PFOS暴露對秀麗線蟲壽長的影響及其與IIS相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)

李　丹，　武婧軒，　李　嘉,2，　何德富,2

(1. 華東師范大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上?！?00241；

2. 華東師范大學(xué) 上海市城市化生態(tài)過程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?！?00241)

PFOS暴露對秀麗線蟲壽長的影響及其與IIS相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)

李丹1，武婧軒1，李嘉1,2，何德富1,2

(1. 華東師范大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200241；

2. 華東師范大學(xué) 上海市城市化生態(tài)過程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241)

摘要：以秀麗隱桿線蟲(C.elegans)為模型，本文研究了全氟辛烷磺酸(PFOS)對機(jī)體壽長的影響及初步機(jī)理.結(jié)果顯示0.2~200 μmol/L的PFOS暴露50 h導(dǎo)致野生型秀麗線蟲壽長呈劑量依賴性縮短.在4類轉(zhuǎn)基因線蟲上，觀察到Insulin/IGF-l.1信號通路(IIS)相關(guān)的daf-16、daf-2和age-1基因突變或敲除能影響線蟲的壽長.進(jìn)一步觀察PFOS暴露導(dǎo)致4類轉(zhuǎn)基因線蟲的壽長變化率，并與野生型線蟲比較.在CF1139和CF1580突變種上daf-16或daf-2的突變均未改變PFOS的縮短壽長效應(yīng).而在CF1295和TJ1052轉(zhuǎn)基因型上發(fā)現(xiàn)daf-16b的基因敲除或age-1基因突變阻斷PFOS的減壽效應(yīng).結(jié)果表明PFOS慢性暴露能加速動物衰老，縮短壽長.PFOS作用與IIS信號通路關(guān)系密切，daf-16b和age-1基因在其中起重要作用.

關(guān)鍵詞：PFOS；秀麗隱桿線蟲；壽長；Insulin/IGF-l.1信號通路；daf-16b；age-1

第一作者：李丹，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境污染與健康.

0引言

全氟辛烷磺酸(perfluorooctanesulphonate，PFOS)是重要的全氟有機(jī)化合物和主要代謝產(chǎn)物[1].因高表面活性和疏水疏油等特性，PFOS作為原料被大量用于表面防污劑、材料涂層、清洗劑、食品包裝等各類工業(yè)及生活用品中[2].大量研究表明PFOS具有環(huán)境持久性和生物累積性，被認(rèn)為是一種新型的持久性有機(jī)污染物.目前PFOS的污染足跡已遍布全球生態(tài)系統(tǒng)，并對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅.雖然歐盟、美國、日本等發(fā)達(dá)國家已經(jīng)限制了PFOS的使用，但目前世界上仍有許多國家生產(chǎn)和使用PFOS.

檢測結(jié)果顯示在大氣、水、土壤、沉積物等多種環(huán)境介質(zhì)中均已檢測到PFOS存在.在我國沈陽市降雪中的PFOS濃度平均值范圍在0.4~46.2 ng/L之間[3].長江三峽水域個別水域PFOS含量高于10 ng/L[4].美國6個城市中心廢水中PFOS濃度為 0.04~5.29 μg/L[5].美國職業(yè)人群血液中PFOS的平均濃度為1046 μg/L，而非職業(yè)人群為 11.6 μg/L[6].PFOS可以通過食物攝入、空氣吸入、皮膚吸收等多種途徑進(jìn)入機(jī)體[7]，在人體血液中的半衰期長達(dá)5.4年[8].大量毒理學(xué)研究顯示PFOS對肝、心腦血管、胚胎、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多部位產(chǎn)生毒性效應(yīng).如PFOS干擾正常的脂質(zhì)代謝，對肝臟有氧化損傷作用[9]；降低動物精細(xì)胞活力，減少精子數(shù)量，增加精子畸形率[10]；PFOS延遲幼齡動物的生長發(fā)育，影響記憶功能[11].然而PFOS長期暴露是否能加速衰老，對動物的壽長產(chǎn)生影響尚未見報道.

秀麗線蟲(C.elegans)是一種新型模式生物，具有適合衰老和壽長研究的多種優(yōu)勢.如個體小，生命周期短，繁殖能力強(qiáng).超過40%基因與人類基因同源，因而相關(guān)結(jié)果可以外推到高等動物和人體，以評價環(huán)境污染物的健康風(fēng)險.本文運(yùn)用N2型秀麗線蟲和4種基因缺陷型的轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲進(jìn)行PFOS的慢性暴露，觀察和比較壽命長度的變化.研究目的是觀察PFOS暴露對秀麗線蟲壽長的影響，并分析其與胰島素信號通路(Insulin/IGF-l.1 signaling pathway, IIS)相關(guān)基因的關(guān)系.

1材料與方法

1.1　模式生物與主要試劑

秀麗隱桿線蟲(C.elegans)由國際線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center,CGC)提供.野生型為N2型秀麗線蟲.基因缺陷型包括CF1139 [daf-16(mu86)Ⅰ; muIs61][12]，CF1580 [daf-2(e1370)Ⅲ，muIs84][13]，CF1295 [daf16bKO][13]，和TJ1052 [age-1(hx546)Ⅱ][14].利用涂有大腸桿菌OP50的線蟲培養(yǎng)基(nematodegrowthmedium,NGM)培養(yǎng)線蟲，所有線蟲均在20 ℃下恒溫培養(yǎng).

十七氟-1-辛烷磺酸鉀購于美國西格瑪公司，蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、疊氮化鈉(NaN3)、DMSO均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其他化學(xué)藥品及試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2　暴露方法

將PFOS溶解于DMSO中，配制成10mmol/L的儲備液，用大腸桿菌OP50分別稀釋至200μmol/L, 20μmol/L，2μmol/L，0.2μmol/L，助溶劑DMSO濃度小于1%.吸取50μL溶液，加于測定壽命用的NGM培養(yǎng)基六孔板上，每一個濃度設(shè)置3個平行樣，記錄其濃度與順序.空白組吸取50μL大腸桿菌OP50溶液涂布.在室溫中放置至干透，然后轉(zhuǎn)到20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，過夜后即可使用.暴露時選擇同步化的L1期線蟲，并持續(xù)暴露50h，完成一個生命周期.吸取50~100條線蟲于一個PFOS暴露用板孔中，以少量水沖散抱團(tuán)線蟲，并保持培養(yǎng)基表面干燥，放入恒溫培養(yǎng)箱中20 ℃培養(yǎng).

1.3　壽長統(tǒng)計

PFOS暴露期結(jié)束后，將暴露的線蟲轉(zhuǎn)移到六孔板NGM培養(yǎng)皿，平均一個孔板轉(zhuǎn)移30~40條為宜.此日記錄為0d，放入恒溫培養(yǎng)箱中20 ℃培養(yǎng)，并隔日記錄線蟲存活數(shù).6d左右轉(zhuǎn)移一次六孔板，防止雜菌對壽命產(chǎn)生影響.在轉(zhuǎn)移過程中要注意丟失的線蟲，或者爬到孔板壁上死亡的線蟲，以及因?yàn)槊咕劳龅木€蟲，從最初的計數(shù)中排除[15].實(shí)驗(yàn)中，判斷線蟲死亡的標(biāo)準(zhǔn)為在低倍顯微鏡下，對機(jī)械刺激沒有反應(yīng)，于高倍顯微鏡觀察下不進(jìn)食.

1.4　統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示.運(yùn)用SPSS軟件的單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，以p<0.05 或p<0.01，表示差異顯著.

2結(jié)果

2.1　PFOS慢性暴露導(dǎo)致野生型秀麗線蟲壽長縮短

0.2、2、20、200μmol/LPFOS對N2型秀麗線蟲暴露50h后，觀察PFOS對線蟲存活率和壽長的影響.結(jié)果顯示PFOS暴露組存活率曲線均在對照組之下，呈濃度依賴性的漸次下降趨勢(見圖1A).進(jìn)一步分析顯示PFOS暴露導(dǎo)致線蟲的平均壽長明顯縮短，各暴露組較對照組均有顯著性差異(見圖1B).特別是200μmol/L高濃度暴露組，平均壽長較對照組降低了47.1%，最長壽命也較對照組降低了約30%(18.67dvs24d)，反映PFOS較強(qiáng)的減壽效應(yīng).

2.2　IIS通路相關(guān)基因缺陷影響秀麗線蟲壽長

本文進(jìn)一步在秀麗線蟲上觀察IIS通路相關(guān)基因缺陷是否影響壽長.結(jié)果顯示基因缺陷型CF1580、CF1295與CF1139線蟲的存活率曲線均位于野生型N2線蟲的下方；TJ1052基因缺陷型存活率曲線位于N2線蟲上方(見圖2A).統(tǒng)計分析得出CF1580、CF1295和CF1139線蟲平均壽長較N2型顯著性縮短，TJ1052型則顯著延長(見圖2B).群體最長壽命觀察顯示，TJ1052最長壽命為27.33d，比N2型長25%.而CF1580、CF1295和CF1139型線蟲最長壽命均明顯縮短.結(jié)果表明CF1580、CF1295和CF1139型線蟲相關(guān)基因缺陷導(dǎo)致減壽效應(yīng)，而TJ1052型線蟲基因敲除導(dǎo)致增壽效應(yīng).

注：(A) PFOS暴露對秀麗線蟲存活率的影響；(B) PFOS暴露對秀麗線蟲平均壽長影響

注：(A)N2型和CF1580、CF1295、CF1139、CF1139基因缺陷型線蟲存活率曲線；

2.3　PFOS慢性暴露對IIS通路相關(guān)基因缺陷型秀麗線蟲壽長的影響

在IIS通路相關(guān)基因缺陷型CF1580、CF1295、CF1139、CF1139線蟲上，進(jìn)一步觀察PFOS慢性暴露對壽長的影響效應(yīng).結(jié)果如圖3所示，PFOS導(dǎo)致CF1580和CF1139線蟲的存活率曲線均較對照組下移(見圖3A，B)，并呈一定的劑量依賴效應(yīng)，其變化與在N2型秀麗線蟲觀察到的效應(yīng)類似.統(tǒng)計結(jié)果顯示PFOS導(dǎo)致CF1580和CF1139線蟲的平均壽長均顯著縮短(見圖3E)，這表明CF1580和CF1139線蟲的相關(guān)基因缺陷未影響PFOS的縮短壽長的效應(yīng).而在CF1295和TJ1052基因缺陷型線蟲上，則觀察到不同的效應(yīng).同樣梯度的PFOS暴露后，CF1295和TJ1052線蟲的生存率曲線均與對照組部分重疊(見圖3C和D)，未見明顯位移.統(tǒng)計顯示2 μmol/L和20 μmol/L的PFOS暴露導(dǎo)致CF1295線蟲平均壽長稍有降低，但與對照組未有顯著性差異(見圖3E).在TJ1052線蟲上，3個PFOS暴露組平均壽長較對照均未見明顯變化(見圖3E).這表明CF1295和TJ1052線蟲的相關(guān)基因缺陷明顯影響PFOS的縮短壽長的效應(yīng).

在N2型和IIS通路相關(guān)基因缺陷型線蟲上進(jìn)一步分析0.2，2和20 μmol/L的PFOS暴露后線蟲壽長變化率.結(jié)果如圖3F，圖中紅色越深的部分表示變化率越高，即該品種對此濃度的PFOS暴露敏感，而色度越偏藍(lán)則變化率越低，即該品種對此濃度的PFOS暴露不敏感.N2品種對于PFOS的暴露敏感程度最高，CF1580和CF1139線蟲的敏感與N2基本一致，只是高濃度暴露組稍有下降.圖中藍(lán)色區(qū)域?qū)?yīng)的CF1295與TJ1052兩個品種則對PFOS暴露敏感程度低，壽長幾乎不受PFOS暴露影響.

注：(a)-(d)PFOS暴露分別對CF1139型(a)、CF1580型(b)、CF1295型(c)和TJ1052型(d)線蟲存活率的影響；

3討論

作為新型持久性污染物，PFOS在生物體內(nèi)的蓄積能力強(qiáng)于多氯聯(lián)苯和有機(jī)氯農(nóng)藥等經(jīng)典有機(jī)污染物[16]，其可能的生態(tài)風(fēng)險與健康危害引起了廣泛關(guān)注.本文結(jié)果顯示PFOS低濃度慢性暴露導(dǎo)致野生型秀麗線蟲平均壽長和最長壽命均顯著縮短，這表明PFOS較強(qiáng)的減壽效應(yīng).雖然PFOS的多種毒理學(xué)效應(yīng)已有研究，其對動物壽長的影響尚屬首次報道.本文暴露的最低效應(yīng)濃度為0.2 μmol/L(107.4 μg/L)，雖然比環(huán)境相關(guān)濃度高1—2個數(shù)量級.但考慮到PFOS在生物體內(nèi)較強(qiáng)的聚積效應(yīng)，如魚類對PFOS的濃縮倍數(shù)為500~12 000倍[17].另外PFOS在人類血清中的半衰期長達(dá)5.4年[8].這表明本文使用的低濃度PFOS暴露導(dǎo)致動物衰老加快和壽長縮短，對機(jī)體健康具有明顯的風(fēng)險.

進(jìn)一步研究顯示daf-2突變的CF1580型、daf16b敲除的CF1295型，和daf-16突變的CF1139型線蟲壽長顯著縮短，age-1突變的TJ1052型線蟲壽長則顯著延長.以往研究顯示Insulin/IGF-l.1信號通路的參與機(jī)體發(fā)育、代謝、生殖等多種功能[18,19].IIS通路上主要包括胰島素受體daf-2基因、胰島素受體底物IRS-1基因、哺乳動物PIK3同源基因age-1、轉(zhuǎn)錄因子daf-16、腫瘤抑制因子PTEN同源物daf-18基因等[19-21].本文研究與相關(guān)研究相互印證，表明IIS信號通路相關(guān)的age-1、daf-2、daf-16基因與新陳代謝、免疫及應(yīng)激反應(yīng)等多種功能調(diào)控有關(guān)，從而與線蟲的壽長關(guān)系密切.

我們進(jìn)一步觀察PFOS暴露導(dǎo)致IIS信號通路相關(guān)基因突變型線蟲壽長變化率，及其與野生型線蟲上觀察的差異.結(jié)果在CF1139和CF1580突變種上發(fā)現(xiàn)daf-16的突變或daf-2的突變均未改變PFOS的縮短壽長效應(yīng).而在CF1295和TJ1052轉(zhuǎn)基因型上發(fā)現(xiàn)daf-16b的基因敲除或age-1基因突變能阻斷PFOS對線蟲的減壽效應(yīng).這表明DAF-16B和AGE-1蛋白在PFOS誘發(fā)線蟲衰老加快和壽長縮短中起到重要作用.PFOS暴露影響動物衰老和壽長可能涉及到胰島素信號、飲食限制和氧化損傷的多種因素，深入機(jī)制尚需進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯張晶)

Effects of PFOS exposure on lifespan inC.elegansand their relations with IIS genes

LI Dan1,2,WU Jing-xuan1,2,LI Jia1,2,HE De-fu1,2

(1.SchoolofEcologicalandEnvironmentalSciences,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China;

2.ShanghaiKeyLabforUrbanEcologicalProcessesandEco-Restoration,

EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China)

Abstract:Using a model of C.elegans, this study aims to investigate the effect of PFOS on the lifespan and its mechanisms. Results showed that 0.2~200 μmol/L PFOS shortened the lifespan of wild type wormsin a concentration-dependent manner after 50 h exposure.In four transgenic strains, mutation of daf-16, daf-2 and age-1 which are related to Insulin/IGFl.1pathway(IIS), could affect the lifespans of nematodes. We further observed lifespan change rates of the four transgene C.elegans after exposed to PFOS.Results showed that mutation of daf-16 or daf-2 did not alter PFOS-induced effects of shortening lifespan in CF1139 and CF1580 strain.However, knockout of daf-16b or mutation of age-1blocked PFOS-induced effects of shortening lifespan in CF1295 and TJ1052 strain. Our results suggested that PFOS could accelerate aging and shorten the lifespan of nematodes. PFOS-induced effects are closely relative with IIS signaling pathways, in which daf-16b and age-1 play important roles.

Key words:PFOS;C.elegans;lifespan;IIS signaling pathway;daf-16b;age-1

通信作者：何德富，男，博士，副教授，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)、環(huán)境與健康等. E-mail: dfhe@des.ecnu.edu.cn.

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)(2013ZX07310-001-04)；上海市自然科學(xué)基金(11ZR1410500)；河口海岸國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLEC-KF201311)

收稿日期：2014-09

中圖分類號：X592

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1000-5641.2015.02.013

文章編號：1000-5641(2015)02-0106-07