補腎活血方藥對糖尿病腎病大鼠腎臟中晚期糖基化終末產(chǎn)物的影響及可能機制※

王悅芬　王樹則　趙文景　孟　元　蔡　朕　張勝容

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科，北京　100010)

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實 驗 研 究

補腎活血方藥對糖尿病腎病大鼠腎臟中晚期糖基化終末產(chǎn)物的影響及可能機制※

王悅芬王樹則1趙文景孟元蔡朕張勝容△

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科，北京100010)

【摘要】目的探討補腎活血方藥對糖尿病腎病大鼠腎臟晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的影響及可能機制。方法將48只雄性SD大鼠隨機分為4組，即正常對照組、模型組、氨基胍組及補腎活血方組，除正常對照組外，其余3組大鼠予鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病腎病大鼠模型。造模成功后，補腎活血方組大鼠予6.3 g生藥/kg補腎活血方水煎劑，氨基胍組大鼠予含鹽酸氨基胍的自來水50 mg/(kg·d)，模型組和正常對照組大鼠予等容積自來水灌胃，均每日1次，連續(xù)8周。測定各組大鼠空腹血糖(FBG)、腎質量/體質量、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、24 h尿蛋白定量，檢測腎小球AGEs(GTE-AGEs)及血清和尿中抗-羧甲基賴氨酸(CML)-AGEs、熒光性-AGEs含量，生物化學法測定腎小球脂質過氧化物(LPO)含量，觀察腎臟病理改變。結果與正常對照組相比，模型組大鼠FBG、BUN、Cr、腎質量/體質量、24 h尿蛋白定量、GTE-AGEs、血清熒光性-AGEs及CML-AGEs、腎小球LPO含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，補腎活血方組及氨基胍組FBG、BUN、Cr、腎質量/體質量、24 h尿蛋白定量、GTE-AGEs、腎小球LPO顯著降低，尿熒光性-AGEs、尿CML-AGEs含量顯著升高(P<0.05)。與正常對照組比較，模型組腎小球平均截面積(MGA)、腎小球平均體積(MGV)顯著增大(P<0.01)；與模型組比較，補腎活血方組及氨基胍組MGA、MGV顯著減小(P<0.05，P<0.01)，2組腎臟病理學改變顯著減輕，且2組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論補腎活血方可通過增加尿液AGEs排泄減少AGEs在糖尿病腎病大鼠腎臟的蓄積，降低尿蛋白排泄，減少氧化應激水平，從而發(fā)揮其對糖尿病腎病的防治作用。

【關鍵詞】糖尿病腎病；糖基化終產(chǎn)物，高級；補腎；活血；中藥療法；疾病模型，動物；動物，實驗；大鼠；

對于糖尿病腎病的治療，先前的研究焦點主要集中在控制高血糖和高血壓。隨著醫(yī)學的發(fā)展，葡萄糖依賴性的信號通路是一個重要的研究方向，其中針對高血糖誘導的氧化應激、炎癥反應和信號通路異?；罨闹委?，可顯著改善糖尿病腎病的病理狀態(tài)，關于分子治療的熱門靶點主要是血管相關的信號通路，包括晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、蛋白激酶C以及腺苷酸活化蛋白激酶[1-2]。中醫(yī)學認為，糖尿病腎病多為本虛標實之證，本虛多以氣陰兩虛、肝腎陰虛、陰陽兩虛為主，標實多與濕濁、濕熱、血瘀有關。本研究通過實驗觀察補腎活血方對糖尿病腎病大鼠腎臟AGEs的影響，探討其對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性SD大鼠，48只，體質量150～200 g，由北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(北京)2007-0001。

1.1.2主要試劑及儀器鏈脲佐菌素(STZ)、鹽酸氨基胍(AG)、膠原蛋白酶Ⅳ、蛋白酶K、標記堿性磷酸酶的抗兔IgG抗體為Sigma公司產(chǎn)品(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO，USA)；羥脯氨酸，購自上?；瘜W試劑公司；脂質過氧化物(LPO)測定試劑盒、血肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)測定試劑盒、24 h尿蛋白定量試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。全自動酶標儀Austria Rainbow 340-700為奧地利Rainbow公司產(chǎn)品；F-4500熒光分光光度計為日本Hitachi產(chǎn)品；觀察病理所用顯微鏡為日本尼康產(chǎn)品，型號為NIKON ECLIPSE 80i；圖像分析系統(tǒng)由湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司提供，型號Mias-2000。補腎活血方由熟地黃、肉蓯蓉、懷牛膝、山藥、川芎等組成，由石家莊樂仁堂醫(yī)藥集團股份有限公司中藥飲片廠提供，經(jīng)河北醫(yī)科大學藥用植物教研室鑒定為純品，水煎取汁，藥物濃度為1 g生藥/mL。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組將48只雄性SD大鼠隨機分為4組，即正常對照組、模型組、補腎活血方組及氨基胍組，每組各12只。

1.2.2模型制備除正常對照組外，其他3組大鼠予STZ 65 mg/kg腹腔注射(溶解于pH 4.5，0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中)建立糖尿病腎病大鼠模型。注射后48 h連續(xù)監(jiān)測，若3次達到下述標準則認為造模成功：FBG≥16.7 mmol/L，尿量大于原尿量的1.5倍，尿糖強陽性；尿微量白蛋白排泄率>30 mg/24 h。正常對照組大鼠予等量檸檬酸緩沖液。

1.2.3給藥方法造模成功后，補腎活血方組大鼠予6.3 g生藥/kg補腎活血方煎劑，氨基胍組大鼠予含鹽酸氨基胍自來水50 mg/(kg·d)(1 g鹽酸氨基胍溶解于1 L自來水中)，模型組和正常對照組大鼠予等容積自來水灌胃，均每日1次，連續(xù)8周。實驗期間所有大鼠均喂養(yǎng)標準飲食，不用胰島素及其他降糖藥物。

1.3觀察指標及方法

1.3.1標本采集用代謝籠收集各組大鼠24 h尿標本，計24 h尿量，-20 ℃保存，待查。然后麻醉各組大鼠，腹主動脈取血，分離血清。接著處死各組大鼠，取雙腎，去掉包膜稱質量，計算腎質量/體質量[雙側腎臟質量之和/體質量(g/g)]。然后分離腎皮質、腎髓質。右腎部分置于10%中性甲醛溶液浸泡固定，待光鏡觀察病理。其余腎皮質剪碎后-70 ℃冷凍，待檢AGEs及LPO。

1.3.2檢測指標及方法

1.3.2.1取血清，采用生物化學方法檢測BUN、Cr、FBG。取尿采用考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白定量[2]。

1.3.2.2腎小球-AGEs(GTE-AGEs)測定①腎小球提取物(GTE)制作：參照文獻[3-4]分離、制備腎小球及腎小球提取物。將腎皮質剪碎、勻漿、離心、沉淀，在沉淀中加氯仿和甲醇(比例為2∶1，V/V)5 mL，去脂，4 ℃搖振過夜，經(jīng)水化沖洗，用0.5 mol/L醋酸和1 mg/L胃蛋白酶去除非膠原蛋白，再用0.1 g/LⅣ型膠原酶和0.1 g/L蛋白酶K消化處理24 h后，離心取上清液，即為腎小球提取物，用于AGEs含量檢測。采用Makita等[4]方法測定腎小球提取物中羥脯氨酸含量。②GTE -AGEs測定：參照Edwards等[5]方法體外孵育形成的核糖核酸酶-AGEs(RNase-AGEs)作為免疫原，免疫大白兔，制備抗AGEs多克隆抗血清，建立競爭性酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法?？寡迮cRNase-AGEs和牛血清白蛋白-AGEs(BSA-AGEs)結合，但不與BSA結合，其滴度為1∶2 000，55 mg/L BSA-AGEs競爭抑制抗血清結合率50%。測定過程：100 mg/L BSA-AGEs[pH 9 .6碳酸緩沖液(PBS)]加于酶標板上，每孔0.1 mL進行包被。洗滌后用0.2 mL 0.2 mol/L PBS(含0.1%BSA，pH 7.4)進行封閉，洗滌后每孔加入50 μL競爭抗原(BSA-AGEs或待測GTE)，然后加入50 μL 1∶1 000抗血清，洗滌后加入標記堿性磷酸酶的抗兔IgG抗體，最后每孔加入0.1 mL 1 g/L對硝基苯磷酸二鈉鹽(PNPP)進行顯色反應，30 min后測定波長405 nm的吸光度(A值)，計算B/BO，B/BO=(實驗A值-無抗血清的背景A值)/(無競爭抗原的總A值-背景A值)。以BSA-AGEs為AGEs標準，在半對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線。AGEs含量用AGE·IU表示，1AGE·IU等于0.1 mg BSA-AGEs所含的AGEs量。最終結果用AGE·IU/ mg膠原蛋白表示(簡寫為IU/mg pr)。批內變異指數(shù)為5.2%，批間變異指數(shù)為9.6%。

1.3.2.3血清、尿液-AGEs測定①血清、尿液熒光性-AGEs測定：參照蔣建平等[6]方法，取血清、尿液各0.2 mL，0.9%氯化鈉注射液稀釋至2 mL，用熒光分光光度計測上清液熒光強度(激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長440 nm，狹縫5 nm。Lowry法測定稀釋液中蛋白含量，AGEs含量以每mg蛋白中相對熒光強度(AIU/mg pr)表示。②血清、尿液N-羧甲基賴氨酸(CML)-AGEs測定：取血清、尿液各0.2 mL，0.9%氯化鈉注射液稀釋至2 mL，以下步驟同GTE -AGEs測定。

1.3.2.4腎小球LPO測定取腎小球提取物，參照試劑盒說明書測定腎小球LPO。

1.3.2.5腎臟病理腎組織經(jīng)10%甲醛固定后，用常規(guī)方法制備光鏡切片，行三色套染，應用Mias-2000圖像分析儀測定腎小球平均體積及系膜體積。在高倍鏡下進行病理分析，每個切片隨機選擇10個正切的腎小球，測定腎小球平均截面積(MGA)，取其平均值作為每個標本的MGA，計算腎小球平均體積(MGV)。

2結果

2.1大鼠死亡情況治療結束后，模型組及氨基胍組各有2只大鼠死亡。

2.24組大鼠FBG 、腎質量/體質量及腎功能指標比較見表1。

表1　4組大鼠FBG 、腎質量/體質量及腎功能指標比較　±s

與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

由表1可見，模型組大鼠FBG、BUN、Cr、腎質量/體質量、24 h尿蛋白定量均高于正常對照組(P<0.01)；補腎活血方組及氨基胍組FBG、BUN、Cr、腎質量/體質量及24 h尿蛋白定量均低于模型組(P<0.05)，而補腎活血方組與氨基胍組各項目組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.34組大鼠腎小球、血清及尿中AGEs比較見表2。

表2　 4組大鼠腎小球、血清及尿AGEs比較　±s

與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

由表2可見，模型組大鼠GTE-AGEs及血清熒光性-AGEs、CML-AGEs含量顯著高于正常對照組(P<0.05)；與模型組比較，補腎活血方組及氨基胍組GTE-AGEs顯著降低(P<0.05)，尿熒光性-AGEs、尿CML-AGEs含量顯著升高，并高于正常對照組(P<0.05)；補腎活血方組與氨基胍組各項目組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.44組大鼠腎小球LPO、MGA、MGV比較見表3。

表3　4組大鼠腎小球LPO、MGA、MGV比較

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

由表3可見，模型組大鼠腎小球LPO含量高于正常對照組(P<0.05)，補腎活血方組及氨基胍組顯著低于模型組(P<0.05)，補腎活血方組與氨基胍組組間比較無顯著差異(P>0.05)。與正常對照組比較，模型組MGA、MGV顯著增大(P<0.01)；與模型組比較，補腎活血方組及氨基胍組MGA、MGV顯著減小(P<0.05)，補腎活血方組與氨基胍組2組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.54組大鼠腎臟病理觀察結果電子光鏡下，正常對照組大鼠腎小球體積正常，腎小球PAS紅染區(qū)無擴大，系膜區(qū)無增寬，毛細血管管腔開放良好(見封3，圖1)；模型組大鼠腎小球體積顯著增大，腎小球PAS紅染區(qū)擴大，系膜區(qū)增寬，毛細血管管腔受壓(見封3，圖2)；補腎活血方組腎小球體積較模型組顯著減小，腎小球系膜區(qū)噬復紅蛋白含量減少，毛細血管管腔受壓改善(見封3，圖3)；氨基胍組腎小球體積較模型組減小，腎小球系膜區(qū)PAS紅染區(qū)縮小，系膜區(qū)無明顯增寬，毛細血管管腔受壓改善(見封3，圖4)。

3討論

AGEs的形成主要與體內葡萄糖水平、氧化應激有關，形成后AGEs主要被局部巨噬細胞通過清道夫受體內吞并，并降解成可溶性多肽(LMN-AGEs)進入血液循環(huán)，經(jīng)腎臟過濾，隨尿液排出。AGEs是一組化合物，目前明確結構的有羧甲基賴氨酸(CML)、吡咯素、戊糖苷素等，其常用的檢測方法有：①抗CML結構的免疫學檢測方法；②針對其熒光特性的熒光分光光度計法。有研究報道，熒光性-AGEs最容易在腎組織沉積，是重要的腎毒性物質[7]。如腎功能受損，不能及時清除血液中未能排除的降解產(chǎn)物，可再次與蛋白結合形成AGEs[8]。在糖尿病患者和動物的血管壁及腎臟中，AGEs含量明顯增加，在腎臟AGEs與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結合后可通過氧化應激誘導血小板衍化生長因子及轉化生長因子的表達，促進細胞外基質的產(chǎn)生，增加血管通透性，使血液處于高凝狀態(tài)等機制參與腎臟纖維化的進展。

中醫(yī)學認為，腎主水，主封藏，藏先天之精和后天之精，腎絡瘀阻可導致水液運行及腎封藏功能異常，精津外泄，從而出現(xiàn)水腫及蛋白尿。我們結合AGEs在糖尿病腎病、透析相關心腦血管并發(fā)癥發(fā)病過程中的機制，提出糖尿病腎病腎絡瘀阻發(fā)病學說，并以補腎活血法治療，在臨床中取得了良好療效。前期研究顯示：①一定濃度的補腎中藥懷牛膝、淫羊藿、熟地黃對體外蛋白非酶糖化產(chǎn)物有直接抑制作用[8]；②補腎活血方通過增加腎臟對AGE-肽排泄，降低端腦AGEs的積累及端腦、海馬組織β-淀粉樣肽(AβP)含量，改善由雌激素缺乏、腎虛所致的學習記憶下降及心腦血管并發(fā)癥[9]。為進一步探討補腎活血化瘀藥物對腎臟的保護作用及機制，本研究通過動態(tài)分析腎組織、循環(huán)、尿液中AGEs三者的關系，觀察腎清除毒素的作用與腎的氣化、封藏功能的關系。

本研究顯示，模型組大鼠腎小球體積明顯增大，24 h尿蛋白定量增加，腎功能受損，腎小球及血清中AGEs和腎小球LPO含量均明顯增加，尿液中AGEs含量與正常對照組相比無明顯差異(P>0.05)；氨基胍組及補腎活血方組在大鼠FBG下降情況下，腎小球體積、24 h尿蛋白定量及腎功能受損程度均有明顯改善，且大鼠腎小球中AGEs和LPO含量均明顯減少，尿液對AGEs排泄量顯著增加，但血清中CML-AGEs較模型組和正常對照組有增加趨勢。提示模型組大鼠由于血糖增加，導致機體氧化應激增強，體內AGEs的生成增加，血中AGEs含量增加，但尿液對其排泄無明顯改變，從而加速組織中AGEs沉積。

補腎活血方由懷牛膝、生地黃、牡丹皮等組成，其對糖尿病腎病大鼠的防治作用與氨基胍治療作用類似，體現(xiàn)在減少AGEs在腎小球的沉積，降低腎小球LPO水平，減少組織的氧化應激水平，保護腎小球結構和功能。氨基胍為AGEs抑制劑，它能特異性抑制AGEs的形成，但對已經(jīng)交聯(lián)的AGEs無裂解作用。本研究提示，氨基胍減少AGEs在腎小球沉積的機制可能為：①阻斷從蛋白質非酶糖化反應中間產(chǎn)物Amadori產(chǎn)生到AGEs的轉化，抑制AGEs形成；②抑制可溶性多肽與蛋白再次交聯(lián)；③促進可溶性多肽經(jīng)尿液排泄；④減少腎小球LPO水平，降低腎臟氧化應激水平。補腎活血方減少AGEs在腎小球沉積的機制可能為：①懷牛膝、熟地黃能直接抑制AGEs形成[9]；②促進可溶性多肽經(jīng)尿液排泄；③減少腎小球LPO水平，降低腎臟氧化應激水平。

關于血液、尿液及腎臟中AGEs的關系，鄭凝等[10]認為腎臟組織中AGEs含量與血清中熒光性-AGEs有較好的相關性，提出血清中AGEs能反映腎臟及全身組織中AGEs的含量，本實驗與上述結果有不同之處。本實驗選用2種檢測方法測定了血清和尿液中不同成分AGEs的含量，提示血液循環(huán)中物質的增多不等同于組織中該物質沉積增加，應動態(tài)看待血清、尿液、組織中物質循環(huán)和轉移，在機體中增加有毒物質清除也是保護內環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。AGEs從組織到循環(huán)到尿液的轉移能體現(xiàn)中醫(yī)腎的氣化功能，可作為保護腎封藏功能的重要標志物。

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(本文編輯：曹志娟)

※項目來源：“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題(編號：2009zx09502-014)；國家自然科學基金面上項目(編號：81072713)；首都醫(yī)學發(fā)展科研基金項目(編號：SF-2009-I-06)

1中央財經(jīng)大學2012級電子商務，北京100081

Effects and possible Mechanism of Bushen-huoxue formulas on AGEs in kidney of diabetic ratsWANGYuefen*,WANGShuze,ZHAOWenjing,etal.*DepartmentofNephrology,BeijingChinesemedicinehospitalaffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100010

【Abstract】Objective Explore the effects and possible mechanism of Bushen-huoxue formulas on advanced glycosylation end products (AGEs) in kidneys in diabetic rats. Methods 48 male SD rats were randomly divided into four groups: normal control group (group N), model group (group DM), positive control medicine group with aminoguanidine (group AG), and treatment group with Bushen-huoxue formulas (group BSHX). Diabetes models were induced by injection of streptozocin. After the treatment of aminoguanidine, Bushen-huoxue for 8 weeks, kidney weight/body weight, blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Cr), total 24 h urine protein were measured for each group; glomerular AGEs (GTE-AGEs), serum and urine of CML-AGEs、fluorescent-AGEs were detected with enzyme-linked immunoassay and fluorescence; The content of glomerular lipid peroxide (LPO) was detected with biochemical method. The pathological changes of kidney were observed. ResultThe level of FBG, BUN, Cr, kidney weight/body weight, 24 h urine protein, GTE-AGEs, serum fluorescence-AGEs, the serum levels of CML-AGEs and GTE-LPO were all significantly higher in group DM than those in group N (P<0.05,P<0.01). The FBG, BUN, Cr, kidney weight/bodyweight, 24h urine protein, GTE-AGEs and GTE-LPO were significantly lower in group BSHX and group AG than those in group DM; the content of urine fluorescence-AGEs, urine CML-AGEs were significantly higher. MGA and MGV in group DM were all significantly increased as compared with those in group N (P<0.01). MGA and MGV in group BSHX and group AG were all significantly increased as compared with those in group DM (P<0.05,P<0.01). The pathological changes of kidney were reduced in the rats of group BSHX and group AG, there was no significant difference between group BSHX and group AG on renal pathology change (P>0.05). Conclusion Bushen-huoxue formulas can reduce accumulation of AGEs in the kidney of diabetic rats, reduce the excretion of urinary protein, and reduce oxidative stress levels by increasing the excretion of urine AGEs. Thus, it plays roles in prevention and treatment of diabetic nephropathy.

【Key words】Diabetic nephropathy; Glycosylation end products: Advanced; Tonifying kidney; Activating blood; Traditional Chinese medicine therapy; Disease models, animal; Animal experiment; Rat

(收稿日期：2014-12-31)

作者簡介：王悅芬 (1967—)，女，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導師，博士。從事中醫(yī)內科腎臟病及其并發(fā)癥臨床、教學及科研工作。

通訊作者：△首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科，北京100010

【中圖分類號】R587.24；R285.5

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)12-1827-05

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.12.021