不同濃度環(huán)磷酰胺和地塞米松對小鼠免疫抑制模型建立的影響*

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不同濃度環(huán)磷酰胺和地塞米松對小鼠免疫抑制模型建立的影響*

**通訊作者，E-mail:biner70@sina.com

張涵淇，王嬌，崔圓圓，胡鑫，王德彬**

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

摘要：目的 以不同濃度的環(huán)磷酰胺(CY)和地塞米松(DEM)建立小鼠免疫抑制模型，研究建模的最適劑量。方法CY組腹腔注射不同濃度的CY溶液(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)，DEM組腹腔注射不同濃度的DEM溶液(25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg)，連續(xù)3 d,于第7d檢測臟器指數(shù)、血清中NO含量和NOS活力。結(jié)果DEM中劑量組和CY高劑量組脾臟指數(shù)、NO含量以及NOS活力較正常組有明顯升高；胸腺指數(shù)較正常組顯著降低。結(jié)論50mg/kg 的DEM、100mg/kg CY為建立小鼠免疫抑制模型的最適劑量。

關(guān)鍵詞：環(huán)磷酰胺；地塞米松；NO；NOS

作為應(yīng)用廣泛的抗癌藥物，環(huán)磷酰胺對多種腫瘤均有抑制作用，同時大量實驗證實，環(huán)磷酰胺能通過抑制細(xì)胞增殖來降低機(jī)體的免疫功能，因此常用來建立免疫抑制模型[1,2]。也有相關(guān)研究表明地塞米松可通過誘導(dǎo)白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少起到免疫抑制的效果。因此本研究以不同濃度環(huán)磷酰胺和地塞米松誘導(dǎo)小鼠建立免疫抑制模型，通過檢測模型的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、血清中NO含量和NOS活力，來評價兩種藥物誘導(dǎo)建模的最佳劑量。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物昆明種小鼠70只，體質(zhì)量18~22g。購于武漢生物制品研究所，動物許可證號SCXK(鄂)2012—0003。

1.1.2藥品與試劑地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀集團(tuán)湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號：51408162)，環(huán)磷酰胺(阿拉丁試劑有限公司，批號：L1429054)，NO試劑盒(碧云天試劑有限公司，批號：S0021)，NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20141230)。

1.1.3儀器M200酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)，UV-1800PC紫外可見分光光度計(上海美譜達(dá)器有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠分組及給藥將70只小鼠隨機(jī)分為7組，每組各10只。分別為正常組，地塞米松低、中、高劑量組，環(huán)磷酰胺低、中、高劑量組。正常組于實驗的第1、2、3d腹腔注射生理鹽水0.2ml/只，同時，地塞米松低、中、高劑量組分別腹腔注射地塞米松25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg，環(huán)磷酰胺低、中、高劑量組分別腹腔注射環(huán)磷酰胺25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。

1.2.2血清中NO含量測定在實驗的第7d，稱取所有小鼠體重，摘眼球取血于EP管中，血液于4℃下靜置2h后，3000r/min離心10min，上層的透明液體即為血清。制作NO標(biāo)準(zhǔn)曲線：以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn)品，將NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、1、2、5、10、20、50、100、150、200μmol/L梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取96孔板，每孔加入NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl,依次加入Griess試劑1、Griess試劑2各50μl，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)兩個復(fù)孔，用酶標(biāo)儀檢測550nm下的吸光度，做回歸曲線，計算回歸方程。另取96孔板，每孔用加樣器加入血清50μl、Griess試劑一50μl、Griess試劑二50μl，每一個樣品設(shè)兩個復(fù)孔，加完樣后立即用酶標(biāo)儀測定550nm下樣品的吸光度。

1.2.3血清中NOS活性測定每一個血清樣品設(shè)兩個復(fù)樣，按NOS試劑盒說明書操作，用分光光度計測定吸光度(OD值)，計算NOS活力。

1.2.4小鼠臟器指數(shù)的測定脫頸椎處死小鼠，解剖后取脾臟、胸腺稱重，按以下方法計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量/小鼠體重

1.3統(tǒng)計方法 用GraphPad Prism 5軟件處理所有實驗數(shù)據(jù)，并進(jìn)行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度DEM和CY對小鼠血清NO含量、NOS活性測定的影響由表1可知，與正常組相比，DEM低、中劑量組和CY高劑量組小鼠血清中NO濃度明顯升高，DEM中劑量組和CY高劑量組NOS活力明顯增強(qiáng)。

表1　不同濃度的DEM和CY對小鼠血清中NO含量及NOS活力的影響(n=10)

與正常組比較，*P<0.05、**P<0.01

2.2不同濃度DEM和CY對小鼠臟器指數(shù)的影響由表2可知，與正常組相比，DEM中劑量組和CY高劑量組脾臟指數(shù)明顯升高，胸腺指數(shù)均有明顯降低。

表2　不同濃度DEM和CY對小鼠臟器指數(shù)的影響(n=10)

與正常組比較，*P<0.05、**P<0.01

3討論

目前，用來誘導(dǎo)小鼠免疫抑制模型的藥物有氫化可的松、環(huán)磷酰胺、地塞米松等，其中環(huán)磷酰胺是應(yīng)用最廣泛，也是研究最多的一種建模藥物。環(huán)磷酰胺屬于烷化劑，可以與DNA形成交聯(lián)，抑制DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。地塞米松為甾體類抗炎藥，能抑制巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)胸腺細(xì)胞的凋亡。本實驗采用劑量分別為25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml的環(huán)磷酰胺(CY)和地塞米松(DEM)建立小鼠免疫抑制模型，研究CY和DEM對小鼠血清中NO含量、NOS活性、臟器指數(shù)的影響，探討二者建立免疫抑制模型的最佳劑量。

NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，同時也在免疫功能的調(diào)控過程中發(fā)揮雙重調(diào)控作用，正常情況下NO可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的活性，過量的NO則會導(dǎo)致組織的病理損傷。機(jī)體內(nèi)的NO由NOS催化L-Arg產(chǎn)生。實驗結(jié)果表明，DEM中劑量組和CY高劑量組的NO含量、NOS活力均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組，提示這兩組小鼠的免疫功能

當(dāng)免疫細(xì)胞受到抗原刺激后，它們在脾臟進(jìn)行增殖分化，而胸腺則是T細(xì)胞成熟的重要場所，因此脾臟和胸腺的相對重量和免疫功能有關(guān)。本實驗結(jié)果表明，DEM中劑量組和CY高劑量組的脾臟指數(shù)顯著高于正常組； DEM中劑量組和CY高劑量組的胸腺指數(shù)顯著低于正常組，說明小鼠的免疫功能受到明顯抑制。故50mg/kg的DEM和100mg/kg的CY為誘導(dǎo)小鼠建立免疫抑制模型的最佳濃度。

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Establishment of Immunosuppression Model Induced by Different

Doses of Cyclophosphamide or Dexamethasone in Normal Mice

ZHANG Han-qi,WANG jiao，WANG De-bin，et al

(CollegeofPharmacy,South-CentralUniversityforNationalities,WuhanHubei430074,China)

ABSTRACT：Objective To study the establishment of immunosuppressionmodel in mice with the best dosage of cyclophosphamide (CY) or dexamethasone (DEM). Methods he mice in CY or DEM groups were injected intraperinoteally with CY or DEM at doses of 25mg/kg,50mg/kg and 100mg/kg,respectively,for three days.Index of organs,the content of NO and the activity of NOS in serum of mice were tested after seven days.Results Index of spleen,the content of NO and the activity of NOS in middle-dosage group of DEM were significantly higher than those of normal group,and index of thymus was significantly decreased,as did high-dosage group of CY.Conclusion Middle-dosage group (50mg/kg) of DEM or high-dosage group (100mg/kg) of CY has the best immunosuppressive function in mice.

KEY WORDS：Cyclophosphamide;Dexamethasone;NO;NOS

(收稿日期：2015-07-10)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2015.06.0461

中圖分類號：R967

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-4646(2015)06-0461-03

*基金項目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(CZY15019)；中南民族大學(xué)十二五“民族藥學(xué)”國家級實驗教學(xué)示范中心項目