杭州西湖龍泓澗和北里湖水體及底泥毒性的生物學(xué)評(píng)價(jià)

楊永勝,　劉夢(mèng)蕓,　黃民生,　何德富

(1. 華東師范大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上?！?00241；

2. 華東師范大學(xué) 上海市城市化生態(tài)過(guò)程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?！?00241)

杭州西湖龍泓澗和北里湖水體及底泥毒性的生物學(xué)評(píng)價(jià)

楊永勝1,2,劉夢(mèng)蕓1,2,黃民生1,2,何德富1,2

(1. 華東師范大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200241；

2. 華東師范大學(xué) 上海市城市化生態(tài)過(guò)程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241)

摘要：以青海弧菌(Vibrio Qinghaiensis)、秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)和熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎為研究對(duì)象，檢測(cè)分析了龍泓澗和北里湖的水體及底泥的可能毒性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大部分水樣和底泥提取液對(duì)3種實(shí)驗(yàn)對(duì)象均未產(chǎn)生明顯毒性效應(yīng).部分水體和底泥反而呈現(xiàn)出一定的正效應(yīng)，表現(xiàn)為增強(qiáng)青?；【陌l(fā)光強(qiáng)度，促進(jìn)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育.極個(gè)別水樣對(duì)青?；【托沱惥€蟲(chóng)顯示毒性，引起爪蟾胚胎輕微致畸效應(yīng)，可能與污染物排放等偶然因素有關(guān).結(jié)果表明，龍泓澗和北里湖的水體及底泥呈現(xiàn)較低的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，西湖水體具有相對(duì)高的生物安全性.

關(guān)鍵詞：生物毒性；青?；【?；秀麗隱桿線蟲(chóng)；熱帶爪蟾；西湖

第一作者：楊永勝，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué).

0引言

龍泓澗位于杭州西湖風(fēng)景名勝區(qū)內(nèi)，是西湖三條溪流之一和主要的天然補(bǔ)給水源.作為旅游景點(diǎn)，龍泓澗流域內(nèi)居民生活、商業(yè)及農(nóng)業(yè)活動(dòng)所產(chǎn)生的各類(lèi)污染物會(huì)通過(guò)地表徑流進(jìn)入龍泓澗流域，成為西湖主要的潛在外部污染源之一[1].龍泓澗水體質(zhì)量好壞對(duì)西湖水質(zhì)具有重要的影響.北里湖由于地理位置原因，一直以來(lái)是西湖水質(zhì)的死角(見(jiàn)圖1).西湖風(fēng)景名勝區(qū)對(duì)于區(qū)域經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展起著重要的作用，而且提供者巨大的生態(tài)服務(wù)功能.除了常規(guī)的理化監(jiān)測(cè)之外，檢測(cè)龍泓澗和北里湖水質(zhì)的生態(tài)毒性對(duì)評(píng)價(jià)整個(gè)西湖的水體安全性具有前瞻性和代表性.

魚(yú)類(lèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)、藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)、水蚤類(lèi)毒性實(shí)驗(yàn)以及鼠類(lèi)毒性實(shí)驗(yàn)是較為傳統(tǒng)的生物毒性測(cè)試方法[2].發(fā)光細(xì)菌作為一種新型快速毒性檢測(cè)方法近年來(lái)得到廣泛關(guān)注[3].秀麗隱桿線蟲(chóng)是一種新興模式生物，被應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域，在細(xì)胞分化、衰老、細(xì)胞凋亡、藥物篩選和生態(tài)毒理等方面已經(jīng)取得了重要進(jìn)展[4].作為水生模式生物，熱帶爪蟾近年來(lái)常用于研究化學(xué)物質(zhì)在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移、解毒和作用機(jī)制[5]，并用于評(píng)價(jià)環(huán)境化學(xué)物對(duì)生物的影響及毒性作用[6]，近年來(lái)也被應(yīng)用于評(píng)價(jià)水體生態(tài)毒性[7,8].

本研究選取青?；【⑿沱愲[桿線蟲(chóng)和熱帶爪蟾胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)分析龍泓澗和北里湖水體及底泥的毒性，為該區(qū)域水質(zhì)環(huán)境評(píng)價(jià)提供參考.

1材料與方法

1.1　材料

淡水發(fā)光細(xì)菌——青?；【鶴67菌株(VibrioQinghaiQ67)由華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院朱文杰教授提供.秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)由實(shí)驗(yàn)室自養(yǎng)，且取L1期的幼蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)由實(shí)驗(yàn)室自養(yǎng)，取NF10—11階段且發(fā)育正常的胚胎用于實(shí)驗(yàn).

1.2　樣品的采集與制備

龍泓澗由主流與支流構(gòu)成，成梯級(jí)分布，主流由五級(jí)塘組成，支流由四級(jí)塘組成.在主流源頭及各個(gè)梯級(jí)塘出口各設(shè)一個(gè)采樣點(diǎn)，共6個(gè)采樣點(diǎn)(L1—L6).在支流各個(gè)梯級(jí)塘出口各設(shè)一個(gè)采樣點(diǎn)，共4個(gè)采樣點(diǎn)(L7—L10).北里湖位于西湖西北角，沿湖邊共設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)(B1—B5)(見(jiàn)圖1).于2013年11月18日和2014年5月13日各采集底泥一次.2013年11月采樣時(shí)檢測(cè)到龍泓澗和北里湖平均水溫為9 ℃，龍泓澗流域水體清澈見(jiàn)底，pH值為8.50±0.85，DO(溶解氧)值為(13.25±2.23) mg·L-1.2014年5月份龍泓澗和北里湖平均水溫為21 ℃，龍泓澗流域水體清澈見(jiàn)底，pH值為7.63±0.76，DO值為(7.69±1.28) mg·L-1；北里湖水體較清澈，DO值達(dá)到了(8.56±0.74) mg·L-1.將采集到的表層底泥裝入密封袋中，在4 ℃下保存待用.將采集到的底泥與蒸餾水按質(zhì)量比1∶3的比例混合后裝入500 mL的錐形瓶中，密封于振蕩機(jī)上振蕩24 h，條件控制為100 r/min，22 ℃，然后靜置24 h，提取上清液待用[8-10].于2014年5月13日采集水樣1次，將采集到的水樣密封于500 mL塑料瓶中4 ℃保存待用[11].

圖1　西湖龍泓澗、北里湖采樣點(diǎn)分布

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1青?；【毙远拘詫?shí)驗(yàn)

將青?；【鷥龈煞塾? ℃下復(fù)蘇10 min，加入5 mL 0.8%的NaCl溶液混勻，制成細(xì)菌懸液.先取3 mL的待測(cè)液加入試管中，然后每隔15 s(儀器測(cè)定每個(gè)樣品大約需15 s，保證菌液與樣品作用時(shí)間一樣)依次加入60 μL的菌液混勻，15 min后用生物發(fā)光測(cè)定儀(9901LUMINOMETER型號(hào))測(cè)定混合液的發(fā)光強(qiáng)度.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行管，每個(gè)樣品再配一個(gè)對(duì)照管(0.8%的NaCl溶液).以每個(gè)樣品對(duì)照管的檢測(cè)值為空白組，按“抑光率I(%)=(IT空白-IT樣品)/IT空白×100%”公式計(jì)算[7].陽(yáng)性對(duì)照使用氯化鋅，設(shè)置濃度為1、2、3、4、5和6 mg·L-1.氯化鋅濃度與青海弧菌相對(duì)抑光率有較好的線性關(guān)系(見(jiàn)圖2)，得出線性系數(shù)關(guān)系為：y=11.814x+27.2 (R2=0.974 3).通過(guò)參照物氯化鋅對(duì)青海弧菌的劑量效應(yīng)關(guān)系，可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)和判斷水樣對(duì)青?；【募毙远拘詮?qiáng)弱.

1.3.2秀麗隱桿線蟲(chóng)毒性實(shí)驗(yàn)

依照通用的標(biāo)準(zhǔn)程序，野生N2型秀麗隱桿線蟲(chóng)培養(yǎng)在含有大腸桿菌OP50的瓊脂培養(yǎng)基上.同步化到L1期的幼蟲(chóng)再進(jìn)行毒性暴露實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)使用24孔板，每孔加入水樣1 mL再加入0.01 mL OP50作為飼料，每孔分別加入20條同步化的L1期幼蟲(chóng)，每組設(shè)3個(gè)平行孔，對(duì)照組使用蒸餾水暴露，放置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暴露48 h后在解剖鏡下觀察，用解剖針輕觸蟲(chóng)體，沒(méi)有任何反應(yīng)的即視為死亡個(gè)體，記錄死亡個(gè)體數(shù)目，計(jì)算死亡率[12].

圖2　青海弧菌相對(duì)抑光率與氯化鋅濃度線性圖(均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)

1.3.3熱帶爪蟾胚胎致畸實(shí)驗(yàn)

挑選實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的性成熟熱帶爪蟾15對(duì)，采用注射絨毛膜促性腺激素(HCG)的方法誘導(dǎo)產(chǎn)卵[13].每對(duì)爪蟾各注射2次HCG(初次注射20單位,36 h后注射100單位)，待蛙抱對(duì)產(chǎn)卵結(jié)束后收集胚胎.從產(chǎn)卵較好的3對(duì)蛙的胚胎中，挑選出達(dá)到NF10-11階段且發(fā)育正常的胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[9].實(shí)驗(yàn)使用24孔板來(lái)進(jìn)行暴露，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均設(shè)置4個(gè)平行，對(duì)照組使用Ringer溶液，每孔加入2.5 mL的水樣及10只正常胚胎，在25 ℃多功能培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn).24 h換液，記錄孵化個(gè)數(shù)，并將未孵化的胚胎挑出，48 h統(tǒng)計(jì)死亡個(gè)數(shù).將活著的胚胎用100 mg·L-1的MS-222麻醉處理后固定于70%的乙醇溶液中.取出固定的胚胎進(jìn)行顯微拍照，測(cè)量胚胎體長(zhǎng)并統(tǒng)計(jì)畸形率.

2結(jié)果

2.1　龍泓澗、北里湖水體和底泥對(duì)青海弧菌的急性毒性

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了2014年5月13日采集的水體和底泥提取液對(duì)青?；【亩拘孕?yīng).結(jié)果顯示各采樣點(diǎn)水體和底泥提取液對(duì)青?；【南鄬?duì)抑光率幾乎都是負(fù)值，只有L4點(diǎn)的水體是正值，表現(xiàn)為抑制作用(見(jiàn)表1).這表明龍泓澗和北里湖水體和底泥提取液對(duì)青?；【緵](méi)有毒性，反而有促進(jìn)細(xì)菌代謝的效應(yīng).另外，各底泥提取液導(dǎo)致青?；【l(fā)光強(qiáng)度的增強(qiáng)效應(yīng)均高于水體，反映底泥具有更強(qiáng)的正效應(yīng).

2.2　龍泓澗、北里湖底泥提取液對(duì)秀麗線蟲(chóng)的毒性

實(shí)驗(yàn)將2013年11月18日采集的底泥提取液對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行48 h暴露，以死亡率作為毒性指標(biāo).對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率大都為0，只有L5采樣點(diǎn)底泥提取液致秀麗線蟲(chóng)死亡率顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)，其他采樣點(diǎn)的致死亡率與對(duì)照組相比均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表2).

表1　龍泓澗、北里湖底泥提取液和水體致青?；【南鄬?duì)抑光率

注： Results are expressed as percentages (means±SD,n=3).

表2　龍泓澗、北里湖底泥提取液致秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率

注： Results are expressed as means±SD，n=3,*P<0.05, compared to the control.

2.3　龍泓澗、北里湖水體和底泥對(duì)熱帶爪蟾胚胎的急性毒性

爪蟾胚胎分別暴露于2013年11月采集的底泥提取液和2014年5月采集的水樣及底泥提取液，各處理組的爪蟾胚胎的發(fā)育和死亡率均未表現(xiàn)出明顯的影響，與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.以胚胎長(zhǎng)為指標(biāo)分析暴露后各組樣品對(duì)爪蟾胚胎發(fā)育的影響，觀察2014年5月水樣(WS)的毒性，結(jié)果顯示L4和L5點(diǎn)水樣導(dǎo)致爪蟾胚胎發(fā)育被顯著性抑制(P<0.001,與對(duì)照組相比)，其他水樣均未抑制胚胎發(fā)育.另外，2014年5月收集的L4水樣導(dǎo)致胚胎的畸形率顯著升高，其他采樣點(diǎn)則無(wú)明顯影響(見(jiàn)表3).結(jié)果顯示2013年11月采集的L6、L8、L9底泥對(duì)爪蟾胚胎發(fā)育表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，而2014年5月采集的L6底泥提取液則表現(xiàn)為抑制作用.兩次采集的底泥中，只有2014年5月的L6樣品提取液對(duì)爪蟾胚胎表現(xiàn)出較高的致畸率(P<0.001，與對(duì)照組相比)，而其他底泥提取液均未觀察到明顯的致畸效應(yīng).分析龍泓澗L6底泥和L4水樣導(dǎo)致爪蟾胚胎的畸形表現(xiàn)，主要表型包括泄殖腔擴(kuò)張、鰭變窄和脊索彎曲(見(jiàn)圖3).

表3　龍泓澗和北里湖底泥提取液及水體對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響

注：SE1 and SE2 indicates respectively sediment extracts sampled in Nov, 2013 and in May, 2014. WS indicates water samples in May, 2014. Results are expressed as means±SD，n=3, *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001, compared to the control.

注：A—B，Effects of L6 sediment sample (May, 2014); C，Effects of L4 water sample (Nov, 2013)

3討論

杭州西湖是世界文化遺產(chǎn)和著名旅游景區(qū)，其水環(huán)境質(zhì)量和生態(tài)安全備受關(guān)注.基于化學(xué)和生態(tài)的地表水狀況評(píng)估各有優(yōu)勢(shì)[14]，而生態(tài)毒理評(píng)價(jià)則能更好地分析生態(tài)系統(tǒng)的安全性.綜合利用青?；【⑿沱惥€蟲(chóng)和爪蟾胚胎來(lái)評(píng)估龍泓澗和北里湖水體及底泥的生物毒性.結(jié)果表明，龍泓澗和北里湖底泥提取液和水樣對(duì)青?；【緵](méi)有毒性效應(yīng)，反而表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)作用.發(fā)光細(xì)菌法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，并能分析單因子，多因子或綜合的環(huán)境污染物的毒性，受到廣泛應(yīng)用[15].使用的青?；【暌言谒|(zhì)生物毒性檢測(cè)方面大量應(yīng)用[3,7,10,16,17].青?；【陌l(fā)光強(qiáng)度受多種環(huán)境因子的影響，鄭敬民等實(shí)驗(yàn)表明氮源、CaSO4、Mg2+、甘油等環(huán)境因子對(duì)青海弧菌生長(zhǎng)發(fā)光有利[18].實(shí)驗(yàn)水樣對(duì)青?；【鷽](méi)有出現(xiàn)發(fā)光抑制作用，反而較對(duì)照組的發(fā)光強(qiáng)度大幅提升.這可能與研究區(qū)域的水流源頭在山區(qū)，致使與對(duì)照組相比水樣中含有一定濃度的Ca2+、Mg2+和氮元素等，在這些有利因數(shù)的促進(jìn)下青?；【陌l(fā)光強(qiáng)度大幅提升.

作為一種模式生物，秀麗隱桿線蟲(chóng)已在生命科學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，應(yīng)用其檢測(cè)水質(zhì)生態(tài)毒性方面研究很少.本文使用短期暴露后的動(dòng)物死亡率來(lái)表征樣品的生物毒性，結(jié)果表明絕大部分底泥樣品對(duì)線蟲(chóng)的存活均沒(méi)有影響，死亡率接近為零.這表明該水域的底泥提取液對(duì)生活在土壤中的線蟲(chóng)基本沒(méi)有生物毒性.水體樣品和底泥提取液對(duì)熱帶爪蟾整體上沒(méi)有產(chǎn)生生物毒性效應(yīng).甲狀腺激素在爪蟾胚胎期起著重要作用，研究表明一些污染物能夠通過(guò)影響胚胎的甲狀腺激素信號(hào)而對(duì)胚胎的發(fā)育造成影響.部分采樣點(diǎn)促進(jìn)了爪蟾胚胎的生長(zhǎng)可能與樣品中存在促使甲狀腺激素信號(hào)正效應(yīng)的物質(zhì)有關(guān).龍泓澗L4的水樣對(duì)爪蟾產(chǎn)生了明顯的畸形效應(yīng)，而該水樣檢測(cè)的青?；【l(fā)光強(qiáng)度也同樣受到較大抑制(81.5%).我們推測(cè)這可能與龍泓澗流域部分茶農(nóng)在澗中清洗施藥設(shè)備等偶然因素有關(guān)，應(yīng)引起一定的注意.

與以往在黑臭河道水體、工業(yè)廢水和特定污染物上檢測(cè)的生物毒性比較，本文運(yùn)用青?；【蜔釒ё概咛ケ碚鞯纳锒拘詮?qiáng)度要明顯低[7,10,19-21]，這反映西湖水體水質(zhì)總體良好.依托國(guó)家重大水專(zhuān)項(xiàng)，西湖龍泓澗流域和北里湖治理工程已實(shí)施完成.本文結(jié)果也反映這一項(xiàng)目的實(shí)施改善了西湖的水質(zhì).這與我國(guó)大沽排污河道生態(tài)修復(fù)后的生物毒性檢測(cè)有類(lèi)似之處，但從發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)值來(lái)看西湖水體生物毒性要遠(yuǎn)低于大沽河[22].另外，底泥提取液檢測(cè)顯示龍泓澗和北里湖底部毒性較低.河道底泥是水體污染物沉積的主要部位之一，其詳盡的生物毒性還需結(jié)合整體沉積物毒性及主要污染物化學(xué)檢測(cè)等方面進(jìn)行深入分析.

綜上所述，可以得知龍泓澗和北里湖水體及底泥提取液對(duì)青?；【⑿沱惥€蟲(chóng)和爪蟾胚胎基本無(wú)毒，反映西湖水體相對(duì)較低的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).

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(責(zé)任編輯張晶)

Bioassay for toxicity of water and sediment in Longhong Ravine and Beili Lake in West Lake, Hangzhou

YANG Yong-sheng1,2,LIU Meng-yun1,2,HUANG Min-sheng1,2,HE De-fu1,2

(1.SchoolofEcologicalandEnvironmentalSciences,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China；

2.ShanghaiKeyLabforUrbanEcologicalProcessesandEco-Restoration,

EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China)

Abstract:Using Vibrio Qinghaiensi, Caenorhabditis elegans and Xenopus tropicalis embryos, the potential toxicity of Longhong Ravine and Beili Lake were respectively detected. Results showed that water and sediments from Longhong Ravine and Beili Lake were not toxic to the three organisms. On the contrary, some samples showed positive effects, for example, enhanced luminous intensity of Vibrio Qinghaiensis and promoted the growth of Xenopus tropicalis embryos. A small number of samples caused slight teratogenic effects on Xenopus embryos, which were likely related to accidental discharges of pollutants. Our results suggested that Longhong Ravine and Beili Lake present relatively low ecological risks, which indicated high biological safety in West Lake.

Key words:biotoxicity;Vibrio Qinghaiensis;Caenorhabditis elegans;Xenopus tropicalis;West Lake

通信作者：何德富，男，博士，副教授，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)、環(huán)境與健康等. E-mail: dfhe@des.ecnu.edu.cn.

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2013ZX07310-001-04)

收稿日期：2014-09

中圖分類(lèi)號(hào)：X592

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1000-5641.2015.02.012

文章編號(hào)：1000-5641(2015)02-0098-08