產(chǎn)漆酶真菌篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

柴新義，安雙登，盛 碩，蘇 海

(滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院， 安徽 滁州 239000)

產(chǎn)漆酶真菌篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

柴新義，安雙登，盛 碩，蘇 海

(滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院， 安徽 滁州 239000)

【目的】 從11株野生大型真菌中篩選具有產(chǎn)漆酶活性的大型真菌，并對漆酶活性較高的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化，為將其投入工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。【方法】 以采集自安徽省瑯琊山的11株真菌為材料，通過平板顯色反應(yīng)，篩選具有產(chǎn)漆酶活性的大型真菌菌株，再用液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法優(yōu)化大型真菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成，并對優(yōu)化條件進(jìn)行驗證。【結(jié)果】 ①在供試的11株野生大型真菌中，有6株具產(chǎn)漆酶活性，占54.5%；其中有柄樹舌靈芝(Ganodermagibbosum) CZSWXY0001具有較高的產(chǎn)漆酶能力，其產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳碳源為蔗糖，氮源為酵母膏。②優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：蔗糖20 g/L，酵母膏 2 g/L，K2HPO43.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS) 3 mg/L，Cu2+濃度6 mmol/L，pH 7.0。培養(yǎng)基優(yōu)化后,有柄樹舌靈芝菌株所產(chǎn)漆酶活性達(dá)到496.18 U/mL，約是優(yōu)化前的12.2倍。【結(jié)論】 有柄樹舌靈芝CZSWXY0001具有較好的產(chǎn)漆酶活性。

漆酶；有柄樹舌靈芝；酶活力；發(fā)酵條件

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于植物、真菌、細(xì)菌、昆蟲中，擔(dān)子菌中的白腐菌是漆酶最重要的生產(chǎn)者之一[1-3]，漆酶由于有著廣闊的應(yīng)用價值而備受關(guān)注，是生物科學(xué)、化學(xué)、食品工業(yè)、環(huán)境保護(hù)和造紙工業(yè)等眾多領(lǐng)域的應(yīng)用研究熱點[4-6]。目前，從野生大型真菌中篩選高產(chǎn)漆酶菌種的研究報道較少，為篩選具有較高產(chǎn)漆酶活性的野生大型真菌菌種,探討工業(yè)化液體產(chǎn)酶條件，本試驗對采集自安徽省瑯琊山森林保護(hù)區(qū)的11株野生大型真菌，進(jìn)行高產(chǎn)漆酶活性菌株初篩、復(fù)篩，并對篩選出的菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為將該菌株用于工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 用于試驗研究的野生大型真菌共11株，均從安徽省瑯琊山森林自然保護(hù)區(qū)采集分離獲得。菌種保存于滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物研究室。

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L。該培養(yǎng)基主要用于大型真菌的分離、純化、保存和菌種的活化等。

(2)愈創(chuàng)木酚PDA培養(yǎng)基。在PDA培養(yǎng)基中添加0.04%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的愈創(chuàng)木酚。該培養(yǎng)基主要用于具有產(chǎn)漆酶活性大型真菌的初篩。

(3)液體種子培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏5.0 g/L,KH2PO43.0 g/L,MgSO4·7H2O 3.0 g/L，VB110.0 mg/L。該培養(yǎng)基主要用于培養(yǎng)具有產(chǎn)漆酶活性的大型真菌的液體菌種。

(4)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基。葡萄糖20 g/L，NH4Cl 2.5 g/L,K2HPO43.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.006 g/L,pH自然。該培養(yǎng)基主要用于具有較高產(chǎn)漆酶能力大型真菌的復(fù)篩及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。

1.2 方 法

1.2.1 高產(chǎn)漆酶活性菌株的篩選 (1)初篩。應(yīng)用愈創(chuàng)木酚PDA培養(yǎng)基，通過平板顯色反應(yīng)的方法，對野外采集分離的11株大型真菌菌株進(jìn)行初篩試驗，于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，測量菌落和變色圈的大小，初篩出生長快且具有產(chǎn)漆酶活性的大型真菌菌株。每菌株3個重復(fù)。

(2)復(fù)篩。運(yùn)用液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基對初篩出的大型真菌菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，利用分光光度計測定吸光值，并計算酶活性，復(fù)篩出具有較高產(chǎn)漆酶活性且產(chǎn)酶穩(wěn)定的大型真菌菌種，并將其作為優(yōu)化產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件的菌種。

1.2.2 液體菌種的制備 在250 mL錐形瓶中裝入50 mL的液體種子培養(yǎng)基，將復(fù)篩的菌株接種至液體種子培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150 r/min、28 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 漆酶的發(fā)酵培養(yǎng) 在250 mL錐形瓶中裝入70 mL的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將液體種子培養(yǎng)基按照10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的接種量接種至液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150 r/min、28 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.2.4 漆酶的制備 將1.2.3中培養(yǎng)的發(fā)酵液于4 500 r/min 離心15～20 min，取上清液，即為漆酶的粗酶液。

1.2.5 漆酶酶活性的測定 在4 mL pH 6.0的0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液 (含有1 mL 1 mol/L愈創(chuàng)木酚)中,加入1 mL稀釋的漆酶粗酶液，混合均勻后，于25 ℃反應(yīng)10 min，在465 nm處測定吸收值的增量。漆酶酶活性定義為：在上述條件下，每分鐘催化1 μmol底物所需要的酶量為1個酶活性單位，即1 U。

1.2.6 漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化 (1)最適碳源的篩選。在液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麩皮、玉米粉、CMC-Na為惟一碳源。將培養(yǎng)的有柄樹舌靈芝CZSWXY0001液體菌種，分別按10%的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、25 ℃下培養(yǎng)7 d，分別測定酶活性大小，每處理3個重復(fù)。

(2)最適氮源的篩選。在液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以 2 g/L的 NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、酵母膏、尿素為惟一氮源。其余同碳源試驗。

(3)最適起始pH值的確定。分別調(diào)節(jié)產(chǎn)酶起始pH值為4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0。接種量為10%，150 r/min培養(yǎng)7 d，分別測定漆酶活性大小，每處理3個重復(fù)。

(4)最適表面活性劑的確定。在液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別加入Tween80、SDS(十二烷基硫酸鈉)和PEG(聚乙二醇)作為表面活性劑，且每種表面活性劑分別設(shè)置1，3和5 mg/L 3個處理。培養(yǎng)及測定同碳、氮源試驗。

(5)最適Cu2+濃度的確定。在液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)CuSO4的加入量，使Cu2+的濃度分別為2,4,6,8 和10 mmol/L。培養(yǎng)及測定同碳源試驗。

(6)最適溫度的確定。將液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于20,25,30,35,40 ℃條件下，接種量為10%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)7 d，分別測定漆酶活性大小，每處理3個重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel 2003軟件和DPS7.55軟件處理。多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法，比較不同處理間菌落生長及產(chǎn)漆酶能力的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶活性菌株的篩選

2.1.1 菌株的初篩 表1表明，供試的11株真菌中，有6株具有較好的產(chǎn)漆酶活性，占54.5%；但不同菌株之間的菌落生長速度存在較大差異，其中以云芝CZSWXY0003 和有柄樹舌靈芝CZSWXY0001的生長速度最快，與其他菌株之間存在極顯著差異；從產(chǎn)漆酶形成變色圈的直徑大小來看，有柄樹舌靈芝CZSWXY0001最大，與其他各菌株之間有極顯著差異。綜合比較初篩結(jié)果認(rèn)為，有柄樹舌靈芝CZSWXY0001為最佳的產(chǎn)漆酶活性菌株。

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。下同。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) and different capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same below.

2.1.2 菌株的復(fù)篩 對初篩出來的6株真菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果(表2)表明，這6株真菌產(chǎn)漆酶活性有一定差異，大小順序依次為：CZSWXY0001>CZSWXY0003>CZSWXY0006>CZSWXY0002>CZSWXY0005>CZSWXY0004，其中以有柄樹舌靈芝CZSWXY0001的產(chǎn)漆酶活性最強(qiáng)，與其余菌株之間差異極顯著，與初篩結(jié)果基本一致。所以，以有柄樹舌靈芝CZSWXY0001作為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 漆酶發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 最適碳源的篩選 由圖1可以看出，不同碳源對有柄樹舌靈芝CZSWXY0001所產(chǎn)漆酶活性的影響有差別，蔗糖作為碳源時酶活性最強(qiáng)(41.67 U/mL),且與其他碳源間差異極顯著。因此，以蔗糖作為有柄樹舌靈芝CZSWXY0001產(chǎn)漆酶的最適碳源。

2.2.2 最適氮源的篩選 圖2表明，不同氮源物質(zhì)對有柄樹舌靈芝CZSWXY0001所產(chǎn)漆酶活性的影響不同，以酵母膏為氮源時，酶活性最強(qiáng)(36.33 U/mL)，且與其他氮源之間差異極顯著。因此，選擇酵母膏作為有柄樹舌靈芝CZSWXY0001產(chǎn)漆酶的最適氮源。

2.2.3 最適起始pH值的確定 圖3表明，漆酶生產(chǎn)受培養(yǎng)基pH值的影響較為明顯，當(dāng)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值為7時，有柄樹舌靈芝CZSWXY0001所產(chǎn)漆酶活性最高，與其他pH值之間差異極顯著；pH值大于或低于7，菌株產(chǎn)漆酶活性均會受到不同程度的影響。

2.2.4 最適表面活性劑的確定 圖4表明，表面活性劑對有柄樹舌靈芝CZSWXY0001所產(chǎn)漆酶活性的影響不同，以3 mg/L SDS(十二烷基硫酸鈉)最有利于漆酶的生產(chǎn)。

圖1 不同碳源對有柄樹舌靈芝CZSWXY001產(chǎn)漆酶活性的影響標(biāo)不同小寫字母者表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。下圖同
Fig.1 Effect of different carbon sources on laccase-producing activity ofGanodermagibbosumCZSWXY001Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),and capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same below

圖2 不同氮源對有柄樹舌靈芝CZSWXY001產(chǎn)漆酶活性的影響
Fig.2 Effect of different nitrogen sources on laccase-producing activity ofGanodermagibbosumCZSWXY001

2.2.5 最適Cu2+濃度的確定 圖5表明，Cu2+濃度為6 mmol/L時，有柄樹舌靈芝產(chǎn)漆酶的效果最佳，且與其他處理之間差異顯著；隨著Cu2+濃度的繼續(xù)增加，菌株的產(chǎn)漆酶活性降低，產(chǎn)生抑制作用。故在生產(chǎn)實踐中可選用6 mmol/L Cu2+作為有柄樹舌靈芝CZSWXY0001產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中的最適Cu2+濃度。

2.2.6 最適溫度的確定 圖6表明，溫度對有柄樹舌靈芝CZSWXY0001所產(chǎn)漆酶活性有一定的影響，25 ℃時產(chǎn)漆酶活性最強(qiáng)，達(dá)64.67 U/mL，且與其他溫度間差異極顯著。培養(yǎng)溫度過高或過低都不利于真菌漆酶的生產(chǎn)。

2.3 真菌菌株產(chǎn)漆酶優(yōu)化條件的驗證

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，配制優(yōu)化培養(yǎng)基，其中蔗糖20 g/L，酵母膏 2 g/L,K2HPO43.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L，表面活性劑SDS 3 mg/L,Cu2+濃度6 mmol/L,pH 7.0。比較優(yōu)化后培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基所產(chǎn)漆酶活性的高低發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基優(yōu)化后，有柄樹舌靈芝CZSWXY0001所產(chǎn)漆酶活性達(dá)到496.18 U/mL，約是優(yōu)化前(40.67 U/mL)的12.2倍。

3 討 論

真菌漆酶對碳源的利用程度和效率不同。本研究結(jié)果顯示，蔗糖作為碳源時有柄樹舌靈芝CZSWXY0001產(chǎn)漆酶活性最強(qiáng)(41.67 U/mL),且與其他碳源差異極顯著。說明真菌漆酶對不同碳源的利用程度和效率不同，許多研究也證實了該點[7-9]。許多研究還證實，有機(jī)氮源對真菌產(chǎn)漆酶的影響優(yōu)于無機(jī)氮源[7，9-10]，這可能與有機(jī)氮源富含各種氨基酸，可直接被菌體吸收利用有關(guān)。但也有研究證明，無機(jī)氮源為真菌產(chǎn)漆酶的最佳氮源[11-12]。這些研究結(jié)果的差異，可能是由于不同真菌對不同氮源物質(zhì)的利用程度和效率存在差異所致。

有研究表明，真菌產(chǎn)漆酶的最適pH值是偏酸性的[10-11，13]。本研究表明，當(dāng)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值為7時，有柄樹舌靈芝CZSWXY0001的產(chǎn)漆酶活性最高，且與其他pH值之間差異極顯著，初始pH大于或低于7，其產(chǎn)漆酶活性均受到不同程度的影響。由于酶的活性部位通常含有非常重要的堿性或酸性基團(tuán)，所以每一種酶都會有自己最適的pH值。另外，最適pH值不同可能也與真菌所屬種類及其生物學(xué)特性不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，不同的表面活性劑及其質(zhì)量濃度對有柄樹舌靈芝CZSWXY0001所產(chǎn)漆酶活性的影響不同，以3 mg/L SDS(十二烷基硫酸鈉)最有利于漆酶的生產(chǎn)。也有研究表明，非離子型表面活性劑如吐溫80 等對真菌產(chǎn)漆酶有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而離子型表面活性劑如 SDS 等則明顯抑制產(chǎn)酶[14]。目前，有關(guān)表面活性劑對真菌產(chǎn)漆酶的影響機(jī)制尚無一致結(jié)論[12，15]，其對真菌產(chǎn)漆酶的影響可能是多方面的。

溫度對有柄樹舌靈芝CZSWXY0001所產(chǎn)漆酶活性有一定的影響，本研究結(jié)果表明，25 ℃時產(chǎn)漆酶活性最強(qiáng)，這與許多研究結(jié)果(真菌的最適產(chǎn)酶溫度在 25～31 ℃)基本一致[10，14，16]。

有些研究證明，在產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基中添加一些含有木質(zhì)素的物質(zhì)可提高木腐菌的產(chǎn)漆酶能力[17-19]。如王宜磊[17]研究證實，麥麩可使彩絨革蓋菌Coriolusversicolor所產(chǎn)漆酶活性由 131 U/mL 提高到622 U/mL；趙文娟等[19]研究證明，麥麩對裂褶菌產(chǎn)漆酶有促進(jìn)作用，且其產(chǎn)漆酶量與添加麥麩量有直接關(guān)聯(lián)。但也有一些研究證實，麥麩并非真菌產(chǎn)漆酶的最佳碳源[8-10]，這與本研究結(jié)果一致，推斷可能是因為不同的碳源物質(zhì)對不同種類真菌產(chǎn)漆酶的影響有別，特別是培養(yǎng)基中添加天然植物物料時，到底是物料的何種成分在起作用，也值得深入研究。

目前，許多產(chǎn)漆酶真菌的篩選和應(yīng)用仍是在實驗室條件下進(jìn)行的，幾乎未涉及到實際生產(chǎn)上的應(yīng)用。因此，進(jìn)一步開展應(yīng)用于生產(chǎn)實際的研究，將具有巨大的經(jīng)濟(jì)意義和社會意義。

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Hansen等研究了新產(chǎn)品開發(fā)活動中創(chuàng)意的創(chuàng)新價值鏈，類似于創(chuàng)意生成、篩選、開發(fā)及擴(kuò)散的過程。但是只重點分析了大型分散的跨國公司，這個創(chuàng)新流程不適合小型、單個單元的公司。這些相關(guān)模型都是新產(chǎn)品開發(fā)（NPD）的原型，基本都認(rèn)為產(chǎn)品創(chuàng)新過程是一個線性順序階段：創(chuàng)意生成、創(chuàng)意篩選、研究開發(fā)、投放市場。Hartono提出了一個整體性的三部創(chuàng)新過程，創(chuàng)意產(chǎn)生階段（結(jié)合外部伙伴和內(nèi)部單元進(jìn)行研發(fā)活動）、轉(zhuǎn)化階段（整合新創(chuàng)意轉(zhuǎn)為創(chuàng)新輸出）、運(yùn)用階段（創(chuàng)新成品和公司績效）。以能力為基礎(chǔ)的開發(fā)新創(chuàng)意的模型，以整合新創(chuàng)意與公司能力為視角，在一個更寬廣的內(nèi)外部知識資源及創(chuàng)新活動基礎(chǔ)上，研究新產(chǎn)品的創(chuàng)新流程。

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Screening of laccase-producing wild macrofungi and optimization of production conditions

CHAI Xin-yi,AN Shuang-deng,SHENG Shuo,SU Hai

(SchoolofBiologyandFoodEngineering,ChuzhouUniversity,Chuzhou,Anhui239000,China)

【Objective】 The specific objectives of the study were to screen laccase-producing wild macrofungi from 11 strains and optimize their optimal production conditions,which could improve the industrialization of laccase-producing strains.【Method】 11 wild fungi strains collected from Langya Mountain in Anhui were studied to screen strains with laccase-producing ability through the plate-color reaction.Shake flask culturing method was then used to get optimal culture media and conditions.【Result】 (1) 6 out of the 11 tested strains had laccase-producing activity with the ratio of 54.5%.Ganodermagibbosumhad the highest laccase-producing ability with the best carbon and nitrogen sources of sucrose and yeast extract,respectively.(2) The optimal medium was:sucrose 20 g/L,yeast 2 g/L,K2HPO43.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) 3 mg/L,and copper ion concentration 6 mmol/L at the pH of 7.0.Enzyme activity under the optimal conditions was 496.18 U/mL,which was 12.2 times of the original medium.【Conclusion】 Ganoderma gibbosum CZSWXY0001 had good-laccase producing ability.

Laccase;Ganodermagibbosum;enzyme activity;fermentation conditions

2013-11-02

安徽省教育廳自然科學(xué)基金項目(KJ2012Z287)；滁州學(xué)院生物工程科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(CZTD201104)；滁州學(xué)院科研啟動基金項目(2014qd047)

柴新義(1978-)，男，安徽蕭縣人，副教授，博士，主要從事真菌資源及其利用研究。E-mail:xinyianhui@163.com

時間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.021

Q939.97

A

1671-9387(2015)03-0205-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.021.html