甲狀腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達(dá)及臨床意義

張　偉，李　娟，丁　海，張學(xué)義

(撫順礦務(wù)局總醫(yī)院 病理科，遼寧 撫順113008)

甲狀腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達(dá)及臨床意義

張偉*，李娟，丁海，張學(xué)義

(撫順礦務(wù)局總醫(yī)院 病理科，遼寧 撫順113008)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0369)

自噬是一種細(xì)胞生物學(xué)過程，細(xì)胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[1]或高爾基體[2]與溶酶體結(jié)合，降解細(xì)胞自身的陳舊蛋白及細(xì)胞器等過程，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身代謝的需要及細(xì)胞器的更新。細(xì)胞通過自噬適應(yīng)環(huán)境變化、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[3，4]，得以生存或自噬性死亡。大量的研究表明，自噬活性的改變與多種腫瘤有關(guān)。Beclin-1是一種抑癌基因，它可以調(diào)節(jié)自噬水平，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。PTEN蛋白是和張力蛋白同源在10號染色體有缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)，近年來發(fā)現(xiàn)PTEN基因的缺失和突變與許多惡性腫瘤密切相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織中Beclin-1、PTEN蛋白的表達(dá)情況，探討B(tài)eclin-1蛋白、PTEN蛋白在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相互間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料隨機(jī)選取撫順礦務(wù)局總醫(yī)院2012年至2013年，手術(shù)切除的65例甲狀腺癌組織的存檔蠟塊。其中男性18例，女性47例；年齡17-62歲，平均年齡45歲，≥45歲者20例，<42歲者45例；甲狀腺乳頭狀癌32例，濾泡癌12例，髓樣癌11例，未分化癌10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例；按2010年AJCC第七版的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ-Ⅱ期44例，Ⅲ-Ⅳ期21例。另隨機(jī)選取同期甲狀腺腺瘤腺葉切除術(shù)后瘤旁至少0.5 cm正常甲狀腺標(biāo)本25例作為對照。每例均有詳細(xì)的臨床病理資料，所有病例術(shù)前未進(jìn)行放療、化療和免疫治療。所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片。

1.2試劑與方法鼠抗人Beclin-1單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗人PTEN單克隆抗體為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。采用免疫組織化學(xué)SP法對甲狀腺癌組織中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，用已知陽性的切片做陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

1.3結(jié)果判定采用雙盲法隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。觀察陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度。對陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)計(jì)分，以百分?jǐn)?shù)<5%=0分、5%-25%=1分、26%-50%=2分、51%-75%=3分、>75%=4分。同時(shí)以染色強(qiáng)度無色=0分、淡黃色=1分、棕黃色=2分、深棕色=3分進(jìn)行評分。最后累積積分大于3分為陽性表達(dá)，否則視為陰性表達(dá)。Beclin-1蛋白陽性顆粒為棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)，PTEN蛋白陽性顆粒為棕黃色，定位于細(xì)胞核。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用卡方檢驗(yàn)(χ2)及Spearman等級相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中的表達(dá)Beclin-1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)(圖1)，在甲狀腺癌組織中的表達(dá)陽性率低于正常甲狀腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PTEN蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核(圖2)，在甲狀腺癌組織中的表達(dá)陽性率低于正常甲狀腺組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1　Beclin-1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)

圖2　PTEN蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的細(xì)胞核表達(dá)

組別例數(shù)Beclin-1蛋白陽性例數(shù)(%)χ2值P值PTEN蛋白陽性例數(shù)(%)χ2值P值正常甲狀腺組織2520(80.00)16.56<0.0522(88.00)23.76<0.05甲狀腺癌組織6521(32.30)20(30.76)

2.2Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理因素的關(guān)系Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達(dá)與甲狀腺癌患者的年齡、性別、組織學(xué)類型均無明顯相關(guān)性(P>0.05)；Beclin-1蛋白的表達(dá)與甲狀腺癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，PTEN蛋白的表達(dá)與甲狀腺癌的有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越晚，PTEN蛋白的陽性表達(dá)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理因素的關(guān)系

2.3Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性Spearman等級相關(guān)分析顯示，Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)呈輕度正相關(guān)(r=0.21，P<0.05)。見表3。

表3　Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中

3討論

近幾年來，甲狀腺癌的發(fā)病率逐年上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年已排入我國惡性腫瘤發(fā)病率的前十名。甲狀腺癌起病隱匿，預(yù)后很好，經(jīng)過規(guī)范治療，即使有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年生存率可達(dá)到97%；但是已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，則預(yù)后較差。早期診斷并規(guī)范治療才能保證甲狀腺癌的最佳預(yù)后。本研究通過Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，了解二者在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為甲狀腺癌的早期診斷、判斷預(yù)后及生物靶向治療提供參考的依據(jù)。

Beclin-1是一種與抑癌基因，與酵母菌Atg6同源，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的參與自噬過程的基因，是由Liang等[5]于1998年被發(fā)現(xiàn)并命名，1999年由Aita等[6]成功克隆，該基因位于人類染色體17q21上，有12個(gè)外顯子，11個(gè)內(nèi)含子。適度的自噬可以使細(xì)胞得以生存，過度自噬則引起細(xì)胞的自噬性死亡。Beclin-1蛋白在細(xì)胞自噬過程中起到重要作用，研究表明，Beclin-1蛋白在肺癌[7]、卵巢癌[8]、腦瘤[9]中低表達(dá)，在胃癌[10]、肝癌[11]中高表達(dá)，Beclin-1蛋白在不同的腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用。本研究結(jié)果顯示Beclin-1蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)低于正常甲狀腺組織，并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示Beclin-1蛋白與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其機(jī)制可能為：Beclin-1蛋白的表達(dá)下調(diào)，降低細(xì)胞的自噬反應(yīng)，不能夠誘導(dǎo)自噬性腫瘤細(xì)胞死亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；Beclin-1蛋白可以通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，對腫瘤起到抑制的作用；Beclin-1蛋白還可以影響VEGF和HIF-2α，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和腫瘤新血管的生成，阻止腫瘤的進(jìn)展。

PTEN是一種抑癌基因，亦稱MMAC1或TEP1。是1997年由Li等[12]克隆并命名的，是目前唯一一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移過程中起到重要作用[13]。本研究結(jié)果顯示PTEN蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)陽性率低于正常甲狀腺組織，提示其在甲狀腺癌的發(fā)生過程中起重要作用，機(jī)制可能為PTEN蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯，通過PI3K途徑和MAPK途徑來調(diào)控細(xì)胞周期[14-15]，使細(xì)胞無限增殖，形成腫瘤[16]；PTEN基因的突變可以導(dǎo)致AKT通路的激活和抑制細(xì)胞的自噬[17]，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果還顯示PTEN蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越晚PTEN蛋白的陽性表達(dá)率降低。與國內(nèi)李茂竹等[18]研究一致，提示PTEN蛋白與甲狀腺癌的發(fā)展密切相關(guān)，其機(jī)制可能為PTEN蛋白使FAK去磷酸化，阻止腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]，PTEN蛋白可以調(diào)節(jié)FAK和Shc的磷酸化，對細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用進(jìn)行調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞的粘連和轉(zhuǎn)移[20]。

Beclin-1和PTEN都是抑癌基因，都能夠在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到阻抗作用，本研究發(fā)現(xiàn)二者在甲狀腺癌中的表達(dá)成正相關(guān)，與李捷等[21]的研究一致。提示甲狀腺癌的進(jìn)展過程中存在內(nèi)在聯(lián)系，PTEN蛋白是ClassI PI3K活性的的負(fù)調(diào)控因子，可水解3，4，5一三磷酸肌醇，使有PH同源結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT(也稱PKB)被脫磷酸化而活化，降低 PKB/AKT 的磷酸化水平，解除ClassI PI3K/PKB的抑制作用，促進(jìn)自噬的發(fā)生。Beclin-1蛋白和PTEN蛋白共同參與細(xì)胞的自噬，可能分別在自噬體形成和信號調(diào)控水平來進(jìn)行調(diào)節(jié)，在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。

綜上所述Beclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，二者聯(lián)合檢測，可以作為評估甲狀腺癌預(yù)后的指標(biāo)。 深入研究二者在細(xì)胞自噬及甲狀腺癌中的作用機(jī)制，為甲狀腺癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

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摘要：目的探討B(tài)eclin-1蛋白和PTEN蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測65例甲狀腺癌及25例正常甲狀腺組織中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的表達(dá)，并對其與性別、年齡、病理學(xué)分型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果65例甲狀腺癌中Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的陽性表達(dá)率均低于二者在正常甲狀腺組織中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在甲狀腺癌中Beclin-1蛋白在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率20.5%低于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組50.0%；PTEN蛋白在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率20.5%低于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組46.2%；在TNM為Ⅲ、Ⅳ期組陽性率14.3%低于Ⅰ、Ⅱ期組的陽性率38.6%(P<0.05)。Beclin-1蛋白和PTEN蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)。結(jié)論Beclin-1蛋白和PTEN蛋白的低表達(dá)與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，二者聯(lián)合標(biāo)記可能作為評估甲狀腺癌惡性程度及預(yù)后的有效指標(biāo)，并可能為其靶向治療提供思路。

關(guān)鍵詞：甲狀腺癌；Beclin-1蛋白；PTEN蛋白； 免疫組織化學(xué)

Expression and clinical significance of Beclin-1 and PTEN proteins in thyreoid carcinomaZHANGWei，LIJuan，DINGHai，etal.(DepartmentofPathology，GeneralHospitalofFushunMiningBureau,Fushun113008，China)

Abstract:ObjectiveThe study investigated the expressions and significance of Beclin-1 and PTEN proteins in thyreoid carcinoma.MethodsThe expressions of Beclin-1 and PTEN proteins were detected in 65 cases of thyroid carcinoma and 25 cases of normal thyroid tissues by immunohistochemistry(streptavidine-peroxidase method)，and meanwhile，compared with sex，age，pathology subtypes，TNM stages and lymph node metastasis of thyroid carcinoma.ResultsThe expression rate of Beclin-1 and PTEN proteins in thyroid carcinoma was significantly lower than that in normal thyroid tissues，and the difference was statistically significant(P<0.05)；The positive expression rate of Beclin-1 protein in the patients with lymph node metastasis(20.5%)was significantly lower than those without lymph node metastasis(50.0%);The positive expression rate of PTEN protein in the patients with lymph node metastasis20.5%was significantly lower than those without lymph node metastasis46.2%;TNM stage Ⅲ、Ⅳ14.3% was significantly lower than TNM stage Ⅰ、Ⅱ38.6%(P<0.05),The expressions of Beclin-1 protein was positively correlated to that of PTEN protein in thyreoid carcinoma.ConclusionThe down-regulation of Beclin-1 and PTEN proteins may be associated with thyroid carcinoma．Joint marking these two genes may offer a effective reference for evaluation of malignant degree and prognosis of thyroid cancer and may even afford a mentality to the targeted therapy．

Key words:thyreoid carcinoma;Beclin-1 protein;PTEN protein;immunohistochemistry

收稿日期：(2014-03-09)

作者簡介：張偉(1974-)，男，遼寧錦縣人，副主任醫(yī)師，碩士學(xué)位，研究方向：腫瘤病理學(xué)研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號：R736.1

文章編號：1007-4287(2015)03-0369-04

通訊作者*