轉(zhuǎn)染VEGF基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)的影響研究

王　偉，劉德紅，李卓成，羅　蓉，許長(zhǎng)瓊，楊自華

(1.深圳市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518035；2.深圳市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518020)

轉(zhuǎn)染VEGF基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)的影響研究

王偉1，劉德紅1，李卓成1，羅蓉1，許長(zhǎng)瓊1，楊自華2*

(1.深圳市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518035；2.深圳市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518020)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0355)

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類在血管新生過程中起重要作用的前體細(xì)胞，具有干細(xì)胞的特性，可以不斷增殖，并可分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞[1]。EPCs在修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮方面具有極其廣泛的應(yīng)用價(jià)值，在心腦血管疾病[2]、缺血組織內(nèi)新生血管形成[3]等方面EPCs已展示出強(qiáng)大的應(yīng)用潛能，但來源短缺、數(shù)量稀少一直是EPCs廣泛應(yīng)用的一個(gè)限制因素。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一類具有強(qiáng)烈促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化功能的細(xì)胞因子，是EPCs增殖和定向分化不可或缺的要素之一，可以增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)血管內(nèi)皮的能力[4]。本研究通過腺病毒包裝VEGF165基因轉(zhuǎn)染入大鼠骨髓來源EPCs，觀查轉(zhuǎn)染效率及對(duì)EPCs增殖的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定研究基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Gibco公司；Ficoll密度梯度淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma公司；VEGF購自Peprotech公司；二甲基亞楓(DMSO)、四唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自北京晶美生物制品有限公司；DiI-Ac-LDL購自Molecular probes公司，F(xiàn)ITC-UEA-Ⅰ購自Sigma公司； ELISA檢測(cè)VEGF試劑盒購自上海森雄有限公司。

1.2方法

1.2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離和誘導(dǎo)大鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死后，無菌分離股骨，用消毒針頭在股骨兩端各穿小孔，用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓，篩網(wǎng)過濾去除結(jié)締組織塊，過濾液緩慢疊加至大鼠淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min離心20 min，分離出中間白色的單個(gè)核細(xì)胞層。PBS洗滌3次后細(xì)胞計(jì)數(shù)，并重懸于內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)液中(含15%胎牛血清，終濃度50 ng/ml的VEGF及100 U/ml的青霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液)。按5×105/孔的密度接種于預(yù)先鋪有纖維連接蛋白的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4天后換液棄去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)7天備用。

1.2.2內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定誘導(dǎo)后的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片24 h后，在含有DiI-Ac-LDL(2.4 μg/ml)的無血清DMEM培養(yǎng)基中于37℃孵育培養(yǎng)2 h；PBS漂洗3次，2%多聚甲醛固定10 min；PBS漂洗3次，滴加FITC-UEA-Ⅰ(10 μg/ml)并于37℃溫箱孵育2 h，最后用熒光顯微鏡觀察染色情況。

1.2.3VEGF165轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染分三組：VEGF轉(zhuǎn)染組、空載轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。其中VEGF組轉(zhuǎn)染不同滴度的攜帶有VEGF的病毒，空載轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染空病毒載體，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為不作任何轉(zhuǎn)染操作的內(nèi)皮祖細(xì)胞。VEGF165腺病毒重組質(zhì)粒(Adv-GFP-VEGF)的構(gòu)建由北京諾賽基因組研究中心完成，病毒滴度為1010/ml，稀釋成106/ml備用。胰酶消化內(nèi)皮祖細(xì)胞后計(jì)數(shù)；按照每孔105個(gè)細(xì)胞的密度種6孔板，按細(xì)胞病毒比1∶10、1∶50和1∶100加入不同滴度的重組腺病毒，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h；每孔加入3 ml內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，細(xì)胞呈綠色表示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

1.2.4采用MTT法檢測(cè)VEGF165轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖情況按照前述方法，以1∶50的比例將VEGF165質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌后重懸于內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)基；臺(tái)盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；按每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度種植96孔板，在37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液中VEGF含量減半，每3-4天更換細(xì)胞培養(yǎng)液；第2、4、6、8、10、12、14天時(shí)加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，培養(yǎng)4 h；吸棄上清液后，加100 μl DMSO孵育10 min，用分光光度計(jì)讀取570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.5采用ELISA法檢測(cè)VEGF165轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌VEGF水平VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第2、4、6、12天取上清液檢測(cè)VEGF含量，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。通過試劑盒所帶標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)上清液中的VEGF含量。

2結(jié)果

2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)觀察及鑒定

新鮮分離的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞呈圓形，形態(tài)飽滿，折光性好；培養(yǎng)2天后的內(nèi)皮祖細(xì)胞開始貼壁，形態(tài)開始變?yōu)槎趟鬆睿?天后開始增殖，體積增大。用FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL雙染色法鑒定分化中的內(nèi)皮祖細(xì)胞，結(jié)果如圖1，表明內(nèi)皮祖細(xì)胞分化良好。

2.2VEGF165轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞效率驗(yàn)證

由于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中帶有綠色熒光蛋白，因此，轉(zhuǎn)染VEGF165成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下會(huì)呈現(xiàn)綠色。圖2為不同比例的病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞的結(jié)果：細(xì)胞病毒比為1∶100的轉(zhuǎn)染會(huì)造成細(xì)胞狀態(tài)不佳，甚至死亡，而細(xì)胞病毒比為1∶10的轉(zhuǎn)染成功率略差，而細(xì)胞病毒比1：50的轉(zhuǎn)染不僅轉(zhuǎn)染效率高(幾近100%)，而且轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)好，增殖不受影響。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)皆以細(xì)胞病毒比1∶50進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.3VEGF165轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌VEGF含量測(cè)定

按照細(xì)胞病毒比1∶50將克隆有VEGF165的腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量，結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，VEGF轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞可以分泌大量VEGF，使得細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量明顯高于未轉(zhuǎn)染組和空載轉(zhuǎn)染組，在轉(zhuǎn)染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖1　內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定

圖2　VEGF165轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞效率鑒定

組別轉(zhuǎn)染天數(shù)(天)24612VEGF轉(zhuǎn)染組4.96±0.535.67±0.644.75±0.574.24±0.46空載轉(zhuǎn)染組3.23±0.34**3.16±0.31**3.05±0.28**2.78±0.32**未轉(zhuǎn)染組3.15±0.31**2.98±0.37**2.94±0.33**2.87±0.29**

注：**表示與VEGF轉(zhuǎn)染組相比，P<0.01

2.4VEGF165轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖測(cè)定

按照細(xì)胞病毒比1∶50將克隆有VEGF165的腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，空載轉(zhuǎn)染并不影響細(xì)胞的增殖情況，而轉(zhuǎn)染VEGF165后，細(xì)胞在第6天開始顯現(xiàn)更強(qiáng)的增殖能力，第10天開始增殖能力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖3)。

3討論

對(duì)受損血管結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)是治療腦血管、心血管等血管破壞性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。機(jī)體在生理?xiàng)l件下，當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)，釋放的炎癥介質(zhì)及趨化因子可以動(dòng)員骨髓EPCs、招募血液中少量EPCs聚集在受損血管周圍，在局部微環(huán)境下增殖、分化成為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)受損血管進(jìn)行修復(fù)[5]。

圖3　MTT法檢測(cè)VEGF165轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞后的細(xì)胞

EPCs存在于臍帶血、骨髓中及外周血中，外周血的EPCs含量極低，臍帶血?jiǎng)t較難獲得，因此，骨髓是研究EPCs最常用的來源。骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)，可分化為具有較強(qiáng)增殖能力的EPCs[6]。本研究通過分離大鼠脛骨骨髓中單個(gè)核細(xì)胞，用EPCs專用培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，去除不貼壁細(xì)胞，從而獲得較純EPCs。經(jīng)過FITC-UEA-I及Dil-Ac-LDL雙染色鑒定，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的能力。

VEGF在EPCs增殖及定向分化過程中扮演重要角色，人類的VEGF基因定位于6p21.3，基因產(chǎn)物為一種糖蛋白，由分子質(zhì)量為17000～22000的亞基組成同源二聚體[7]。根據(jù)分子量大小，人類的VEGF分為5種，其氨基酸數(shù)目分別為121、145、165、189及206個(gè)，其中VEGF165的生物學(xué)活性最強(qiáng)[8]。VEGF通過與EPCs上的受體特異性結(jié)合后，活化受體胞內(nèi)段偶聯(lián)的酪氨酸激酶，進(jìn)而催化下游的信號(hào)蛋白，誘導(dǎo)EPCs的增殖和向內(nèi)皮細(xì)胞分化[9]。介于VEGF強(qiáng)大的促EPCs增殖能力，我們將VEGF165轉(zhuǎn)染至EPCs，讓EPCs自分泌VEGF，以期EPCs具有更快的增殖能力和分化潛能。由于腺病毒載體內(nèi)自帶有綠色熒光蛋白基因，因此轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會(huì)顯示自發(fā)綠色熒光，便于檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞示蹤。為獲得最好的轉(zhuǎn)染效果，我們根據(jù)文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)不同梯度的細(xì)胞病毒比，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞病毒比為1∶50時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，幾乎達(dá)到100%，且細(xì)胞狀態(tài)良好。降低細(xì)胞病毒比(如1∶10)時(shí)轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨之降低，而增大細(xì)胞病毒比(如1∶100)會(huì)引起細(xì)胞的死亡，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的蛋白基因只有表達(dá)之后才能發(fā)揮其生物活性，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的VEGF含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染第二天，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF含量就明顯增加，顯示了腺病毒載體作為轉(zhuǎn)染工具的高效性[11]，且在檢測(cè)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組的VEGF含量均高于對(duì)照組。而未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組檢測(cè)到的VEGF水平，是培養(yǎng)基中添加的外源VEGF，為保持EPCs的生長(zhǎng)所必須。為檢測(cè)VEGF165轉(zhuǎn)染的EPCs自分泌的VEGF對(duì)生長(zhǎng)的影響，本研究用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示腺病毒空載轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞生長(zhǎng)速度一致，說明腺病毒載體不影響EPCs的生長(zhǎng)；而VEGF165轉(zhuǎn)染的EPCs增殖能力顯著高于對(duì)照組，說明其自身分泌的VEGF可以促進(jìn)自身的增殖。該結(jié)果與曾慶娟等[12]報(bào)道的結(jié)果一致，但與王盛等[10]報(bào)道的結(jié)果不相符，可能跟實(shí)驗(yàn)體系中培養(yǎng)EPCs所用培養(yǎng)液中VEGF含量有關(guān)，我們?cè)跈z測(cè)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中降低培養(yǎng)體系的VEGF含量，避免培養(yǎng)基中的過于足量的VEGF使得EPCs的增殖能力達(dá)到飽和，這樣便于檢測(cè)轉(zhuǎn)染VEGF165后細(xì)胞分泌的VEGF的生物學(xué)功能。

總之，本研究通過腺病毒載體重組VEGF165轉(zhuǎn)染EPCs，成功地建立了高轉(zhuǎn)染率的方法體系，轉(zhuǎn)染VEGF165基因的EPCs可以分泌高水平的VEGF，并展現(xiàn)出良好的增殖潛能，為后續(xù)EPCs的體內(nèi)試驗(yàn)研究奠定了良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lu Y,Gong Y,Lian J,et al.Expansion of Endothelial Progenitor Cells in High Density Dot Culture of Rat Bone Marrow Cells[J].PLoS One,2014,9(9):e107127.

[2]Hu CH,Li ZM,DU ZM,et al.Human umbilical cord-derived endothelial progenitor cells promote growth cytokines-mediated neorevascularization in rat myocardial infarction[J].Chin Med J (Engl),2009,122(5):548.

[3]Sambataro M,Seganfreddo E,Canal F,et al.Prognostic significance of circulating and endothelial progenitor cell markers in type 2 diabetic foot[J].Int J Vasc Med,2014,2014:589412.

[4]Cheng Y,Jiang S,Hu R,et al.Potential mechanism for endothelial progenitor cell therapy in acute myocardial infarction:Activation of VEGF- PI3K/Akte-NOS pathway[J].Ann Clin Lab Sci,2013,43(4):395.

[5]Lee PS,Poh KK.Endothelial progenitor cells in cardiovascular diseases[J].World J Stem Cells,2014,6(3):355.

[6]Shimada T,Takeshita Y,Murohara T,et al.Angiogenesis and vasculogenesis are impaired in the precocious-aging klotho mouse[J].Circulation,2004,110(9):1148.

[7]Vincenti V1,Cassano C,Rocchi M,et al.Assignment of the vascular endothelial growth factor gene to human chromosome 6p21.3[J].Circulation,1996,93(8):1493.

[8]Cai C,B?ttcher MC,Werner JA,et al.Differential expression of VEGF121,VEGF165 and VEGF189 in angiomas and squamous cell carcinoma cell lines of the head and neck[J].Anticancer Res,2010,30(3):805.

[9]Everaert BR,Van Craenenbroeck EM,Hoymans VY,et al.Current perspective of pathophysiological and interventional effects on endothelial progenitor cell biology:focus on PI3K/AKT/eNOS pathway[J].Int J Cardiol,2010,144(3):350.

[10]王盛,陳忠,唐小斌,等.VEGF基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國普通外科雜志,2008,17(8):789.

[11]Day TP,Byrne LC,Schaffer DV,et al.Advances in AAV vector development for gene therapy in the retina[J].Adv Exp Med Biol,2014,801:687.

[12]曾慶娟,尤捷,許崇永,等.人VEGF165基因轉(zhuǎn)染兔骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞及對(duì)其增殖的影響[J].浙江醫(yī)學(xué),2009,31(7):927.

112197)

摘要：目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因轉(zhuǎn)染大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法，分析轉(zhuǎn)染VEGF基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法分離大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化，采取FITC-UEA-I 和Dil-Ac-LDL雙染色法驗(yàn)證；采用腺病毒包裝VEGF165基因，按照不同比例轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞后，通過熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒自帶綠色熒光蛋白驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率；以未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體為對(duì)照；采用MTT法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染VEGF165基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響；采用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF含量。結(jié)果分離誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞分化良好，F(xiàn)ITC-UEA-I及Dil-Ac-LDL均呈陽性；按照細(xì)胞病毒比1：50轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高，且細(xì)胞狀態(tài)不受影響；轉(zhuǎn)染VEGF165基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞能分泌大量的VEGF，提高培養(yǎng)上清液中的總VEGF水平，其增殖能力也明顯強(qiáng)于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。結(jié)論通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染VEGF165基因可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌VEGF，提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力。

關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；腺病毒；轉(zhuǎn)染；內(nèi)皮祖細(xì)胞

Experimental study of rat endothelial progenitor cells transfected with VEGF 165 geneWANGWei,LIUDe-hong,LIZhuo-cheng,etal.(ClinicalLaboratoryoftheSecondPeople'sHospitalofShenzhencity,Shenzhen518035,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the methodology of transfecting vascular endothelial growth factor (VEGF) gene to endothelial progenitor cells and detect the effect of VEGF transfection to endothelial progenitor cells.MethodsMononuclear cells from rat bone marrow were separated and induced for differentiation,and double staining of FITC-UEA-I and Dil-Ac-LDL was used to characterize the induced endothelial progenitor cells.VEGF165 gene was incorporated into adenovirus and transfected into endothelial progenitor cells according to different cell virus ratio,the green fluorescence protein was used as readout to detect the efficiency of transfection.Theproliferation of VEGF transfected endothelial progenitor cells was detected by MTT colorimetric assay,and the VEGF in the supernatant of culturing cells was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe endothelial progenitor cells were well induced and differentiated,both positive for FITC-UEA-I and Dil-Ac-LDL staining.Transfection using 1:50 as cell virus ratio showed the fittest efficiency and survival rate.Transfected endothelial progenitor cells secreted VEGF and up-regulated the level of VEGF in the supernatant,and the cells transfected with VEGF showed superior capacity of proliferation than vector transfected cells or non-transfected cells.ConclusionVEGF165 gene transfected endothelial progenitor cells could self-secrete VEGF and thus showed superior capacity of proliferation.

Key words:vascular endothelial growth factor; adenovirus; transfection; endothelial progenitor cell

收稿日期：(2014-03-23)

作者簡(jiǎn)介：王偉(1974-)，男，碩士研究生，副主任技師，主要從事主要從事心血管疾病炎性機(jī)制的研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：Q78

文章編號(hào)：1007-4287(2015)03-0355-04

通訊作者*

基金項(xiàng)目：深圳市科委知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20130401104