抑郁癥患者多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因可變串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性研究

唐洪燕，郭宗君，李玉煥，楊虎梅，徐圣芬，赤海嬌，陳 娟

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·專題研究·

抑郁癥患者多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因可變串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性研究

唐洪燕，郭宗君，李玉煥，楊虎梅，徐圣芬，赤海嬌，陳 娟

目的 探討抑郁癥患者多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)基因3′非翻譯區(qū)域的40 bp可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)多態(tài)性。方法 選取2011年10月—2014年3月就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院和青島市精神衛(wèi)生中心住院及門診的抑郁癥患者116例作為抑郁組，同期選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院體檢健康者172例作為對(duì)照組。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-VNTR多態(tài)性分析技術(shù)行DAT基因VNTR多態(tài)性檢測(cè)。結(jié)果 共檢測(cè)出520、480、440、380、360 bp 5種等位基因，分別為DAT基因的VNTR多態(tài)性11、10、9、7.5、7次重復(fù)序列。6種基因型分別為：480 bp/480 bp、480 bp/440 bp、520 bp/480 bp、480 bp/380 bp、480 bp/360 bp、440 bp/440 bp。抑郁組和對(duì)照組的基因型分布和等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(抑郁組：χ2=1.380，P=0.848；對(duì)照組：χ2=0.051，P=0.990)。抑郁組與對(duì)照組基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中兩組480 bp/480 bp和480 bp/440 bp基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.375，P<0.001；χ2=4.976，P<0.05)。兩組等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 DAT基因VNTR多態(tài)性可能與抑郁癥的發(fā)病相關(guān)，為進(jìn)一步的臨床研究提供了借鑒。

抑郁癥；多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；串聯(lián)重復(fù)序列；基因；多態(tài)性，單核苷酸

唐洪燕，郭宗君，李玉煥，等.抑郁癥患者多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因可變串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(24)：2885-2888.[www.chinagp.net]

Tang HY，Guo ZJ,Li YH,et al.Variable number of tandem repeat polymorphism of DAT gene in patients with depressive disorder[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2885-2888.

抑郁癥是一種常見的危害人類身心健康的疾病，多巴胺系統(tǒng)調(diào)控異常是其發(fā)病原因之一[1]，特別是多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)在抑郁癥的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2]。抑郁癥與較高的DAT密度相關(guān)[2]。DAT最常描述的多態(tài)性是位于外顯子15上的cDNA 3′末端非翻譯區(qū)(3′UTR)的40 bp 可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，常引起7個(gè)等位基因從3～11串聯(lián)重復(fù)，其中9/10-重復(fù)等位基因可能導(dǎo)致DAT結(jié)合潛能的增高，從而減少突觸間隙的多巴胺水平[3]，可能與抑郁癥的發(fā)展有一定關(guān)系[4-7]。但我國(guó)關(guān)于此類研究較少，故本研究將探討抑郁癥患者DAT基因VNTR的多態(tài)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011年10月—2014年3月就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院和青島市精神衛(wèi)生中心住院及門診的抑郁癥患者116例作為抑郁組，其中男46例，女70例；平均年齡(30±6)歲；受教育年限(10±3)年。入組標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18～55歲；(2)符合《中國(guó)精神障礙診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)第3版(CCMD-3)》抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(3)漢密爾頓抑郁量表(HAMD)評(píng)分≥18分,漢密爾頓焦慮量表(HAMA)評(píng)分<14分，簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表(MMSE)評(píng)分>26分；(4)無其他器質(zhì)性或藥物引起的繼發(fā)性抑郁癥或雙相情感障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重的心、腦、腎等軀體疾病及超過5 min以上的意識(shí)障礙史，腦創(chuàng)傷史或手術(shù)史；(2)藥物引起的繼發(fā)性抑郁癥或雙相情感障礙及嚴(yán)重的自殺傾向或精神障礙史。

同期選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院的體檢健康者172例作為對(duì)照組，其中男60例，女112例；平均年齡(32±4)歲；受教育年限(11±2)年。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～55歲；(2)均不符合《中國(guó)精神障礙診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)第3版(CCMD-3)》抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(3)HAMD評(píng)分<8分，HAMA評(píng)分<7分，MMSE評(píng)分>26分；(4)排除嚴(yán)重的心、腦、腎等軀體疾病及超過5 min以上的意識(shí)障礙史、腦創(chuàng)傷史或手術(shù)史。

本研究得到青島大學(xué)附屬醫(yī)院及青島市精神衛(wèi)生中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。抑郁組和對(duì)照組的性別構(gòu)成、年齡及受教育年限比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.678，P>0.05；t年齡=1.090，P>0.05；t受教育年限=1.055，P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集受試者清晨空腹外周肘靜脈血2 ml置于EDTA抗凝管中儲(chǔ)存。采集后30 min內(nèi)以12 000×g、4 ℃低溫離心10 min，棄去上清液后將血細(xì)胞移至1.5 ml EP管中并標(biāo)注序號(hào)，后用生工生物工程(上海)股份有限公司的全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，溶于TE緩沖液中，放置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 基因型檢測(cè) 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)- VNTR多態(tài)分析技術(shù)對(duì)所有DAT基因VNTR多態(tài)性進(jìn)行基因分型。上游引物為：5′-AACCAGCTCAGGCTACTGCCA

CTCAG-3′，下游引物為：5′-CTTCCTGGAGGTCACGG

TCAAGG-3′。PCR 15 μl反應(yīng)體系包括：14.3 μl 2×TaqDNA PCR混合物，0.2 μl上游引物，0.2 μl下游引物和0.3 μl 50 ng DNA。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、68 ℃復(fù)性45 s、72 ℃延伸1 min(共40個(gè)循環(huán))，最終72 ℃延伸6 min。

1.2.3 電泳檢測(cè)與基因型判讀 將PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用50 bp DNA梯度相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物作為對(duì)照，電壓150 V，30 min后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果并保存。

2 結(jié)果

2.1 DAT基因VNTR多態(tài)性分布 共檢測(cè)出520、480、440、380、360 bp 5種等位基因，分別為DAT基因的VNTR多態(tài)性11、10、9、7.5、7次重復(fù)序列。6種基因型：480 bp/480 bp、480 bp/440 bp、520 bp/480 bp、480 bp/380 bp、480 bp/360 bp、440 bp/440 bp的電泳結(jié)果見圖1。

2.2 DAT基因型分布和等位基因頻率比較 抑郁組和對(duì)照組的基因型分布和等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(抑郁組：χ2=1.380，P=0.848；對(duì)照組：χ2=0.051，P=0.99)。抑郁組與對(duì)照組基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中兩組480 bp/480 bp和480 bp/440 bp基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.375，P<0.001；χ2=4.976，P<0.05)。兩組等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

3 討論

DAT是位于中樞多巴胺能神經(jīng)元突觸前膜的一種膜蛋白，其主要功能是再攝取突觸間隙的多巴胺，從而影響突觸后膜接收到的信號(hào)傳遞。在對(duì)MN9D細(xì)胞的多巴胺代謝研究中發(fā)現(xiàn)，DAT高表達(dá)明顯促進(jìn)多巴胺的循環(huán)和利用[9]。編碼DAT的基因定位于5p15.3，3′UTR有一段長(zhǎng)度單位為40 bp的VNTR，其會(huì)引起7個(gè)等位基因從3～11串聯(lián)重復(fù)，其中最常見的是9次重復(fù)(440 bp，等位基因9)和10次重復(fù)(480 bp，等位基因10)[10]。Mill等[11]通過研究小腦、額葉和淋巴細(xì)胞的信使RNA發(fā)現(xiàn)DAT基因VNTR多態(tài)性10次重復(fù)等位基因與DAT的表達(dá)水平有關(guān)，進(jìn)而可影響DAT的表達(dá)。

Meta分析顯示，與10/10-重復(fù)等位基因型(480 bp/480 bp基因型)相比，9/10-重復(fù)等位基因型(480 bp/440 bp基因型)可增加患重度抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者病情嚴(yán)重程度的差異與基因型有關(guān)，如非典型抑郁癥與10/10基因型有關(guān)[12]。有研究還發(fā)現(xiàn)，VNTR除與抑郁癥的易患性關(guān)聯(lián)外，還與抑郁癥患者治療效果的差異有關(guān)[13]。

注：M為50 bp DNA梯度相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物，1泳道為480 bp/480 bp基因型，2泳道為480 bp/440 bp基因型，3泳道為520 bp/480 bp基因型，4泳道為480 bp/380 bp基因型，5泳道為480 bp/360 bp基因型，6泳道為440 bp/440 bp基因型

圖1 DAT基因的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

注：與抑郁組比較，aP<0.05

本研究以DAT基因啟動(dòng)子區(qū)3′末端非翻譯區(qū)VNTR變異為標(biāo)記，探討DAT基因VNTR多態(tài)性與抑郁癥發(fā)病的關(guān)系。研究所測(cè)人群中，DAT基因VNTR多態(tài)性重復(fù)次數(shù)分別為11、10、9、7.5、7次，其中10次重復(fù)最常見(即抑郁組480 bp等位基因頻率為82.3%，對(duì)照組480 bp等位基因頻率為94.5%)。與李濤等[14]研究顯示，中國(guó)人群中480 bp等位基因頻率為80%～95%，純合子480 bp/480 bp基因型分布為80%～87%，遠(yuǎn)高于歐洲人群的480 bp等位基因頻率42.5%～45.0%。抑郁組與對(duì)照組的基因型分布比較有差異，其中 480 bp/440 bp基因型在兩組間有差異，表明480 bp/440 bp基因型與其他基因型相比，可能增加抑郁癥患病風(fēng)險(xiǎn)。這與Mandelli等[15]的研究發(fā)現(xiàn)480 bp/440 bp基因型可能是抑郁癥危險(xiǎn)因素的結(jié)果相一致。480 bp/480 bp不增加抑郁癥患病風(fēng)險(xiǎn)，可能為其保護(hù)性基因型。本研究結(jié)果顯示，兩組等位基因頻率比較有差異，與Amsterdam 等[2]和Mick等[7]的研究一致，表明DAT基因VNTR多態(tài)性可能與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)。

總之，DAT基因VNTR多態(tài)性可能從轉(zhuǎn)錄水平影響了DAT基因的表達(dá)，從而影響DAT水平的變化，而DAT又通過調(diào)節(jié)多巴胺的途徑參與了抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展，480 bp/440 bp基因型個(gè)體發(fā)展為抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。但抑郁癥發(fā)生可能是多種基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，單基因研究常很難闡明基因間的相互作用、多基因?qū)Ρ硇妥兓牟煌绊懶?yīng)，有必要在今后的研究中進(jìn)行多基因位點(diǎn)的分析，并對(duì)易患基因之間復(fù)雜的相互作用、基因表達(dá)的調(diào)控做深入研究，將抑郁癥的臨床癥狀與遺傳方向的研究相結(jié)合，提高抑郁癥易患人群的篩查，從而為抑郁癥的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)防提供依據(jù)。

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(本文編輯：李婷婷)

Variable Number of Tandem Repeat Polymorphism of DAT Gene in Patients With Depressive Disorder

TANGHong-yan，GUOZong-jun,LIYu-huan,etal.

DepartmentofHealthBranch&Gerontology，theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity，Qingdao266003，China

Objective To investigate the 40 bp variable number of tandem repeat(VNTR)polymorphism within 3′ untranslated region of the dopamine transporter(DAT) gene of patients with depressive disorder. Methods The study enrolled 116 patients who received treatment in the Affiliated Hospital of Qingdao University and the Mental Health Center of Qingdao from October 2011 to March 2014 as depression group.Another 172 healthy people who received physical examination in the Affiliated Hospital of Qingdao University during the same period were enrolled as control group.Used PCR-VNTR technology to test the VNTR polymorphism of DAT gene.Results The study found five kinds of alleles,including 520，480，440，380 and 360 bp，and they were respectively 11，10，9，7.5 and 7 repetitive sequences of VNTR polymorphism of DAT gene.The 6 genotypes were 480 bp/480 bp，480 bp/440 bp，520 bp/480 bp，480 bp/380 bp，480 bp/360 bp and 440 bp/440 bp.The distribution of genotypes and the frequency of alleles of the two groups accorded with the Hardy-Weinberg law of genetic equilibrium (depression group：χ2=1.380，P=0.848；control group：χ2=0.051，P=0.990).The two groups were significantly different (P<0.05) in the distribution of genotypes;the two groups were significantly different in the distribution of 480 bp/480 bp and 480 bp/440 bp (χ2=24.375，P<0.001；χ2=4.976，P<0.05).The two groups were also significantly different (P<0.05) in the frequency of alleles.Conclusion VNTR polymorphism of DAT gene may be related with the onset of depression,which provides a reference for further clinical research.

Depressive disorder;Dopamine transporter;Tandem repeat sequences;Genes;Polymorphism,single nucleotide

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2012HM049)；山東省科技廳基金資助項(xiàng)目(22130109；2011YD18045)；青島市科技局基金資助項(xiàng)目(Kzd-03；09-1-1-33-nsh；KZJ-28)；山東省保健基金資助項(xiàng)目(2007BZ19)

266003山東省青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院保健科(唐洪燕，郭宗君，楊虎梅，徐圣芬，赤海嬌，陳娟)；青島市精神衛(wèi)生中心(李玉煥)；山東省臨沂市費(fèi)縣人民醫(yī)院(楊虎梅)；山東省臨沂市平邑縣人民醫(yī)院(徐圣芬)；陜西省西安兵器工業(yè)五二一醫(yī)院 (陳娟)

郭宗君，266003山東省青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院保健科；E-mail：guozjj@163.com

R 749.42

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.003

2015-02-21；

2015-05-13)