黃顙魚生長(zhǎng)抑素基因的克隆及表達(dá)譜分析

梁宏偉，曹 磊，李 忠，鄒桂偉

(1 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430070；3 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

黃顙魚生長(zhǎng)抑素基因的克隆及表達(dá)譜分析

梁宏偉1,2，曹 磊1,3，李 忠1,3，鄒桂偉1,3

(1 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430070；3 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

【目的】 克隆黃顙魚生長(zhǎng)抑素(Somatostatin，SS)基因cDNA全長(zhǎng)序列，分析其在黃顙魚胚胎發(fā)育、胚后發(fā)育階段及成魚各個(gè)組織中的表達(dá)規(guī)律?！痉椒ā?以黃顙魚腦組織為材料，根據(jù)瓦氏黃顙魚和斑點(diǎn)叉尾鮰SS基因保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物用于擴(kuò)增SS基因中間保守區(qū)序列，再根據(jù)中間保守區(qū)序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別用于擴(kuò)增5′端和3′端序列，將擴(kuò)增得到的中間保守區(qū)序列、5′端和3′端序列拼接后得到黃顙魚SS基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用NCBI的Protein Blast對(duì)黃顙魚與其他物種SS基因編碼的氨基酸序列同源性進(jìn)行比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)SS基因在胚胎發(fā)育時(shí)期和胚后發(fā)育階段(1～20 d)的表達(dá)特征。采用半定量RT-PCR檢測(cè)SS基因在黃顙魚腦、心臟、肌肉、胃、肝臟、腎臟、鰓、脾臟、性腺等組織中的表達(dá)特征?！窘Y(jié)果】 黃顙魚SS基因cDNA全長(zhǎng)694 bp，其中5′端非翻譯區(qū)139 bp，3′端非翻譯區(qū)211 bp，開放閱讀框?yàn)?45 bp，編碼114個(gè)氨基酸。黃顙魚與瓦氏黃顙魚SS基因編碼氨基酸同源性最高，為98%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，黃顙魚與同屬于鲇形目的瓦氏黃顙魚和斑點(diǎn)叉尾鮰聚為一支。SS基因在黃顙魚受精卵時(shí)期就有表達(dá)，并持續(xù)至胚胎孵化出膜，且在心跳期和出膜期的表達(dá)量顯著高于受精卵時(shí)期(P<0.05)；在出膜后的1～20 d，SS基因在黃顙魚中穩(wěn)定表達(dá)；在成魚的各個(gè)組織中，SS基因只在腦組織中特異性表達(dá)。【結(jié)論】 初步探明了SS基因在黃顙魚胚胎發(fā)育、胚后發(fā)育階段及成魚各組織中的表達(dá)規(guī)律，推測(cè)其可能在黃顙魚胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要的生理功能。

黃顙魚；生長(zhǎng)抑素；基因克?。槐磉_(dá)特征

生長(zhǎng)抑素(Somatostatin，SS)是一種由下丘腦分泌的抑制動(dòng)物腦垂體分泌生長(zhǎng)激素的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽，其具有激素和神經(jīng)遞質(zhì)雙重作用，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸、胰腺等各種組織中，是脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的主要負(fù)調(diào)控因子[1-3]。SS首先是從羊的下丘腦提取液中分離得到的，是含有14個(gè)氨基酸的多肽，氨基酸序列依次為Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys[4]。最初分離得到的含14個(gè)氨基酸的多肽只是SS家族中的一類，SS家族含有不同氨基酸鏈長(zhǎng)度和氨基酸組成多肽，在脊椎動(dòng)物中主要存在SS-14和SS-28(SS-14的N端延長(zhǎng)了14個(gè)氨基酸)2種生物活性多肽[5]。自20世紀(jì)80年代以來，國(guó)內(nèi)外先后克隆得到了大西洋鱈魚[6]、狗鯊[7]、虹鱒[8]、金魚[9]、中華鱘[10]、鱖[11]、團(tuán)頭魴[12]、齊口裂腹魚[13]、牙鲆[14]、斜帶石斑魚[15]等多種魚的SS基因。研究表明，SS具有抑制生長(zhǎng)激素釋放、參與調(diào)節(jié)滲透壓和調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育等方面的作用[16-18]。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一，屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)。近年來，黃顙魚人工育苗技術(shù)和養(yǎng)殖業(yè)得到了飛速發(fā)展，通過生理學(xué)方法調(diào)控提高黃顙魚苗種的成活率和生長(zhǎng)速度，對(duì)于黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的健康高效發(fā)展具有重要意義。本研究克隆獲得了與黃顙魚生長(zhǎng)密切相關(guān)的SS基因，并分析其在胚胎發(fā)育階段、早期發(fā)育階段不同時(shí)期和成魚不同組織中的表達(dá)規(guī)律，以期為今后黃顙魚SS調(diào)控機(jī)制的研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用材料取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所窯灣試驗(yàn)場(chǎng)。在胚胎發(fā)育階段，連續(xù)取受精卵樣品，各發(fā)育時(shí)期均取30粒；在胚后發(fā)育階段，對(duì)出生1～20 d仔魚連續(xù)取樣；選取健康、無損傷的成體黃顙魚，取其腦、心臟、肌肉、胃、肝臟、腎臟、鰓、脾臟、性腺等組織，樣品采集后迅速凍于液氮罐，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存。

1.2 SS基因的克隆

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已公布的鲇形目魚類(瓦氏黃顙魚，登錄號(hào)HQ830200；斑點(diǎn)叉尾鮰，登錄號(hào)NM_001200330)的SS基因cDNA序列，在其保守區(qū)內(nèi)采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物S1，用于擴(kuò)增黃顙魚SS基因中間保守區(qū)序列。根據(jù)獲得的黃顙魚SS基因中間保守區(qū)序列，設(shè)計(jì) 5′ RACE 和3′ RACE特異性引物S2和S3，其中S2用于擴(kuò)增SS基因的5′端序列，S3用于擴(kuò)增SS基因的3′端序列。將擴(kuò)增的保守區(qū)序列、5′端和3′端序列進(jìn)行拼接得到黃顙魚SS基因的cDNA序列全長(zhǎng)。根據(jù)克隆的cDNA全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物S4，作為檢測(cè)SS基因定量表達(dá)的特異性引物。同時(shí)根據(jù)黃顙魚β-actin基因(GenBank登錄號(hào)：EU161066)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β-actin的定量表達(dá)引物S5。所有引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成，相關(guān)信息見表1。

1.2.2 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成 將收集的成體黃顙魚各個(gè)組織約100 mg、胚胎各發(fā)育期的30粒受精卵和胚后發(fā)育的仔魚，分別利用Trizol Reagent(Invitrogen)按照使用說明提取總RNA。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，之后于 -80 ℃保存?zhèn)溆?。以總RNA為模板，根據(jù)RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第一鏈。

1.2.3SS基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增 以黃顙魚腦組織的cDNA第一鏈為模板，用S1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，Taq酶1.5 U，模板為1 μg，以ddH2O補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，36個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用DNA回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收和純化，將回收產(chǎn)物連接到pMD-18T Vector，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR，并將PCR呈陽性的克隆送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。分別采用引物S2和S3，通過SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國(guó)) 試劑盒進(jìn)行 5′ RACE、3′ RACE，用于擴(kuò)增SS基因5′ 和3′ 端序列，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 將Sanger法測(cè)序的黃顙魚SS基因中間保守區(qū)序列、5′端和3′端序列利用DNASTAR軟件進(jìn)行序列拼接，獲得SS基因cDNA全長(zhǎng)序列。再通過NCBI在線軟件進(jìn)行黃顙魚cDNA序列同源性、開放閱讀框和編碼區(qū)分析；用在線軟件Expasy(http://www.expasy.org/)預(yù)測(cè)SS基因編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；用軟件ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)進(jìn)行氨基酸序列疏水性分析；用NCBI的Protein Blast對(duì)黃顙魚SS基因進(jìn)行編碼氨基酸的同源性比對(duì)，并采用MAGA 5.0軟件構(gòu)建包括黃顙魚在內(nèi)的20個(gè)不同物種(瓦氏黃顙魚(登錄號(hào)：ADX32485)、斑點(diǎn)叉尾鮰(登錄號(hào)：NP001187259)、草魚(登錄號(hào)：ACB69423)、金魚(登錄號(hào)：AAD09359)、厚頜魴(登錄號(hào)：AAO92644.1)、斑馬魚(登錄號(hào)：AAH76254)、大西洋鮭(登錄號(hào)：NP001134573)、鎧甲弓背魚(登錄號(hào)：AAK97070)、高首鱘(登錄號(hào)：AAL13248)、中華鱘(登錄號(hào)：ACN88148)、大西洋鱈(登錄號(hào)：AAZ85702)、紅鰭東方鲀(登錄號(hào)：XP-003968367)、鱖AE(登錄號(hào)：J89925)、斜帶石斑魚(登錄號(hào)：AAU93565)、青鱂(登錄號(hào)：XP_004084505)、金頭鯛(登錄號(hào)：AFO52507)、雞(登錄號(hào)：CAA42747)、牛(登錄號(hào)：DAA33340)和人(登錄號(hào)：NP-001039))SS基因編碼氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 SS基因在胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育時(shí)期表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)

利用引物S4和內(nèi)參基因β-actin的引物S5，來檢測(cè)SS基因在黃顙魚胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育階段的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR Real-time PCR Premixture 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 SS基因在成魚不同組織中表達(dá)的半定量RT-PCR檢測(cè)

利用引物S4和內(nèi)參基因β-actin的引物S5，來檢測(cè)SS基因在黃顙魚成魚不同組織中的表達(dá)情況，半定量RT-PCR反應(yīng)體系為15 μL，其中10×Buffer 1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.3 μL，Taq酶1.0 U，模板1 μg，以ddH2O補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，36個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L 瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃顙魚SS cDNA的克隆

以引物S1擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增到長(zhǎng)度約為250 bp的特異性條帶(圖1)，對(duì)該條帶克隆測(cè)序后經(jīng)Blast分析，該條帶序列與瓦氏黃顙魚和斑點(diǎn)叉尾鮰等物種SS基因的一致性很高，故推測(cè)獲得的序列是黃顙魚SS基因的一部分;根據(jù)所獲得cDNA部分片段設(shè)計(jì)引物S2和S3分別擴(kuò)增SS基因5′端序列和3′端序列，擴(kuò)增得到的片段長(zhǎng)度約為189和366 bp，均與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致(圖1)。將得到的3段核苷酸序列進(jìn)行拼接，獲得黃顙魚SS基因的cDNA全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào)：JX441994)。

2.2 黃顙魚SS基因的生物信息學(xué)

黃顙魚SS基因cDNA全長(zhǎng)共694 bp，其中 5′端非翻譯區(qū)139 bp(1～139)，3′端非翻譯區(qū)211 bp(483～694)，開放閱讀框?yàn)?45 bp，編碼114個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SS蛋白分子質(zhì)量為 12 412.2 u，分子式為C538H874N154O166S8；理論等電點(diǎn)(pI)為6.26；該蛋白在水溶液中280 nm處的摩爾消光系數(shù)為7 240 mol/(L·cm)，不穩(wěn)定系數(shù)為 43.69，說明該基因表達(dá)的蛋白為不穩(wěn)定蛋白；若其成熟肽N端為丙氨酸時(shí)，在酵母和大腸桿菌中表達(dá)的半衰期分別大于20和10 h。疏/親水性預(yù)測(cè)表明，該蛋白存在一個(gè)高分值峰(得分>1.5)，在第16個(gè)氨基酸處其疏水性最大值為3.078；存在8個(gè)低分值峰(得分<-1)，在第101個(gè)氨基酸處其親水性最小值為-2.211，SS蛋白是一個(gè)親水蛋白(得分<0)。

2.3 黃顙魚SS基因編碼的氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用NCBI的Protein Blast對(duì)黃顙魚SS基因所推導(dǎo)的多肽氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，黃顙魚與同為鲇形目黃顙魚屬的瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachellii，登錄號(hào)ADX32485)SS基因編碼的氨基酸序列同源性最高，為98%，與鲇形目的斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus，登錄號(hào)NP001187259)同源性為89%，與草魚(登錄號(hào)ACB69423)、金魚(登錄號(hào)AAD09359)、厚頜魴(登錄號(hào)AAO92644.1)、斑馬魚(登錄號(hào)AAH76254)、大西洋鮭(登錄號(hào)NP001134573)和鎧甲弓背魚(登錄號(hào)AAK97070)的同源性分別為72%，73%，72%，73%，68%和75%，與雞、牛和人的同源性也較高。表明該蛋白在不同物種中均有較高的保守性(圖2)。

運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建了20個(gè)不同物種SS基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖3)顯示，黃顙魚與同屬于鲇形目的瓦氏黃顙魚、斑點(diǎn)叉尾鮰首先聚為一支，然后與草魚、金魚、厚頜魴、斑馬魚、大西洋鮭和鎧甲弓背魚聚為一支。

2.4 SS基因在黃顙魚胚胎發(fā)育階段的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)檢測(cè)黃顙魚SS基因在胚胎發(fā)育階段的表達(dá)情況，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，與受精卵時(shí)期相比，SS基因在黃顙魚的2細(xì)胞期至囊胚期的表達(dá)水平略有下降，但差異不顯著(P>0.05)；自原腸早期至出膜期SS基因表達(dá)量有增高的趨勢(shì)，其中在心跳期、出膜期其表達(dá)量顯著高于受精卵時(shí)期(P<0.05)。

2.5 SS基因在黃顙魚胚后發(fā)育階段的表達(dá)

圖5顯示，黃顙魚在出膜后的1～20 d，SS基因都有表達(dá)，只是3～4 d表達(dá)量有所下降，在其他時(shí)間SS表達(dá)水平變化不大。

2.6 SS基因在黃顙魚各組織中的表達(dá)

采用半定量RT-PCR檢測(cè)黃顙魚SS基因在心臟、肌肉、腦、胃、肝臟、腎臟、鰓、脾臟、性腺9個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，SS只在腦組織中特異性表達(dá)，在其他組織中都沒有表達(dá)(圖6)。

3 討 論

SS是一種廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的多功能肽，在魚類中調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝等多個(gè)生理過程[1-4]。本研究成功獲得了黃顙魚SS基因的cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)為JX441994)，對(duì)包括黃顙魚在內(nèi)的20個(gè)不同物種SS基因編碼氨基酸序列的同源性分析表明，SS基因在脊椎動(dòng)物進(jìn)化史中具有高度的保守性。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，同為鲇形目的黃顙魚、瓦氏黃顙魚和斑點(diǎn)叉尾鮰首先聚為一支，然后與草魚、金魚、厚頜魴、斑馬魚、大西洋鮭和鎧甲弓背魚聚為一支，高首鱘、中華鱘與人、牛和雞聚為另一支，該結(jié)果與Lin等[5]和Quan等[7]的研究結(jié)果相似，表明SS是一個(gè)比較古老的基因。

本研究中，SS基因在黃顙魚胚胎發(fā)育階段及胚后發(fā)育過程中的表達(dá)表明，在黃顙魚整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期，SS基因都有表達(dá)，從受精卵時(shí)期到囊胚期略有下降，但差異不顯著(P>0.05)，從原腸早期至出膜期其表達(dá)量有升高的趨勢(shì)，在心跳期和出膜期其表達(dá)量均較高，顯著高于受精卵時(shí)期的表達(dá)量(P<0.05)。Xu等[6]在研究大西洋鱈魚時(shí)發(fā)現(xiàn)，SS基因在大西洋鱈魚胚胎期均有表達(dá)，且表達(dá)呈上升趨勢(shì)。斜帶石斑魚的胚胎發(fā)育至幼體孵化過程中均可檢測(cè)到SS的表達(dá)，且SS表達(dá)量隨著胚胎發(fā)育時(shí)期的推進(jìn)而升高，在出膜前表達(dá)量達(dá)到最高，出膜后表達(dá)量變化不大，維持在一個(gè)較高水平[15]。在虹鱒整個(gè)胚胎發(fā)育過程中也能檢測(cè)到SS基因的表達(dá)，且隨著胚胎發(fā)育時(shí)期的推進(jìn)SS基因的表達(dá)量增加[19]。在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，SS基因在受精24 h后即可被檢測(cè)到，從受精24 h到出膜期SS一直有表達(dá)，且表達(dá)量逐漸增加[20]。本研究中，在黃顙魚胚后發(fā)育過程中，SS基因表達(dá)水平比較穩(wěn)定。不同魚類其SS基因在早期發(fā)育階段的表達(dá)水平有所差異，但都是在出膜前表達(dá)量達(dá)到最大，且胚后時(shí)期維持在一個(gè)較平穩(wěn)水平。黃顙魚SS基因在出膜期表達(dá)量最高，胚后發(fā)育過程中其維持在一個(gè)平穩(wěn)水平，從黃顙魚胚胎發(fā)育過程中SS基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平來看，SS基因?qū)S顙魚早期胚胎的發(fā)育無太大影響，其主要在原腸期開始發(fā)揮調(diào)控作用。

在不同物種的成體組織中，SS基因的表達(dá)情況不盡相同。Li等[10]在中華鱘的腦垂體、下丘腦、端腦、延腦中均檢測(cè)到SS的表達(dá)；葉星[21]在斜帶石斑魚各個(gè)組織中得到了與中華鱘相似的結(jié)果，SS在端腦、脊髓、延腦、下丘腦、嗅球都有表達(dá)；代威等[11]在鱖腦組織中檢測(cè)到了SS基因的表達(dá)。本研究中，SS基因只在黃顙魚成魚的腦組織中表達(dá)，這與上述研究結(jié)果一致。但前人在一些魚類的外周組織中也檢測(cè)到了SS的表達(dá)，如Kittilson等[22]運(yùn)用Northern blot檢測(cè)了SS在虹鱒體內(nèi)各個(gè)組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腦、胃、腸組織都有SS的表達(dá)，其中以腦組織中SS表達(dá)量最高。黃顙魚SS基因在腦中的特異性表達(dá)說明，SS是一種專一的調(diào)節(jié)激素，只參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)生長(zhǎng)激素釋放的調(diào)控。

[1] Trabucchi M,Tostivint H,Lihrmann I,et al.Polygenic expression ofsomatostatinin the sturgeon,Acipensertransmontanus:Molecular cloning and distribution of the mRNAs encoding two somatostatin precursors [J].Comp Neurol,2002,443:332-345.

[2] Patel Y C.Somatostainand its receptor family [J].Fornt Neuroendocrinol,1999,20(3):157-198.

[3] Lin X W.Petr R E.Somatostatinsand their receptors in fish [J].Comp Biochem Physiol,2001,129(2/3):543-550.

[4] Brazeau P,Vale W W,Burgus R,et al.Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary growth hormone [J].Science,1973,179:77-79.

[5] Lin X W,Otto C J,Peter R E,et al.Evolution of neuroendocrine peptide systems:Gonadotropin-releasing hormone and somatostatin [J].Comp Biochern Physiol,1998,119c:375-388.

[6] Xu M Y,Volkoff H.Cloning,tissue distribution and effects of food deprivation on pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)/PACAP-related peptide (PRP) and preprosomatostatin 1 (PSS1) in Atlantic cod (Gadusmorhua) [J].Peptides,2009,30:766-776.

[7] Quan F B,Kenigfest N B,Mazan S,et al.Molecular cloning of the cDNAs encoding three somatostatin variants in the dogfish (Scylorhinuscanicula) [J].General and Comparative Endocrinology,2013,180:1-6.

[8] Kittilson J D,Moore C A,Sheridan M A.Polygenic expression ofsomatostatinin rainbow trout,Oncorhynchusmykiss:Evidence of a preprosomatostatin encoding somatostatin-14 [J].General and Comparative Endocrinology,1999,114:88-96.

[9] Lin X W,Otto C J,Peter R E.Expression of three distinctsomatostainmessenger ribonucleic acids (mRNAs) in goldfish brain:Characterization of the complementary deoxyribonucleic acids,distribution and seasonal variation of the mRNAs,and action of a somatostatin-14 variant [J].Endocrinology,1999,140(5):2089-2099.

[10] Li C J,Wei Q W,Zhou L,et al.Molecular and expression characterization of twosomatostatingenes in the Chinese sturgeon,Acipensersinensis[J].Comparative Biochemistry and Physiology,2009,154:127-134.

[11] 代 威,趙金良,劉 俊,等.鱖三種生長(zhǎng)抑素cDNA全長(zhǎng)克隆、組織表達(dá)及其在腦中定位分析 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2012,36(9):1337-1348.

Dai W,Zhao J L,Liu J,et al.Cloning tissue expression of threesomatostatingenes ofSinipercachuatsiand their localization in brain [J].Journal of Fisheries of China,2012,36(9):1337-1348.(in Chinese)

[12] 俞菊華,夏德全,楊 弘,等.RACE法分離團(tuán)頭魴生長(zhǎng)抑素全長(zhǎng)cDNA及其序列測(cè)定 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2003,27(6):533-539.

Yu J H,Xia D Q,Yang H,et al.Isolation and sequencesomatostatincDNA ofMegalobramapellegrini[J].Journal of Fisheries of China,2003,27(6):533-539.(in Chinese)

[13] 方 靜,樊均德,何 敏.生長(zhǎng)抑素在齊口裂腹魚消化道和腦中的定位 [J].水生生物學(xué)報(bào),2009,33(3):478-483.

Fang J,Fan J D,He M.The distributive patterns ofsomatostatinin the digestive tract and brain ofSchizothoraxprenanti[J].Acta Hydrobiologica Sinica,2009,33(3):478-483.(in Chinese)

[14] 陳曉武,施志儀,江 山,等.牙鲆生長(zhǎng)抑素基因的表達(dá)及細(xì)胞定位 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2012,36(4):497-502.

Chen X W,Shi Z Y,Jiang S,et al.Expression and cellular localization ofsomatostatinfromParalichthysolivaceus[J].Journal of Fisheries of China,2012,36(4):497-502.(in Chinese)

[15] Ye X,Li W S,Lin H R.Polygenic expression ofsomatostatinin orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides):Molecular cloning and distribution of the mRNA encoding three somatostatin precursors [J].Molecular and Cellular Endocrinology,2005,241:62-72.

[16] Ehrman M M,Melroe G T,Moore C A,et al.Nutritional regulation ofsomatostatinexpression in rainbow trout,Oncorhynchusmykiss[J].Fish Physiol Biochem,2002,26(4):309-314.

[17] Holloway A C,Leatherland J F.Neuroendocrine regulation of growth hormone secretion in teleost fishes with emphasis on the involvement of gonadal sex steroids [J].Rev FishBiol Fish,1998,8(4):409-429.

[18] Eilertson C D,Sheridan M A.Differential effects of somatostatin-14 and somatostatin-25 on carbohydrate and lipid metabolism in rainbow troutOncorhynchusmykiss[J].Gen Comp Endocrinol,1993,92(1):62-70.

[19] Malkuch H,Walock C,Kittilson J D,et al.Differential expression of preprosomatostatin andsomatostatinreceptor-encoding mRNAs in association with the growth hormone-insulin-like growth factor system during embryonic development of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) [J].General and Comparative Endocrinology,2008,159:136-142.

[20] Devos N,Deflorian G,Biemar F,et al.Different expression of twosomatostatingenes during zebrafish embryonic development [J].Mechanisms of Develoment,2002,115:133-137.

[21] 葉 星.斜帶石斑魚生長(zhǎng)抑素前體基因的克隆、表達(dá)和基因重組 [D].廣州：中山大學(xué)，2005

Ye X.Molecular cloning,distribution of the mRNAs encodingsomatostatinprecursors inEpinepheluscoioidesand expression of the SS14 recombinant fusion protein [D].Guangzhou:Sun Yat-Sen University,2005(in Chinese).

[22] Kittilson J D,Moore C A,Sheridan M A.Polygenic expression ofsomatostatinin rainbow trout,Oncorhynchusmykiss:Evidence of a preprosomatostatin encoding somatostatin-14 [J].General and Comparative Endocrinology,1999,114:88-96.

Cloning and expression analysis ofsomatostatingene inPelteobagrusfulvidraco

LIANG Hong-wei1,2,CAO Lei1,3,LI Zhong1,3,ZOU Gui-wei1,3

(1YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheriesScience,Wuhan,Hubei430223,China;2FreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenterofHubeiProvince,Wuhan,Hubei430070,China;3CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China)

【Objective】 The objectives of this experiment were to clonesomatostatin(SS) gene sequence ofPelteobagrusfulvidracoand analyze the sequence and its expression characterization.【Method】 A pair of primers were designed based on conserved domain ofSSgene ofPelteobagrusvachelliiandIctaluruspunctatus.The conserved domain ofSSgene was cloned fromPelteobagrusfulvidracobrain total RNA by PCR method.Then two pairs of specific primers based on their middle conserved sequences were used to obtain 5′and 3′end sequences.The full sequence ofSScDNA ofPelteobagrusfulvidracowas obtained by combining the middle conserved fragment with 5′and 3′end sequences.The homologous analysis was performed based on encoding amino acid sequences ofPelteobagrusfulvidracoand other fishes using online Protein Blast,and Phylogenetic tree was constructed by MEGA 5.0.Real-time PCR was used to analyze the expression patterns during the embryonic development stage and postembryonic development stage ofSSgene (1-20 d).Distribution and expression levels ofSSgene in tissues including brain,heart,muscle,stomach,liver,kidney,gill,spleen and gonad were analyzed by semi-quantitative RT-PCR.【Result】 The full-length ofSScDNA inPelteobagrusfulvidracowas 694 bp,containing 139 bp 5′-untranslated region and 211 bp 3′-untranslated region.The length of open reading frame (ORF) was 345 bp encoding 114 amino acids and had high homology withPelteobagrusvachellii(98%).The phylogenetic analysis showed thatPelteobagrusfulvidraco,PelteobagrusvachelliiandIctaluruspunctatuswere from one group.The somatostatin gene was expressed in the whole embryonic development stage and postembryonic development of 20-day old juveniles.The expression levels in the heart beat stage and hatch out stage were significantly higher than in fertilized egg (P<0.05).SSmRNA was only detected in brain of adultPelteobagrusfulvidraco.【Conclusion】 The expression patterns of somatostatin gene were preliminarily proved and somatostatin gene may play an important role in postembryonic development ofPelteobagrusfulvidraco.

Pelteobagrusfulvidraco;somatostatin;gene clone;expression characterization

2013-11-01

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100401)；國(guó)家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)項(xiàng)目

梁宏偉(1978-)，男，山西繁峙人，副研究員，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究。 E-mail：lianghw@yfi.ac.cn

鄒桂偉(1963-)，男，安徽廬江人，研究員，主要從事魚類遺傳育種研究。E-mail：zougw@yfi.ac.cn

時(shí)間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.030

S965.199；Q786

A

1671-9387(2015)03-0043-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.030.html