流膠病等；座囊菌是我國主要的果樹病菌，引起香蕉葉斑病，梨葉斑病，葡萄黑痘病等；鏈格孢菌95%以上兼性寄生于植物，引起多種植物病害，如小麥葉枯病，玉米大斑病，茄子早疫病，白菜黑斑病等；炭角菌廣泛分布于全球各地，在熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為常見，能引起桑、茶、櫟、蘋果根腐病和黑腐病等[28]。

在T-C和T-W連作的土壤中，土壤真菌種類(OTUs)顯著低于T-C-M和T-W-M輪作。20種優(yōu)勢菌株的豐富度之和則相反，說明連作使土壤真菌種群單一化，集中度提高，優(yōu)勢種群突出。土壤真菌群落的特征值也表明，多樣性指數(shù)輪作高于連作，優(yōu)勢度指數(shù)則相反。多樣性指數(shù)表示生物群落中的物種多寡，數(shù)值愈大表示物種越豐富；優(yōu)勢度指數(shù)越大，生物群落內的優(yōu)勢種越突出[29]。因此，在輪作土壤中，真菌種群豐富；在連作土壤中，真菌優(yōu)勢種群突出。生物種群豐富和多樣性指數(shù)高是生態(tài)環(huán)境健康穩(wěn)定的重要表現(xiàn)[30]。因此，輪作改善了土壤生態(tài)環(huán)境，使之適合多種真菌的繁殖生長，種群數(shù)量增加。多種真菌共同存在，互相制約，可防止某些病原真菌過度繁殖，抑制作物病害的發(fā)生。而在連作土壤中，真菌種群數(shù)量相對較少，優(yōu)勢種群突出，故發(fā)生作物真菌病害的幾率提高。因此，輪作可以降低，而連作提高土傳真菌病害的發(fā)生率。

總之，輪作顯著提高了土壤有機質含量、微生物生物量、脫氫酶活性、真菌18S rDNA序列數(shù)、種群數(shù)和多樣性指數(shù)，有益于保持地力，減輕土傳病害。但土壤中有大量的真菌尚待鑒定，已知真菌的生物學特性和功能尚不清楚，尚需繼續(xù)開展有關研究。

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Influence of cropping system on enzyme activities and fungal communities in soil

CHEN Danmei1， CHEN Xiaoming2， LIANG Yongjiang2， HUO Xinjian2， ZHANG Changhua2， DUAN Yuqi3， YANG Yuhong3， YUAN Ling1*

1.CollegeofResourcesandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China； 2.GuizhouZunyiTobaccoCompany，Zunyi563000,China； 3.YunnanTobaccoAgricultureResearchInstitute,Kunming650031,China

Abstract:The influence of different cropping systems on enzyme activities and fungal communities in representative yellow limestone soils in north Guizhou was studied over a period of 10 years in a field experiment. There were 4 cropping systems including flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum)-wheat (Triticum aestivum) without rotation (T-W), flue-cured tobacco-canola (Brassica napus) without rotation (T-C), flue-cured tobacco-wheat-maize (Zea mays) rotation (T-W-M) and flue-cured tobacco-canola-maize rotation (T-C-M). Organic matter, microbial carbon and nitrogen, and dehydrogenase activity were increased significantly in the soil of the rotation systems, with resulting benefits to soil fertility and crop productivity. Rotation also greatly increased the number of 18S rDNA sequence, fungal phylotypes (operational taxonomic units), and the diversity index of the fungal community and reduced dominance index and the sum abundance of the top 20 predominant fungal phylotypes which suggests that rotation improved soil ecosystems. Higher diversity of fungi in soil ecosystems should prevent over reproduction of any single fungal taxon and so inhibit disease spread on a large scale. Conversely, compared with rotation, there were fewer fungal populations and a greater tendency for predominant phylotypes in soils continuously cropped under one system, which could increase the incidence of crop disease. Taxonomically, 75% of soil fungi could be assigned to Ascomycota and eight of 20 predominant fungi were commonly observed in all studied soils. Fungi in soil in the T-C system could be observed in the soils of the other three cropping systems after 10 years of the respective cropping regimes which suggests presence of those fungi is more influenced by soil environment than cropping system.

Key words:rotation; succession; soil enzyme; fungus

*通訊作者

Corresponding author. E-mail:lingyuanh@aliyun.com

作者簡介：陳丹梅(1992-)，女，四川省綿陽人，在讀博士。E-mail:544328279@qq.com

基金項目：遵義市煙草公司(2010ZY)，云南省煙草公司(2013YN11)，國家煙草專賣局(110201302016)和科技部“973”課題(2013CB127405)資助。

*收稿日期：2014-08-20；改回日期：2014-10-08

DOI：10.11686/cyxb20150210

http://cyxb.lzu.edu.cn

陳丹梅， 陳曉明， 梁永江， 霍新建， 張長華， 段玉琪， 楊宇虹， 袁玲. 種植模式對土壤酶活性和真菌群落的影響. 草業(yè)學報， 2015， 24(2)： 77-84.

Chen D M， Chen X M， Liang Y J， Huo X J， Zhang C H， Duan Y Q， Yang Y H， Yuan L. Influence of cropping system on enzyme activities and fungal communities in soil. Acta Prataculturae Sinica， 2015， 24(2)： 77-84.