豚鼠鼓膜超諧振動的初步觀察△

李潔瑩 李佳 楊琳 陳力奮 呂慧英 陳克光 戴培東 張?zhí)煊?/p>

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·基礎研究·

豚鼠鼓膜超諧振動的初步觀察△

李潔瑩 李佳＊楊琳＊＊陳力奮＊呂慧英 陳克光 戴培東＊＊張?zhí)煊?/p>

目的 通過激光多普勒測振法觀察活體與死亡后豚鼠鼓膜超諧振動的差異，以闡明鼓膜振動失真對傳音的影響。方法 麻醉豚鼠后，分別給予85 dB SPL聲強，0.5、1、2、4、6、8 kHz頻率純音刺激，采用緊湊式單點激光多普勒測振儀測量活體及死亡3 h后豚鼠鼓膜臍部振幅。結果 在各種刺激頻率下，豚鼠鼓膜臍部均記錄到不同幅值的響應。死亡3 h后，在0.5 kHz和1 kHz聲刺激下，觀察到超諧振動響應；但是在活體豚鼠中未觀察到此現(xiàn)象。活體與死亡3 h后豚鼠鼓膜超諧振動的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。結論 豚鼠鼓膜的超諧振動是一種振動失真，活體狀態(tài)下，可能存在中耳的某種生理功能抑制了這種振動失真，這樣更有利于聲音的清晰傳遞。 (中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：181-184)

激光多普勒測振；鼓膜臍；超諧振動；中耳

外界傳來的聲音在耳道產(chǎn)生的聲壓可通過鼓膜振動傳遞至聽骨鏈。鼓膜臍部緊貼錘骨，因此臍部振動可直接反映錘骨的運動。中耳除了將外耳道中的聲波能量傳遞至內(nèi)耳以外，還起到阻抗匹配作用。在保持鼓室完整的條件下，對鼓膜臍部振動的頻響特性進行定性及定量分析，可了解生理條件下中耳的傳音特性。普遍認為,在聽覺頻率范圍內(nèi)，聲壓低于130 dB SPL，中耳是一個線性傳音系統(tǒng)，這是由于在上述聲刺激下，鼓室肌未收縮[1]。但是有文獻[2]報道，在靜態(tài)壓力負載下，人顳骨標本的鼓膜形變表現(xiàn)出強烈的非線性。此外，Aerts等[3]測量死亡43 min后沙鼠聽泡的鼓膜振動，給予頻率為0.125～16 kHz、聲壓為96 dB SPL的聲刺激，可觀察到鼓膜振動的非線性畸變。因此，鼓膜振動響應是具有非線性特性的，只有采用高分辨率的測振設備才能觀察到此種特性。緊湊式單點激光多普勒測振儀(laser Doppler vibrometer, LDV)是空間分辨率很高、非接觸式的實時測量技術，可用于測量活體豚鼠鼓膜臍部振動[4]。LDV和顯微鏡耦合，可在顯微鏡視野中調(diào)節(jié)激光光斑位置，準確定位于鼓膜臍部。因此，我們使用LDV，比較活體和死亡豚鼠鼓膜臍部振幅，反映在活體和死亡狀態(tài)下中耳傳音特性。從生物力學觀點來看，中耳的非線性來源于兩方面：一方面是被動的，即鼓膜、聽骨、肌腱、鼓室肌的生物材料特性；另一方面是主動的，即鼓膜張肌、鐙骨肌的反射性收縮[5-6]。非線性系統(tǒng)的典型特征之一是超諧振動，即指激勵作用于非線性系統(tǒng)所激發(fā)的頻率除了有與其相同頻率的成分外，還有與激勵頻率成整數(shù)倍的大幅度振動響應，即超諧振動。具有非線性特征的中耳有可能出現(xiàn)超諧振動的現(xiàn)象，但相關實驗研究鮮有報道。超諧振動可以使中耳接收傳入聲音特征頻率以外的音頻成分，導致傳入聲音失真。但正?；铙w狀態(tài)并不會發(fā)生明顯的失真。聽覺系統(tǒng)具有高度的頻率選擇性、靈敏性，這在有關耳蝸的非線性特性研究中已有很多報道[7]。那么，同樣具有非線性特征的中耳是否通過某種機制參與了對鼓膜振動的初步調(diào)諧過程？本研究通過對比活體和死亡豚鼠的鼓膜頻響特性，以闡明鼓膜的超諧振動對傳音的可能影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 豚鼠是一種廣泛應用于耳科學研究的實驗動物，通常用于建立中、內(nèi)耳各種病理模型[4]。本實驗采用健康清潔級雄性純色豚鼠6只(6耳)，體重為280～490 g，給予氯胺酮(50 mg/kg)和甲苯噻嗪(12.5 mg/kg)肌內(nèi)注射麻醉豚鼠。實驗前首先對豚鼠右耳進行耳鏡檢查，麻醉豚鼠后，測試右耳0.5、1、2、4、6、8 kHz的純音聽性腦干反應(auditory brainstem response,ABR)閾值，以排除聽覺系統(tǒng)疾病。對豚鼠的處理符合實驗動物倫理。

1.2 測振系統(tǒng) 本實驗在復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院(衛(wèi)生部)聽覺醫(yī)學重點實驗室完成。測振系統(tǒng)包括緊湊式單點LDV(CLV-2534-4，Polytec公司，德國)，顯微鏡(OPMI 1-FC，Carl Zeiss公司，德國)，信號發(fā)生器(33220A，Agilent公司，美國)及功率放大器(RMX 850，QSC公司，美國)。激勵頻率強度均用聲級計(AWA-5661-1B，杭州愛華儀器有限公司)將聲壓級校準到85 dB SPL。給聲通過聲激勵適配器(ER-2，ER-7C，HLV-SPEC Adapter，Etymotic 公司，美國)插入骨性外耳道并監(jiān)測聲壓。測振記錄軟件采用Vibsoft-20(Polytec公司，德國)。LDV測量系統(tǒng)示意圖見圖1。

圖1. LDV測量系統(tǒng)示意圖 激光束基本與鼓膜臍部垂直

1.3 測量方法 測得豚鼠ABR閾值在正常范圍后，取右側(cè)臥位，手術切除右耳耳廓及軟骨外耳道，暴露骨性外耳道及鼓膜。將反光粉小心放置于鼓膜臍部(圖2)，手術臺轉(zhuǎn)入隔音室內(nèi)固定于隔振臺上，使耳道適配器尖端距鼓膜臍部約2 mm。調(diào)節(jié)激光斑點大小及方向，使其聚焦于反光粉位置，且光束與鼓膜垂直，偏差<30°。關閉隔音室后，給予激勵聲強85 dB SPL,頻率分別為 0.5、1、2、4、6、8 kHz的6個純音頻率的正弦信號，采集各個頻率鼓膜臍部的振動速度響應幅值。保持豚鼠體位及與激光的相對位置，分別測量6只豚鼠右耳活體及死亡3 h后鼓膜臍部振幅。活體測量結束后立即腹腔注射致死劑量氯胺酮，在室溫下保持3 h后，重復上述測量。

1.4 統(tǒng)計學處理 本研究使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。由于樣本量較少，采用Fisher確切概率法比較活體和死亡3 h后豚鼠鼓膜臍部出現(xiàn)超諧振動的比例有無差異，以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

圖2. A. 正常豚鼠鼓膜；B. LDV攝像記錄豚鼠鼓膜臍部放置反光粉

2 結果

2.1 鼓膜臍部振動峰值響應 經(jīng)耳道給予聲強為85 dB SPL、頻率分別為0.5、1、2、4、6、8 kHz的聲刺激，在各刺激頻率下，6只豚鼠鼓膜臍部均記錄到峰值響應。圖3顯示了活體和死亡3 h后測量的鼓膜臍部峰值響應的平均幅值。活體狀態(tài)下，鼓膜臍部頻率響應曲線在4、6 kHz頻率處響應幅值較大。死亡3 h后鼓膜臍部頻率響應曲線在0.5、1、4 kHz頻率處響應幅值較大。

2.2 鼓膜臍部振動的諧波分析 用Vibsoft-20軟件將記錄的鼓膜臍部振動響應進行傅里葉變換，分析響應的頻率成分。結果顯示，活體狀態(tài)下，6只豚鼠的鼓膜臍部只出現(xiàn)激勵頻率的振動響應。死亡3 h后，給予1號豚鼠0.5 kHz聲刺激時，鼓膜臍部除了出現(xiàn)0.5 kHz的振動響應外，還出現(xiàn)了其2倍頻、3倍頻和4倍頻的超諧振動，即在1、1.5、2 kHz處有明顯的響應幅值出現(xiàn)(圖4)。同樣，死亡3 h后，2號豚鼠在0.5 kHz聲刺激下，出現(xiàn)2倍頻的超諧振動，在1 kHz聲刺激下，出現(xiàn)3倍頻的超諧振動；3號豚鼠在0.5 kHz聲刺激下，出現(xiàn)2倍頻和4倍頻的超諧振動，在1 kHz聲刺激下，出現(xiàn)2倍頻的超諧振動；4號豚鼠在0.5 kHz聲刺激下，出現(xiàn)2倍頻和4倍頻的超諧振動；5號和6號豚鼠在0.5 kHz聲刺激下，出現(xiàn)2倍頻、3倍頻和4倍頻的超諧振動(表1)?；铙w和死亡3h后豚鼠鼓膜臍部在聲刺激下出現(xiàn)超諧振動的比例差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。

圖3. 6只豚鼠活體及死亡3 h后鼓膜臍部振動速度的平均值 灰色虛線表示在豚鼠活體狀態(tài)的測量結果，黑色實線表示豚鼠死亡3 h后的測量結果

圖4. 1號豚鼠在0.5 kHz聲刺激下鼓膜響應的諧波分析 左圖和右圖分別為活體和死亡3 h后1號豚鼠在0.5 kHz聲刺激下的鼓膜臍部響應；f為峰值響應頻率，2 f，3 f，4 f分別為2倍頻、3倍頻和4倍頻的超諧振動頻率

表1 在0.5 kHz和1 kHz聲刺激下死亡

注：“+”表示觀察到相應倍頻的超諧振動響應，“-”表示未觀察到相應倍頻的超諧振動響應

3 討論

緊湊式單點LDV的原理是通過測量從待測區(qū)域反射回的相干激光光波的多普勒頻率，借助光學差拍及參考光技術，處理和分析物體表面與參考面在變形前后的位相變化、光強變化等，從而獲得高精度的實時振幅測量數(shù)據(jù)，其測量的振幅精度達1 pm。由于LDV不直接接觸被測目標，且反光微珠直徑僅20～50 μm，因此對鼓膜臍部振動無明顯影響，所以在測量鼓膜振動時幾乎無機械負荷的干擾，已成為中、內(nèi)耳傳音測量的常規(guī)方法之一。

鼓膜因其超彈特性，在4個象限的頻率響應會出現(xiàn)幅值及相位差異，因此通常選擇剛性較大的鼓膜臍部或者錘骨尖和鼓環(huán)的中點作為一個參考點進行測量[4,8]。本實驗采用記錄鼓膜臍部的振幅，所觀察到的死亡后豚鼠鼓膜頻率響應趨勢與文獻[8-9]報道基本一致。人鼓膜的共振頻率為0.9～1.4 kHz和3～4 kHz[5]，本實驗結果中1 kHz與4 kHz純音刺激下鼓膜臍部振動的幅值較大，可能是由于豚鼠鼓膜的共振頻率在1 kHz和4 kHz附近。由于本實驗動物數(shù)量較少，有待進一步增加樣本量，更準確地測量豚鼠鼓膜的頻響曲線。

文獻報道的測量方法多在聽泡壁上打孔，開放了鼓室，增加了低頻聲刺激下(<900 Hz)鼓膜振幅[10]，而本實驗方法保持鼓室完整，從外耳道測量鼓膜臍部振幅，測得的結果更接近生理狀態(tài)的振幅。

本實驗首次觀察到死亡后鼓膜的不同倍頻響應，即超諧振動。文獻報道死亡后中耳的共振頻率會發(fā)生變化，約3 h后，其共振頻率趨于穩(wěn)定。所以本實驗在動物死亡3 h后進行重復測量，與活體測量結果相比，死亡3 h后的鼓膜臍部在0.5 kHz與1 kHz聲刺激下，觀察到明顯的超諧振動，說明鼓膜的振動出現(xiàn)失真。在活體條件下，鼓膜的超諧振動有可能受到抑制，這種抑制可能是由于中耳生理功能通過某種主動機制實現(xiàn)的，這樣使傳入音更清晰。

耳蝸主動機制的非線性特性已被公認，其耳聲的逆向傳出可在鼓膜處記錄到非線性響應產(chǎn)物，如耳聲發(fā)射[11]。但耳蝸開窗，破壞耳蝸后，所測得鼓膜臍部振幅與實驗動物死亡后測得的數(shù)據(jù)進行對比無明顯差異，說明死亡與耳蝸開窗后耳蝸的主動作用均消失[3]。因此，可認為本研究中豚鼠死亡后所測得的鼓膜超諧振動響應，是來自于中耳的被動機械系統(tǒng)，無耳蝸主動機制參與?；铙w時無明顯超諧振動，有可能是中、內(nèi)耳的主動機制對其的抑制作用。但因本研究實驗動物數(shù)量較少，還需要增加樣本量及對比實驗，進一步驗證并闡明中耳在傳音過程中的主動機制對鼓膜振動失真的可能影響。

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(本文編輯 楊美琴)

Preliminary observation of the superharmonic vibration of tympanic membrane in guinea pigs

LI Jie-ying, LI Jia＊, YANG Lin＊＊, CHEN Li-fen＊, Lü Hui-ying, CHEN Ke-guang, DAI Pei-dong＊＊, ZHANG Tian-yu

Department of Otorhinolaryngology, Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University, Shanghai 200031, China

ZHANG Tian-yu, Email: ty.zhang2006@aliyun.com

Objective To illustrate the effect of tympanic membrane vibration distortion on sound transmission by comparing tympanic membrane vibration of living and post-mortem guinea pigs using a laser Doppler vibrometer(LDV). Methods The velocity of the umbo of tympanic membrane was measured with 85 dB SPL pure tones at the frequencies of 0.5,1,2,4,6,8 kHz presented in the ear canal in living and 3 hours post-mortem guinea pigs. Results There were peak responses of the umbo with the stimulus through the whole frequency range. In 3 hours post-mortem guinea pigs, superharmonic vibrations were observed with 0.5 kHz and 1 kHz stimulus，but this phenomenon was not observed in living ones. Regarding the superharmonic vibration of tympanic membrane,there were significant differences(P=0.002) between living and 3 hours post-mortem guinea pigs.Conclusions The superharmonic vibration which only existed in post-mortem guinea pigs is a kind of distortion. In living animals, that distortion may be inhibited by middle ear through some mechanism. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:181-184)

Laser Doppler vibrometer; Umbo; Superharmonic vibration; Middle ear

上海市科學技術委員會科研計劃項目(13DZ1940902；13DZ1940903)；上海市衛(wèi)生局科研課題計劃(XBR2011068)

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科＊＊實驗中心 衛(wèi)生部聽覺醫(yī)學重點實驗室 上海 200031；＊復旦大學力學系 上海 200433

張?zhí)煊?Email:ty.zhang2006@aliyun.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.03.008

2014-12-11)