不同發(fā)育階段視神經(jīng)移植物對橫斷成年大鼠視神經(jīng)再生修復的影響*

何家全 楊忠 蔡文琴

(1.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院神經(jīng)外科， 四川 南充 637000; 2.第三軍醫(yī)大學基礎部組織胚胎學教研室， 重慶 400038)

不同發(fā)育階段視神經(jīng)移植物對橫斷成年大鼠視神經(jīng)再生修復的影響*

何家全1楊忠2蔡文琴2

(1.川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院神經(jīng)外科， 四川 南充 637000; 2.第三軍醫(yī)大學基礎部組織胚胎學教研室， 重慶 400038)

目的 觀察不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)移植物對成年大鼠中樞神經(jīng)損傷再生的影響。方法 將不同發(fā)育階段的視神經(jīng)移植到成年大鼠視神經(jīng)的斷端，并與其自身的坐骨神經(jīng)移植物作對照，運用HE染色、鍍銀染色及神經(jīng)示蹤等方法觀察不同發(fā)育階段大鼠的視神經(jīng)移植物對成年大鼠橫斷視神經(jīng)修復的影響。結果 胚胎18天大鼠視神經(jīng)移植物與坐骨神經(jīng)移植物一樣，在移植到成年大鼠視神經(jīng)后20天，有大量的軸突穿過了移植區(qū)，經(jīng)HRP傷側眼球內(nèi)注射順行示蹤顯示，在視神經(jīng)到達的靶區(qū)上丘出現(xiàn)了陽性標記的神經(jīng)元，但這種現(xiàn)象在出生后大鼠視神經(jīng)移植物的移植后從未見到，但如果移植物愈早，那么成年大鼠視神經(jīng)近側斷端長出的纖維就愈多愈長。結論 在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟少突膠質(zhì)細胞的膜上可能存在著抑制神經(jīng)元突起生長的物質(zhì)，這些物質(zhì)可抑制損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維的再生延長及功能重建。

視神經(jīng)； 移植； 中樞神經(jīng)系統(tǒng)； 損傷再生

離體研究顯示，成熟的少突膠質(zhì)細胞具有抑制神經(jīng)元突起生長的特性，那么在體的情況又如何呢？我們的研究發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠視神經(jīng)不斷發(fā)育成熟，視神經(jīng)內(nèi)成熟的少突膠質(zhì)細胞的數(shù)量也不斷增加。視神經(jīng)為中樞神經(jīng)。因此，我們在建立成年大鼠視神經(jīng)橫斷損傷模型的基礎上，通過將不同發(fā)育階段的視神經(jīng)移植到成年大鼠視神經(jīng)的斷端，并以其自身的坐骨神經(jīng)移植作對照，運用形態(tài)學及神經(jīng)示蹤等方法，觀測橫斷成年大鼠視神經(jīng)的再生修復情況，從一個側面探討少突膠質(zhì)細胞在自體情況下對損傷神經(jīng)元軸突再生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 40只雄性成年Wistar大鼠，清潔2級，體重230～250克，平均分成10組，每組4只，分別用于E18、P0、P3、P5、P8、P15、P20、P90天大鼠視神經(jīng)移植及坐骨神經(jīng)移植和正常對照。每組用兩只不同發(fā)育階段的大鼠作為移植視神經(jīng)的供體。

1.1.2 實驗試劑 辣根過氧化物酶(HRP)，為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 成年大鼠一側視神經(jīng)橫斷移植模型的制作 本模型的制作采用Hausmann等[1]的方法進行，具體操作步驟如下：成年大鼠用0.5%戊巴比妥鈉按40mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于解剖板上,頭皮剪毛后常規(guī)消毒鋪巾,矢狀位正中切開頭皮。小心打開眶板，分離視神經(jīng)。解剖顯微鏡下在球后約2mm處向后縱行切開視神經(jīng)鞘，長約3mm，在鞘內(nèi)將視神經(jīng)橫斷，并剪切除約1～2mm長一段視神經(jīng)，此步驟視移植物而定，如移植胚胎及發(fā)育早期的視神經(jīng)時可只作切斷，而不切除，因為切斷的視神經(jīng)有一定程度的收縮。將預先準備好的移植物縱行放置于視神經(jīng)鞘內(nèi)，斷端互相接觸。鞘切口處用小塊明膠海綿覆蓋，連續(xù)縫合頭皮,清醒后自由喂養(yǎng)。對照組僅作視神經(jīng)切斷，止血后即縫合頭皮。

1.2.2 移植物的準備 不同發(fā)育階段的大鼠碘伏消毒后直接斷頭處死，在解剖顯微鏡下快速分離出視神經(jīng)，并放入含0.6%葡萄糖的滅菌生理鹽水中備用。成年(P90d)視神經(jīng)移植物供體大鼠在斷頭取視神經(jīng)前先于其雙股后部消毒后切取坐骨神經(jīng)。

1.2.3 順行軸突追蹤 成功模型動物用示蹤劑HRP進行順行示蹤。具體步驟如下：動物存活18天后，用0.5%戊巴比妥鈉麻醉，用微量進樣器于移植側眼球內(nèi)注入HRP 10μl，HRP用2%的DSMO配制。留針5分鐘后拔針，并用小紗布塊壓迫眼球30秒鐘以防示蹤劑滲漏，動物清醒后自由喂養(yǎng)。

1.2.4 取材固定及切片 注入示蹤劑后48小時，常規(guī)麻醉，開胸，經(jīng)左心室主動脈插管，剪開右心耳，首先灌入200ml肝素化的PBS，隨后灌入250ml 1%多聚甲醛、2%戊二醛、0.1M PBS(pH7.4)。灌流后的大鼠在4℃冰箱中放置3～4小時后取出全腦及移植側視神經(jīng)，在相應固定液中固定6小時，再轉入25%蔗糖、4%多聚甲醛中浸糖脫水,直至組織下沉至瓶底。行全腦冠狀切片及視神經(jīng)縱行恒冷冰凍切片，片厚為20μm，腦片切下后再入上述固定液中保存?zhèn)溆?，而視神?jīng)切片則貼在預先包被APES的載玻片上，用于組織化學染色。

1.2.5 組織化學染色 HE染色及HRP示蹤顯色按常規(guī)進行。

1.2.6 視神經(jīng)軸突鍍銀染色 采用易家農(nóng)(1986)著《組織學與組織學技術》中介紹的方法。本染色結果新生軸突呈黑色，由于采用灌注軀血固定，背景清晰，對比鮮明。另外，不使用高價的硝酸鈾而直接入氨銀液，染色全過程只需40分鐘左右即可完成，方法較簡便。

2 結果

2.1 非移植對照大鼠橫斷視神經(jīng)軸突的反應 在非移植對照組，解剖標本肉眼可見遠側斷端(腦端)較近側端(眼球端)明顯變細；HE染色可見視神經(jīng)斷端鈍園，為結締組織所包繞(圖1)；鍍銀染色可見斷端只有少量流產(chǎn)再生的軸突(圖2)；HRP示蹤在整個腦組織內(nèi)亦未見有HRP陽性標記的細胞。

圖1 HE染色非移植組，斷端視神經(jīng)被結締組織包繞 ×200

Figure 1 The optic nerve surrounded by connective tissue on the broken stump in nonimplantation group (HE staining, ×200)

圖2 鍍銀染色非移植組，視神經(jīng)斷端有少許再生軸突 ×200

Figure 2 The few regenerated axon on the broken stump in nonimplantation group (silver staining, ×200)

2.2 坐骨神經(jīng)移植對照大鼠的反應 在坐骨神經(jīng)移植組，無明顯肉眼可見的兩視神經(jīng)斷端直徑的變化，HE染色在遠近端橫切面上無明顯的不同；鍍銀染色可見兩斷端間有大量再生的無髓神經(jīng)纖維(圖3)，HRP示蹤可見在上丘部出現(xiàn)了陽性標記的神經(jīng)元(圖4)。

2.3 不同發(fā)育階段視神經(jīng)移植對橫斷視神經(jīng)的影響 在本文視神經(jīng)移植組大鼠均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的兩斷端視神經(jīng)直徑的改變。胎鼠視神經(jīng)移植組可見兩斷端之間形成了瘢痕組織(圖5)，但瘢痕組織中可見較多新生無髓軸突通過(圖6)，HRP示蹤亦可見在上丘部有較多陽性標記的神經(jīng)元(圖7、8)；在P0天視神經(jīng)移植組中，雖可見較多生長較長的新生無髓鞘軸突(圖9)，但HRP示蹤始終未見腦區(qū)內(nèi)有陽性標記的神經(jīng)元；在P3天視神經(jīng)移植組中，可見斷端間新生的軸突較P0天明顯減少，且其排列方向較雜亂(圖10)；到P15天視神經(jīng)移植組，只見視神經(jīng)斷端有少許雜亂生長的軸突。P0天以后視神經(jīng)移植組中，各腦區(qū)內(nèi)均未見HRP陽性標記神經(jīng)細胞。

圖3 鍍銀染色坐骨神經(jīng)移植組，斷端可見大量再生軸突 ×200

Figure 3 The large regenerated axon on the broken stump in implantation group (silver staining, ×200)

圖4 HRP示蹤坐骨神經(jīng)移植組，視神經(jīng)靶區(qū)上丘出現(xiàn)了陽性標記神經(jīng)元 ×400

Figure 4 The positive neuron with HRP tracing in implantation group (×400)

圖5 HE染色胎鼠視神經(jīng)移植組，斷端視神經(jīng)出現(xiàn)瘢痕組織 ×100

Figure 5 The scar tissue on broken stump of optic nerve in implantation group

圖6 鍍銀染色胎鼠視神經(jīng)移植組，斷端視神經(jīng)間有大量再生的神經(jīng)纖維通過 ×200

Figure 6 The regenerative nerve fibers at broken stump of optic nerve in implantation group

圖7 HRP軸突示蹤胎鼠視神經(jīng)移植組，示蹤劑到達靶區(qū)上丘 ×40

Figure 7 The tracer in superior colliculus in implantation group (×40)

圖8 HRP軸突示蹤胎鼠視神經(jīng)移植組，示蹤劑到達靶區(qū)上丘×400

Figure 8 The tracer in superior colliculus in implantation group (×400)

圖9 鍍銀染色新生大鼠視神經(jīng)移植組，斷端視神經(jīng)可見生長較長的神經(jīng)纖維 ×200

Figure 9 The nerve fibers at broken stump of optic nerve of neonate rat

圖10 鍍銀染色出生3天大鼠視神經(jīng)移植組，斷端視神經(jīng)可見再生纖維明顯減少 ×200

Figure 10 The nerve fibers at broken stump of optic nerve of rat 3 days after birth deceased

3 討論

3.1 關于視神經(jīng)損傷移植模型 視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖維束因其纖維來源比較單一，結構也比較簡單，它是由視網(wǎng)膜節(jié)細胞發(fā)出的軸突和屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成，不含神經(jīng)元，在活體上很容易進入，可行神經(jīng)解剖追蹤。另外，視神經(jīng)還是唯一可以接受實驗性處理而又不會直接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)其它部分的中樞神經(jīng)。自Vaughn等(1970)建立了視神經(jīng)的橫斷損傷模型以來，由于其操作方便，對周圍組織損傷小，視神經(jīng)暴露較好，動物死亡極少，很快這一模型便被廣泛應用于研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、變性與再生[2,3]。在本實驗中成功運用這一模型，取得了良好的效果。

3.2 對本實驗中所用檢測方法的評價 在本實驗中，我們采用了常規(guī)組織化學及HRP順行軸突示蹤來了解在不同移植條件下，橫斷成年大鼠視神經(jīng)的變化情況。HE染色可以了解組織的大體形態(tài)及組織成分的相互毗鄰關系；組織化學的方法是根據(jù)某些組織內(nèi)所特有的化學物質(zhì)(如某些酶類)在一定條件下所出現(xiàn)的呈色反應從而確定某種成份的存在。本實驗所用的方法較好地顯示了視神經(jīng)斷端新生的無髓神經(jīng)纖維，這些纖維有人在脊髓中用電鏡證實為再生的纖維[4]。用HRP順行示蹤，通過觀察視神經(jīng)到達靶區(qū)神經(jīng)元的標記情況，間接地了解不同移植物對橫斷大鼠視神經(jīng)軸突再生的影響。

3.3 不同移植物對橫斷成年大鼠視神經(jīng)軸突再生的影響 本實驗結果顯示，橫斷成年大鼠的視神經(jīng)在未接受外來移植物時其遠端視神經(jīng)出現(xiàn)萎縮變細，極少有新生的軸突。周圍神經(jīng)移植后，可見斷端內(nèi)有大量新生的神經(jīng)纖維，HRP示蹤在視神經(jīng)的靶區(qū)上丘出現(xiàn)了陽性標記的神經(jīng)細胞。胎鼠視神經(jīng)移植，盡管在兩斷端間形成了瘢痕組織，但瘢痕組織中卻有較多新生的神經(jīng)纖維通過，這些纖維也使該組大鼠的上丘得到了陽性標記的神經(jīng)細胞。不幸的是，出生后的視神經(jīng)移植物雖然都能在一定程度上促進視神經(jīng)軸突的生長，但始終未見有視神經(jīng)靶區(qū)神經(jīng)細胞的標記，只是在纖維生長數(shù)量與長度上，移植發(fā)育愈早的視神經(jīng)，其斷端新生的纖維數(shù)量愈多，長度愈長。這些結果說明，不同的移植物能影響成年大鼠橫斷視神經(jīng)斷端的生長情況。

3.4 不同移植物對橫斷視神經(jīng)軸突生長影響的意義 先前的研究顯示，成年動物的腦和脊髓在損傷后，其軸突不能再生以建立正常的連接。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的視神經(jīng)，損傷后絕大部分軸突斷裂的神經(jīng)元會死亡，存活神經(jīng)元也不能再生其軸突。然而后來大量研究顯示，通過改變損傷區(qū)的組織環(huán)境，成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷軸突的再生能力會大大增強，甚至重建功能[5]。其中周圍神經(jīng)移植物刺激中樞神經(jīng)纖維的再生已得到了幾乎所有實驗研究一致的認同,本實驗用其作為對照也不例外，并在視神經(jīng)支配的靶區(qū)得到了陽性標記的神經(jīng)細胞。本實驗結果提示，發(fā)育早期的視神經(jīng)具有較強的刺激中樞神經(jīng)纖維再生的能力，而且發(fā)育視神經(jīng)的這種能力隨著視神經(jīng)的不斷發(fā)育成熟而逐漸喪失。我們早先的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育早期的視神經(jīng)內(nèi)主要以星形膠質(zhì)細胞為主，而出生后則很快就以少突膠質(zhì)細胞為主。因此，我們不禁要問，不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)內(nèi)的這種變化與它們對橫斷視神經(jīng)的作用關系究竟說明了什么呢？

3.4.1 星形膠質(zhì)細胞與軸突的再生 Smith等(1990)認為，在星形膠質(zhì)細胞的分化過程中可產(chǎn)生能刺激軸突生長的物質(zhì)，其中包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)很少的細胞外基質(zhì)蛋白及鹼性成纖維細胞生長因子等。發(fā)育愈成熟的視神經(jīng)其刺激軸突再生的能力愈弱，這與視神經(jīng)在由幼年到成年的過程中星形膠質(zhì)細胞內(nèi)存在的這些刺激物質(zhì)逐漸減少有關。正是由于發(fā)育視神經(jīng)的這種變化，才導致了其刺激軸突再生能力的變化[6]，本實驗結果似乎可以說明這一點。我們有研究顯示(資料待發(fā)表)，成熟的視神經(jīng)中星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量非常少，而大鼠橫斷的視神經(jīng)處可出現(xiàn)增生的星形膠質(zhì)細胞，它是組成膠質(zhì)瘢痕的重要成分[7]。在離體研究中，我們也看到了星形膠質(zhì)細胞對軸突生長的機械性阻擋作用。然而在本實驗中，胎鼠視神經(jīng)移植后20天，雖在兩斷端間形成了瘢痕組織，但其中仍可見大量新生的軸突通過，并在其靶區(qū)出現(xiàn)了陽性標記的神經(jīng)元，這些事實均說明，膠質(zhì)瘢痕對軸突生長的阻擋作用也不是絕對的。

3.4.2 少突膠質(zhì)細胞與軸突的再生 本研究結果顯示，隨著視神經(jīng)的發(fā)育成熟，其中的少突膠質(zhì)細胞也在不斷的分化成熟，它能明顯地抑制軸突的生長。因此，視神經(jīng)內(nèi)成熟少突膠質(zhì)細胞數(shù)量的增加勢必加重對軸突生長的抑制作用。在本實驗中，橫斷視神經(jīng)不見明顯的軸突再生，而且移植較成熟的視神經(jīng)時，其促軸突再生能力較胚胎期視神經(jīng)也顯著減弱，從另一個角度也說明少突膠質(zhì)細胞參與了抑制神經(jīng)纖維的再生延長?，F(xiàn)在有關少突膠質(zhì)細胞抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的生長及再生已得到了越來越多的神經(jīng)科學工作者的承認，對于其抑制軸突再生的特性人們也正在尋找對策，希望能最大限度地促進中樞神經(jīng)軸突的再生。有研究顯示，直接應用少突膠質(zhì)細胞毒性物質(zhì)可促進損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的再生并重建功能[8]。

少突膠質(zhì)細胞抑制軸突的生長依賴于少突膠質(zhì)細胞所產(chǎn)生的軸突生長抑制因子，它們包括鞘相關軸突生長抑制物NI-35/250(neurite growth inhibitor)、少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白OMgp(oligodendrocyte-myelin glycoprotein)和鞘相關糖蛋白MAG(myelin-associated glycoprotein)[9]，通過敲除編碼這些物質(zhì)的基因，損傷的小鼠脊髓出現(xiàn)了軸突再生及功能重建。

4 結論

本研究結果顯示，在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟少突膠質(zhì)細胞的膜上可能存在著抑制神經(jīng)元突起生長的物質(zhì)，這些物質(zhì)可抑制損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維的再生延長及功能重建。

[1] EHausmann B, Sievers J, Hermanns J,etal. Regeneration of axons from the adult rat optic nerve influence of fetal brain grafts laminin and artificial basement membrane[J]. J Comp Neurol, 1989, 281:447-466.

[2] Butt AM,Kirvell S. Glial cells in transected optic nerves of immature rats Ⅱ An immunohistochemical study[J]. Journal of Neurocytology, 1996, 25:381-392.

[3] Lazarov-Spiegler O, Solomon AS, Schwartz M. Peripheral nerve-stimulated macrophages simulate a peripheral nerve-like regenerative response in rat transected optic nerve[J]. Glia, 1998,24(3):329-337.

[4] Keirstead HS, Hughes HC, Blakemore WF. A quantifiable model of axonal regeneration in the demyelinated adult rat spinal cord[J]. Exp Neurol, 1998,151(2):303-313.

[5] Li Y, Field PM, Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells[J]. Science, 1997, 277:2000-2002.

[6] Hasan SJ, Keirstead HS, Muir GD,etal. Axonal regeneration contributes to repair of injured brainstem-spinal neurons in embryonic chick[J]. J Neurosci, 1993, 13:492-507.

[7] Frisen J, Egerotrand AH, Risling M. Spinal axons in central nervoussystem scar tissue are closed related to laminin-immunore active astrocytes[J]. Neuroscience, 1995, 65:293-304.

[8] Cohen A, Sivron T, Duvdevani R,etal. Oligodendrocyte cytotoxic factor associated with fish optic nerve regeneration: implication for mammalian CNS regeneration[J]. Brain Res, 1990, 537:24-32.

[9] Benxiu JI, Lauren CC, Kai LIU,etal. Assessment of functional recovery and axonal sprouting in oligodendrocyte-myelin glycoprotein(OMgp) null mice after spinal cord injury[J]. Mol Cell Neurosci, 2008, 39(2):258-267.

Effects of transplanted optic nerve of different ontogenetic stages on regeneration of axons in the optic nerve of adult rat

HE Jiaquan1，YANG Zhong2，CAI Wenqin2

(1.DepartmentofNeurosurgery,NanchongCentralHospital，Nanchong637000,Sichuan;2.DepartmentofHistologyandEmbryology,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To explore the effects of transplanted optic nerve of different ontogenetic stages on the regeneration of axons in the optic nerve of adult rat. Methods The implants of optic nerve in different ontogenetic stages were transplanted into the gap of transected optic nerve of adult rat, while the sciatic nerve as a control; HE staining, silver staining and nerve tracing were used to detect the axon regeneration of optic nerve in adult rats. Results The same as the sciatic nerve implants, a lot of axons got through the gap of transected optic nerve of adult rat 20 days later in the group that the optic nerve implants of embryonic day 18 rat were grafted， and the HRP nerve tracing demonstrated that the tracer got to the colliculus superior which is the target of optic nerve, but such a situation was never observed in the implantations of other ontogenetic stage of optic nerve graft, the younger the grafts, the more the neurite of optic nerve stump of the adult rat and the longer that extended . Conclusion Some neurite growth inhibitors must attach to oligodendrocyte from the CNS of rat, they can inhibit the neurite regeneration and functional reestablishment of injured CNS nerve fibers.

Optic nerve； Transplantation； Central nervous system; Regeneration

全軍九五重點攻關課題(96M090)

R-33

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.06.002

2014-07-24； 編輯： 母存培)

通迅作者：蔡文琴，Tel:65318230