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    Faecalibacterium prausnitzii基因組DNA上調(diào)外周血單個核細胞Th1型免疫應(yīng)答增強對人結(jié)腸癌LoVo細胞的殺傷活性

    2015-02-23 03:06:34張濤,張敏,湯愛榮
    胃腸病學(xué) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)丁酸結(jié)腸癌

    Faecalibacteriumprausnitzii基因組DNA上調(diào)外周血單個核細胞Th1型免疫應(yīng)答增強對人結(jié)腸癌LoVo細胞的殺傷活性

    張濤1#張敏1湯愛榮1曹萍2謝麗娟1于成功1,3&

    南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008)

    南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科2南京鼓樓醫(yī)院集團儀征醫(yī)院消化科3

    *基金項目:國家自然科學(xué)基金(81470819)

    #Email: zhangtao203@126.com

    背景:Faecalibacteriumprausnitzii(Fp)是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的腸道共生菌,研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者腸道內(nèi)Fp數(shù)量明顯減少,可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。目的:探討Fp及其基因組DNA(fDNA)干預(yù)對外周血單個核細胞(PBMCs)對人結(jié)腸癌LoVo細胞殺傷活性的影響及其免疫學(xué)機制。方法:將Fp、fDNA或酶解fDNA(d-fDNA)與分離自健康成人的PBMCs體外共培養(yǎng),MTT實驗檢測PBMCs對LoVo細胞的殺傷活性,ELISA法檢測PBMCs培養(yǎng)上清液中的Th1、Th2型細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)含量,real-time PCR檢測PBMCs Th1、Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3表達。結(jié)果:與未予干預(yù)的PBMCs相比,fDNA干預(yù)能顯著增強PBMCs對LoVo細胞的殺傷活性(P<0.05),同時促進PBMCs的IFN-γ分泌和T-bet mRNA表達(P<0.05),抑制IL-4分泌和GATA3 mRNA表達(P<0.05)。Fp和d-fDNA均未顯示出上述作用。結(jié)論:fDNA能增強PBMCs對人結(jié)腸癌細胞的殺傷活性,其機制可能與上調(diào)Th1型免疫應(yīng)答有關(guān)。

    關(guān)鍵詞Faecalibacterium prausnitzii;干擾素γ;白細胞介素4;Th1-Th2平衡;結(jié)腸腫瘤;LoVo細胞

    Colonic Neoplasms;LoVo Cells

    結(jié)直腸癌為常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率在我國呈上升趨勢。結(jié)直腸癌的病因尚未明確,近年來,腸道細菌與結(jié)直腸癌發(fā)病的關(guān)系日益受到關(guān)注,部分學(xué)者認為腸道細菌及其代謝產(chǎn)物通過多種機制參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[1]。

    在機體免疫系統(tǒng)中,干擾素-γ(IFN-γ)主要由Th1細胞分泌,主要介導(dǎo)細胞免疫;而白細胞介素-4(IL-4)主要由Th2細胞分泌,主要介導(dǎo)體液免疫。有研究[2]表明,結(jié)直腸癌患者以Th2型免疫應(yīng)答占優(yōu)勢,Th1細胞功能減弱,提示Th1/Th2失衡可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展。

    對結(jié)直腸癌患者腸道菌群的定量分析顯示,患者腸道內(nèi)產(chǎn)丁酸細菌Faecalibacteriumprausnitzii(F.prausnitzii, Fp)和直腸真桿菌(Eubacteriumrectale)數(shù)量明顯減少,可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)[3]。體內(nèi)外研究[4-5]顯示,F(xiàn)p及其培養(yǎng)上清液具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。本研究以Fp及其基因組DNA(fDNA)干預(yù)人外周血單個核細胞(PBMCs),觀察其對PBMCs對人結(jié)腸癌LoVo細胞殺傷活性的影響以及PBMCs IFN-γ、IL-4分泌和Th1、Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3的表達變化,旨在為Fp用于結(jié)直腸癌的治療提供實驗依據(jù)。

    材料與方法

    一、標本來源

    隨機收集2014年6月-2014年10月南京市鼓樓醫(yī)院體檢中心健康體檢者20名,其中男10名,女10名,年齡21~53歲,平均(32.3±12.0)歲。入選者遵循自愿原則完成實驗。

    二、菌株、細胞株和主要試劑

    Fp菌種(ATCC 27766,美國模式菌種保藏中心),人結(jié)腸癌LoVo細胞(南京市鼓樓醫(yī)院消化科實驗室保存),細菌基因組DNA提取試劑盒、DNAse Ⅰ、引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司),淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司),MTT、DMSO、植物血凝素(PHA)[生工生物工程(上海)股份有限公司],人IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒(Abcam plc.),RNAiso Plus總RNA提取試劑、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TAKARA BIO INC.)。

    三、方法

    1. Fp培養(yǎng):參照文獻方法配制培養(yǎng)基[5],將Fp置于厭氧箱(37 ℃, 97% CO2, 2% H2)內(nèi)培養(yǎng),根據(jù)600 nm處吸光度值(A值)結(jié)合平板菌落計數(shù)計算細菌濃度。取對數(shù)生長末期菌液離心,收集細菌,以PBS重懸并調(diào)整濃度至1×109CFU/mL,-20 ℃冰箱保存。

    2. fDNA和酶解fDNA(d-fDNA)的制備:以細菌基因組DNA提取試劑盒提取fDNA,經(jīng)紫外分光光度計測定A260/A280為1.8~1.9。DNAseⅠ 37 ℃水浴4 h以完全酶解細菌DNA,作為fDNA的對照。收集fDNA和d-fDNA,-20 ℃冰箱保存。

    3. PBMCs的分離和培養(yǎng):抽取20名健康成人外周血,F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離 PBMCs,以RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)重懸并調(diào)整濃度至1×106/mL。

    4. MTT實驗檢測PBMCs殺傷活性:以PBMCs為效應(yīng)細胞,以LoVo細胞為靶細胞。將源自10名健康成人的PBMCs以1×105/孔(0.1 mL)接種于24孔板,分別加入40 μL Fp(1×109CFU/mL)、fDNA(25 μg/mL)或d-fDNA(25 μg/mL)并補足完全培養(yǎng)基至1 mL,共培養(yǎng)24 h,以未予干預(yù)的PBMCs作為對照,離心,棄上清,以完全培養(yǎng)基懸浮細胞沉淀。每組1×105個效應(yīng)細胞與2×103個靶細胞共培養(yǎng)于96孔板(效靶比50∶1),另設(shè)單獨培養(yǎng)的PBMCs和LoVo細胞作為效應(yīng)細胞對照組和靶細胞對照組,每組設(shè)3個復(fù)孔。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h,棄上清,PBS重懸2次,加入MTT孵育4 h,棄上清,加入DMSO,以酶標儀測定490 nm處A值。效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷率={1-[(實驗組A值-效應(yīng)細胞對照組A值)/靶細胞對照組A值]}×100%。

    5. ELISA法檢測PBMCs培養(yǎng)上清液IFN-γ、IL-4含量:將源自另10名健康成人的PBMCs以1×106/孔(1 mL)接種于24孔板,加入IFN誘生劑PHA(100 μg/mL)培養(yǎng)24 h,分別加入40 μL Fp(1×109CFU/mL)、fDNA(25 μg/mL)或d-fDNA(25 μg/mL),另設(shè)只加PHA的對照組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,離心,收集上清,-20 ℃冰箱保存。按相應(yīng)ELISA試劑盒說明書操作,檢測IFN-γ、IL-4含量。

    6. Real-time PCR檢測PBMCs T-bet、GATA3 mRNA表達:實驗步驟5培養(yǎng)的各組細胞離心后收集細胞沉淀,以RNAiso Plus試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,行real-time PCR擴增目的片段。引物序列:T-bet F 5’-TGA CAT GAT GAA AGG AAC AGA AAC A-3’, R 5’-CCC CAA CCA ACT ACT AAA CAG AGA A-3’; GATA3 F 5’-CCT CCT CTC TGC TCT TGG CTA C-3’, R 5’-AGA ATA AAA CGG GAC CAG GTT GTA A-3’; 內(nèi)參β-actin F 5’-GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG AC-3’, R 5’-CTC GGC CAC ATT GTG AAC TTT G-3’。PCR反應(yīng)體系:SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL,上、下游引物各0.4 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL,cDNA 2 μL,去離子水6.8 μL,共20 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃ 30 s,1個循環(huán);95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

    四、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié)果

    一、PBMCs對LoVo細胞的殺傷活性

    經(jīng)Fp、fDNA或d-fDNA干預(yù)24 h的PBMCs,以效靶比50∶1與LoVo細胞共培養(yǎng)72 h后,fDNA組PBMCs對LoVo細胞的殺傷率為(49.43±6.77)%,顯著高于未予干預(yù)PBMCs組的(26.50±6.72)%(P<0.05);Fp組和d-fDNA組PBMCs殺傷率分別為(35.73±1.97)%和(28.80±5.45)%,均低于fDNA組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),兩組殺傷活性與未予干預(yù)PBMCs組相比均無明顯差異(P>0.05)(圖1)。

    *兩組間比較,P<0.05

    圖1Fp、fDNA和d-fDNA干預(yù)對PBMCs對LoVo細胞殺傷活性的影響

    二、PBMCs IFN-γ、IL-4分泌

    經(jīng)PHA刺激以及Fp、fDNA或d-fDNA干預(yù) 24 h 的PBMCs,fDNA組IFN-γ分泌量為(529.4±36.3) pg/mL,顯著高于Fp組[(288.6±31.0) pg/mL]、d-fDNA 組[(220.3±20.7) pg/mL]和對照組[(203.2±23.6) pg/mL](P<0.001);fDNA組IL-4分泌量為(14.35±2.10) pg/mL,顯著低于d-fDNA組[(29.57±4.92) pg/mL]和對照組[(30.91±3.35) pg/mL](P<0.05),與Fp組[(20.23±3.76) pg/mL]相比無明顯差異(P>0.05)。Fp組、d-fDNA組IFN-γ、IL-4分泌量與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

    三、PBMCs T-bet、GATA3 mRNA表達

    經(jīng)PHA刺激以及Fp、fDNA或d-fDNA干預(yù) 24 h 的PBMCs,fDNA組T-bet mRNA相對表達量為1.699±0.082,顯著高于d-fDNA組(1.066±0.201)和對照組(P<0.05),與Fp組(1.144±0.204)相比無明顯差異(P>0.05);fDNA組GATA3 mRNA相對表達量為(0.511±0.077),顯著低于d-fDNA組(1.066±0.101)和對照組(P<0.05),與Fp組(0.799±0.143)相比無明顯差異(P>0.05)。Fp組、d-fDNA組T-bet、GATA3 mRNA相對表達量與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

    討論

    Fp是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的腸道共生菌,占健康成人腸道菌群總量的5%以上, 是腸道內(nèi)代謝最為活躍的細菌之一,對維持腸道健康具有重要作用[6]。研究[3,7]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者腸腔內(nèi)和附著于腸黏膜的Fp數(shù)量較健康成人明顯減少,且癌組織Fp數(shù)量少于正常黏膜組織,提示Fp減少可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。

    兩組間比較,*P<0.05,***P<0.001

    兩組間比較,*P<0.05,**P<0.01

    Fp能分解糖類產(chǎn)生丁酸,是腸道內(nèi)主要的產(chǎn)丁酸細菌之一。體外實驗發(fā)現(xiàn)丁酸具有抑制人結(jié)腸癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡的作用[8],據(jù)此推測,F(xiàn)p可能通過產(chǎn)丁酸發(fā)揮抗癌作用。本課題組前期研究結(jié)果表明,F(xiàn)p與人結(jié)腸癌細胞共培養(yǎng)能直接抑制癌細胞增殖并促進細胞凋亡,本實驗將Fp與PBMCs共培養(yǎng),卻發(fā)現(xiàn)其并不能提高PBMCs對腫瘤細胞的殺傷活性,其原因可能為Fp具有促進初始T細胞向調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)分化的作用[5],而Treg細胞是機體抗腫瘤免疫的負性調(diào)節(jié)因子,可促進腫瘤免疫逃逸。此外,閔軍等[9]的研究發(fā)現(xiàn)丁酸誘導(dǎo)的未成熟樹突細胞可通過高表達吲哚胺2,3雙加氧酶、低表達IL-12等抑制T細胞增殖,誘導(dǎo)機體免疫耐受。上述結(jié)果表明,F(xiàn)p雖然具有直接抗腫瘤作用,但在抗腫瘤免疫中可能起負性調(diào)節(jié)作用。

    一些細菌基因組DNA存在非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)(CpG序列),文獻報道CpG序列可通過調(diào)節(jié)機體免疫,如增強巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用、增加抗腫瘤細胞因子分泌等途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),一些人工合成的CpG寡脫氧核苷酸(ODN)已被作為有效佐劑用于免疫調(diào)節(jié)和腫瘤的免疫治療[10-11]。CpG序列根據(jù)結(jié)構(gòu)差異可分為CpG-A、CpG-B和CpG-C,三者可能通過不同路徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[10]。Fp的基因組DNA同樣存在非甲基化CpG序列,但其結(jié)構(gòu)不明。目前研究顯示,免疫細胞表面的模式識別受體Toll樣受體9(TLR9)可特異性識別并結(jié)合細菌非甲基化CpG序列和人工合成的CpG序列,TLR9活化后可激活多種免疫細胞,導(dǎo)致有效的Th1型免疫應(yīng)答和抗腫瘤效應(yīng)[11]。本實驗表明fDNA與PBMCs共培養(yǎng)能增強其對人結(jié)腸癌LoVo細胞的殺傷活性,從而抑制腫瘤細胞增殖,結(jié)合上述研究結(jié)果,推測fDNA可能是通過激活TLR9,調(diào)節(jié)PBMCs向Th1亞群分化而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

    在腫瘤免疫應(yīng)答中,活化的初始CD4+T細胞分化為不同T細胞亞群,發(fā)揮不同免疫調(diào)節(jié)作用:Th1型免疫應(yīng)答分泌IL-2或IFN-γ等細胞因子,促進抗腫瘤免疫應(yīng)答,Th2型免疫應(yīng)答則通過分泌IL-4、IL-13等,促進腫瘤生長[12],Th1、Th2型細胞因子表達間接反映了相應(yīng)T細胞亞群的功能,IFN-γ和IL-4分別為典型的Th1和Th2型細胞因子[13]。T-bet為Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子,通過作用于IFN-γ等基因位點,促進相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄,正向調(diào)控T細胞向Th1方向分化,而GATA3通過作用于IL-4等Th2型細胞因子基因位點,正向調(diào)控T細胞向Th2方向分化,為Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子[14]。有研究[2,15]表明結(jié)直腸癌患者存在Th1/Th2失衡,主要表現(xiàn)為Th2型免疫應(yīng)答上調(diào),Th1型免疫應(yīng)答下調(diào),Th1/Th2失衡與結(jié)直腸癌的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān),糾正Th1/Th2失衡可能為結(jié)直腸癌的治療提供了一個新途徑。本研究將Fp、fDNA和d-fDNA與源自健康成人的PBMCs共培養(yǎng),觀察了此種干預(yù)對PBMCs殺傷活性及其Th1/Th2分化、應(yīng)答的影響,發(fā)現(xiàn)fDNA能顯著增強PBMCs對LoVo細胞的殺傷活性,同時促進IFN-γ分泌和T-bet mRNA表達,抑制IL-4分泌和GATA3 mRNA表達,F(xiàn)p和d-fDNA的作用則不明顯,表明Fp可通過其基因組DNA影響PBMCs的分化方向、糾正Th1/Th2失衡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

    綜上所述,本實驗發(fā)現(xiàn)fDNA能增強PBMCs對人結(jié)腸癌細胞的殺傷活性,其機制可能與上調(diào)Th1型免疫應(yīng)答有關(guān)。以fDNA作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑為結(jié)直腸癌的治療研究提供了新的嘗試途徑,相關(guān)研究有待深入開展。

    參考文獻

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    ·論著·

    FaecalibacteriumprausnitziiGenomic DNA Enhances the Killing Activity of Peripheral Blood Mononuclear Cells against Human Colon Cancer LoVo Cells by Upregulating Th1 Immune ResponseZHANGTao1,ZHANGMin1,TANGAirong1,CAOPing2,XIELijuan1,YUChenggong1,3.1DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing(210008);2DepartmentofGastroenterology,theDrumTowerClinicalMedicalCollegeofNanjingMedicalUniversity,Nanjing;3DepartmentofGastroenterology,YizhengHospital,DrumTowerHospitalGroupofNanjing,Nanjing

    Correspondence to: YU Chenggong, Email: chenggong_yu@nju.edu.cn

    Background:Faecalibacteriumprausnitzii(Fp) is a commensal intestinal bacterium that exhibits anti-inflammatory and immunomodulatory capacityinvivoandinvitro. It has been reported that Fp in intestinal lumen was reduced in patients with colorectal cancer, which might be a factor associated with cancer development. Aims: To investigate the effect and immunological mechanism of Fp and its genomic DNA (fDNA) on the killing activity of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) against human colon cancer LoVo cells. Methods: PBMCs derived from healthy adults were co-culturedinvitrowith Fp, fDNA, or the digested fDNA (d-fDNA), respectively. Killing activity of PBMCs against LoVo cells was measured by MTT assay; concentrations of interferon-gamma (INF-γ), a Th1-type cytokine and interleukin-4 (IL-4), a Th2-type cytokine in culture supernatant of PBMCs were determined by ELISA; and expressions of T-bet and GATA3, the transcription factors specific for Th1 and Th2 cells, were measured by real-time PCR. Results: Compared with the PBMCs not treated, fDNA could significantly enhance the killing activity of PBMCs against LoVo cells (P<0.05); meanwhile, it promoted IFN-γ secretion, up-regulated T-bet mRNA expression and inhibited IL-4 secretion and GATA3 mRNA expression in PBMCs (P<0.05). Similar effects were not observed in PBMCs treated with Fp and d-fDNA. Conclusions: fDNA enhances the killing activity of PBMCs against human colon cancer cells by up-regulating Th1 immune response.

    Key wordsFaecalibacterium prausnitzii;Interferon-gamma;Interleukin-4;Th1-Th2 Balance;

    通信作者&本文,Email: chenggongyu@nju.edu.cn

    DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.08.002

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