菊芋葉蛋白提取工藝研究及氨基酸分析

俞夢妮，包婉君，諶馥佳，隆小華，劉 玲，劉兆普

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210095)

后生物生產(chǎn)層

菊芋葉蛋白提取工藝研究及氨基酸分析

俞夢妮，包婉君，諶馥佳，隆小華，劉 玲，劉兆普

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210095)

以新鮮菊芋(Helianthustuberosus)葉片為材料，研究葉蛋白的提取工藝。比較了4種提取劑對(duì)菊芋葉蛋白的提取效果，通過對(duì)葉蛋白得率、粗蛋白含量和粗蛋白提取率的比較，以焦亞硫酸鈉溶液的提取效果最佳；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用料液比、加鹽量、絮凝溫度、pH值多因素正交處理，對(duì)菊芋葉蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，其最佳提取工藝條件為：料液比1∶7，加鹽量0.5%，絮凝溫度90 ℃，pH 2.0；對(duì)提取葉蛋白進(jìn)行氨基酸分析的結(jié)果表明，菊芋葉蛋白氨基酸種類齊全，配比協(xié)調(diào)，總氨基酸含量為42.07%，必需氨基酸占總氨基酸的比值(E/T)為40.55%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(E/N)為0.68。

菊芋；葉蛋白；提取；氨基酸

菊芋(Helianthustuberosus)，又稱洋姜，為菊科向日葵屬一年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲，因其耐瘠、耐旱、耐病、適應(yīng)性強(qiáng)，在各地均有栽培[1-2]。近年來，菊芋在食品[3]、生態(tài)保護(hù)[4]、生物能源[5-6]等方面應(yīng)用廣泛，是具有重要開發(fā)價(jià)值的新型經(jīng)濟(jì)作物。其塊莖是生產(chǎn)菊粉和果糖的理想原料；莖葉的飼用價(jià)值高于馬鈴薯(Solanumtuberosum)和向日葵(Helianthusannuus)的基葉，可作為優(yōu)良飼料[7]。

隨著生活水平的提高，人類對(duì)蛋白質(zhì)的需求不斷增加，國內(nèi)外都在致力于開發(fā)新的蛋白質(zhì)資源，其中對(duì)植物葉蛋白的開發(fā)已引起人們廣泛的關(guān)注[8]。葉蛋白(Leaf Protein Concentrate，LPC)亦稱植物濃縮蛋白，是以新鮮牧草或其他青綠植物為原料，經(jīng)榨汁后從汁液中提取的高蛋白質(zhì)濃縮物[9]，必需氨基酸和非必需氨基酸含量豐富、種類齊全、配比合理。

菊芋葉片中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、還原糖類、生物酸以及油脂等化學(xué)成分[1]。目前，對(duì)菊芋葉蛋白的研究國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。為此，對(duì)菊芋葉蛋白的提取劑選擇、提取條件以及所提葉蛋白的氨基酸組成進(jìn)行了初步的研究，旨在為菊芋的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以“南芋1號(hào)”菊芋葉片為材料，于2013年8月采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)山東泰安試驗(yàn)基地，采回洗凈后4 ℃冷藏備用。

1.2 主要儀器與試劑

8400全自動(dòng)凱氏定氮儀(瑞典FOSS公司)；PB-10 sartorius pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Allegre 63R高速冷凍離心機(jī)(美國BECKMAN公司)；電熱恒溫干燥箱(上海新苗醫(yī)療器材制造公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；JM-A2002電子天平(余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司)；日立L-8900型氨基酸分全自動(dòng)析儀(日本日立公司)；JY-C020E多功能榨汁機(jī)(山東九陽家電有限公司)。

焦亞硫酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菊芋葉蛋白的提取 將新鮮菊芋葉片剪切至1～2 cm小段，稱取10 g按一定的料液比加入提取劑中。榨汁機(jī)榨汁2 min，200 mm濾布過濾得墨綠色提取液。用1 mol·L-1鹽酸調(diào)pH，設(shè)定溫度下恒溫水浴中絮凝20 min。冷水冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心5 min，得到葉蛋白沉淀物，60 ℃烘箱中烘干，得葉蛋白成品，稱重并測定葉蛋白中粗蛋白的含量及葉蛋白得率[10-11]，計(jì)算粗蛋白提取率。

1.3.2 提取劑的選擇 固定其他提取條件不變，比較水、氯化鈉溶液、氫氧化鈉溶液和焦亞硫酸鈉溶液4種提取劑對(duì)菊芋葉蛋白提取率的影響，選擇提取效果最好的一種溶劑提取葉蛋白。

1.3.3 提取條件單因素試驗(yàn)

1)料液比對(duì)提取的影響：在加鹽量為0.3%、絮凝溫度70 ℃、pH 3.0下，比較料液比為1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9和1∶11時(shí)的葉蛋白得率及葉蛋白中粗蛋白的含量，計(jì)算粗蛋白提取率，比較粗蛋白的提取效果。

2)加鹽量對(duì)提取的影響：在料液比為1∶5、絮凝溫度70 ℃、pH 3.0下，比較加鹽量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.8%時(shí)的粗蛋白提取效果。

3)絮凝溫度對(duì)提取的影響：在料液比為1∶5、加鹽量0.3%、pH 3.0下，比較絮凝溫度為50、60、70、80和90 ℃的條件下粗蛋白提取效果。

4)pH對(duì)提取的影響：料液比為1∶5、加鹽量0.3%、絮凝溫度70 ℃下，分別調(diào)節(jié)pH至2.0、3.0、4.0、5.0和6.0比較粗蛋白提取效果。

1.3.4 提取工藝正交試驗(yàn) 為了明確各因素條件對(duì)菊芋葉蛋白絮凝效果的相互影響，尋求較優(yōu)提取方法。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以榨汁時(shí)間為2 min,絮凝時(shí)間為20 min的條件下選取料液比(A)、加鹽量(B)、絮凝溫度(C)、pH(D)，進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)(表1)。

1.3.5 菊芋葉片的氨基酸組成分析 按照GB/T1826-2000方法，樣品在110 ℃、6 mol·L-1鹽酸作用下水解24 h，用氨基酸自動(dòng)分析儀測定除色氨酸外的17種氨基酸。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 總蛋白含量的測定 按照GB/T5009.5-2010，采用凱氏定氮法測定菊芋葉片中粗蛋白的含量。

1.4.2 水分含量的測定 按照GB/T5528-2008，在(103±2) ℃恒溫干燥，樣品干燥前后質(zhì)量差即為樣品的水分含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20 和 Microsoft Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示結(jié)果。采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋葉片總蛋白含量和鮮葉水分含量

試驗(yàn)測得菊芋葉片的總蛋白含量為22.78%；鮮葉的水分含量為67.94%。

2.2 提取劑的選擇

在料液比1∶5、加鹽量0.3%、pH 3.0、絮凝溫度70 ℃的條件下，不同提取劑對(duì)菊芋葉蛋白的提取效果差異顯著(P<0.05)，以NaOH溶液為提取劑的葉蛋白得率顯著高于其他3種提取劑(圖1A)；對(duì)所提葉蛋白進(jìn)行粗蛋白含量測定，結(jié)果表明,以Na2S2O5溶液提取的葉蛋白粗蛋白含量最高(圖1B)；粗蛋白提取率的結(jié)果表明，4種提取劑對(duì)粗蛋白的提取效果最佳的為Na2S2O5溶液，粗蛋白提取率可達(dá)26.43%(圖1C)。綜上，用NaOH溶液提取菊芋葉蛋白雖然得到沉淀量多，但沉淀中大部分不是蛋白質(zhì)，NaOH不適宜作為菊芋葉蛋白提取劑。Na2S2O5溶液對(duì)粗蛋白的提取效果高于其他3種提取劑，故選取Na2S2O5為菊芋葉蛋白的提取劑，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 菊芋葉蛋白提取條件單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)提取的影響 在菊芋葉蛋白的提取過程中料液比對(duì)粗蛋白提取率影響較大(圖2)，料液比為1∶7時(shí)粗蛋白提取率最高，為20.81%。在料液比為1∶(2～7)的區(qū)間內(nèi)，粗蛋白提取率隨料液比的增加而增大，但當(dāng)料液比繼續(xù)升高時(shí)，粗蛋白提取率逐漸下降。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different low case letters indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

2.3.2 加鹽量對(duì)提取的影響 加鹽量從0.1%至0.4%，隨著濃度的增加，粗蛋白提取率顯著升高(P<0.05),至0.4%時(shí)達(dá)到最高，為22.35%；加鹽量升至0.5%，粗蛋白提取率開始下降；濃度繼續(xù)增加至0.8%，粗蛋白得率仍呈下降趨勢，但降幅趨于平緩(圖3)。

2.3.3 絮凝溫度對(duì)提取的影響 在50―80 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的逐漸升高，蛋白質(zhì)的絮凝增強(qiáng)，產(chǎn)生的沉淀量增加，粗蛋白提取率呈顯著上升趨勢(P<0.05)。溫度從70 ℃上升至80 ℃，粗蛋白提取率增加了11.16%；而從80 ℃上升至90 ℃時(shí)，粗蛋白提取率只增加了2.67%(圖4)。說明80 ℃之后，隨著溫度的升高，粗蛋白提取率的增幅減緩。

2.3.4 pH對(duì)提取的影響 葉蛋白的最佳沉淀pH范圍為3～4[12-13],因此選取酸性pH范圍研究其對(duì)粗蛋白提取效果的影響。pH值由2.0升至3.0時(shí)，粗蛋白提取率升高，至3.0時(shí)粗蛋白提取率達(dá)到最大，為22.34%，pH值繼續(xù)增大，粗蛋白提取率呈顯著下降的趨勢(P<0.05，圖5)。

2.4 菊芋葉蛋白提取最佳工藝的研究

2.4.1 提取工藝正交試驗(yàn) 極差分析可知，各因素對(duì)葉蛋白得率的影響大小順序?yàn)锳>B>C>D，即料液比>加鹽量>溫度>pH，最佳提取條件為 A2B3C3D2組合；對(duì)粗蛋白含量影響的大小順序?yàn)锳>D>B>C，最佳提取條件為A1B1C3D1組合；對(duì)粗蛋白提取率的影響順序與對(duì)粗蛋白含量的影響相同，最佳提取條件為A2B3C3D1組合(表2、3)。從各因素對(duì)3個(gè)指標(biāo)的影響顯著順序看，因素A即料液比的影響最大，因素C的影響最小。綜合考慮葉蛋白得率、粗蛋白含量和粗蛋白提取率，經(jīng)各因素水平間的分析比較，確定葉蛋白最佳提取條件組合為A2B3C3D1，即料液比1∶7、加鹽量0.5%、溫度90 ℃、pH 2.0。

2.4.2 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述確定的優(yōu)化提取條件，進(jìn)行菊芋葉蛋白提取最佳條件驗(yàn)證，平行3次，得到優(yōu)化條件的平均葉蛋白得率為4.09%,平均粗蛋白含量為48.96%，平均粗蛋白提取率為27.36%，粗蛋白的提取效果高于正交試驗(yàn)結(jié)果。

2.5 菊芋葉蛋白氨基酸組成分析

對(duì)最佳提取工藝條件提取所得的葉蛋白進(jìn)行氨基酸分析(表4)，結(jié)果表明，菊芋葉蛋白的氨基酸組成較齊全，含有包括7種人體必需氨基酸[14]在內(nèi)的17種常見氨基酸。其中谷氨酸含量占氨基酸總量最高，為11.84%，其次是天門冬氨酸和亮氨酸，分別占氨基酸總量的10.43%和8.84%。必需氨基酸占總氨基酸的比值(E/T)為40.55%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(E/N)為0.68，達(dá)到了世界糧農(nóng)組織和衛(wèi)生組織(FAO/WHO) 提出的E/T為40%和E/N為0.6的參考蛋白模式[15]。

3 討論與結(jié)論

本研究所用材料是由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的“南菊芋1號(hào)”，其葉片中蛋白質(zhì)含量較高，經(jīng)測定，全生育期葉片的粗蛋白含量平均為22.78%[1]，可作為蛋白質(zhì)資源開發(fā)的優(yōu)質(zhì)原料。

葉蛋白的提取技術(shù)是目前葉蛋白研究的重點(diǎn)，研究表明，將葉片與提取劑按比例打漿，再以酸化加熱法絮凝沉淀，可保證高蛋白質(zhì)提取率[11]。選擇適宜的提取劑，能最大限度地提取出葉片中的蛋白質(zhì)，提高葉蛋白產(chǎn)量。大部分研究以水為提取劑，李道娥等[17]以NaCl溶液提取苜蓿(Medicagosativa)葉蛋白，江洪波和雷挺[18]以NaOH溶液為浸提劑提取桑葉(Morusalba)葉蛋白，朱宇旌等[10]采用Na2S2O5溶液提取苜蓿葉蛋白?？紤]原料的差異性，本研究比較了以上4種提取劑對(duì)菊芋葉蛋白的提取效果，得出Na2S2O5溶液對(duì)粗蛋白的提取效果最佳，宜作為菊芋葉蛋白提取的溶劑。

注：*為必需氨基酸；蛋白質(zhì)水解后色氨酸由于脫去NH4+后幾乎完全被破壞[16]，并不說明樣品中不含色氨酸。

Note：* is essential amino-acid; the tryptophan is destoryed by losing NH4+after proteolysis[16], which do not mean the sample lack of tryptophan.

菊芋葉蛋白的提取效果受料液比、加鹽量、絮凝溫度和pH等多種因素影響，單因素試驗(yàn)的結(jié)果表明，料液比為1∶7時(shí)提取效果最佳，料液比過低會(huì)導(dǎo)致浸提不充分，影響蛋白質(zhì)的提取效果，反之則會(huì)造成提取液濃度過稀，蛋白質(zhì)凝集下降；菊芋葉蛋白提取適宜的加鹽量為0.4%，這可能是因?yàn)镾2O52-與帶正電荷的蛋白質(zhì)基團(tuán)結(jié)合，使蛋白質(zhì)之間的靜電排斥力增加，提高了蛋白質(zhì)的溶解性，在一定的鹽濃度范圍內(nèi)，溶解性隨濃度的增加而增大，超過這個(gè)范圍溶解度又開始下降[17]；加熱會(huì)使大多數(shù)蛋白質(zhì)形成不溶解的凝固體，且隨著溫度的升高，蛋白酶變性，酶反應(yīng)速率減小，蛋白質(zhì)絮凝增加，但溫度過高會(huì)增加生產(chǎn)成本，建議實(shí)際生產(chǎn)中菊芋葉蛋白適宜的絮凝溫度為80 ℃；pH對(duì)葉蛋白提取影響的原因在于蛋白質(zhì)是表面帶有正負(fù)電荷的兩性電解質(zhì)，pH會(huì)影響其在溶液中的解離狀態(tài)和程度，當(dāng)pH到達(dá)某一數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒表面聚集了數(shù)量相等的正負(fù)電荷，此時(shí)蛋白質(zhì)呈電中性，其膠體溶液的穩(wěn)定性最差，蛋白的沉淀量最大[19]，pH為3.0時(shí)菊芋葉蛋白沉淀最大。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，料液比是影響葉蛋白提取效果的最主要因素，這與朱宇旌等[10]、周建建等[11]的研究結(jié)果相似。選擇適宜的料液比能以最少的提取劑獲得最多的蛋白質(zhì)，這在葉蛋白提取中至關(guān)重要。

菊芋葉蛋白中氨基酸含量豐富，種類齊全，其中谷氨酸、天門冬氨酸和亮氨酸含量較高。這一結(jié)果與苜蓿[20-21]、紫云英(Astragalussinicus)[20]、繁縷(Stellariamedia)[22]葉蛋白的測定結(jié)果一致，這可能與植物葉片蛋白質(zhì)的氨基酸組成特點(diǎn)有關(guān)。含量較高的3種氨基酸對(duì)新陳代謝起著重要作用，谷氨酸被人體吸收后，形成的谷酰胺能夠清除新陳代謝過程中產(chǎn)生的氨；同時(shí)谷氨酸也是神經(jīng)遞質(zhì)之一，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的補(bǔ)劑[23]。天門冬氨酸能補(bǔ)充心肌因缺氧缺血而引起的底物耗損，參與心肌無氧代謝，促進(jìn)糖酵解，可用于心肌保護(hù)[24]。亮氨酸能促進(jìn)骨骼肌蛋白的合成，在骨骼肌和心肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)中扮演著重要角色[25]。近年來，菊芋葉片化學(xué)成分的研究取得了一定的進(jìn)展[26]，但其氨基酸組成特點(diǎn)國內(nèi)外尚未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

綜上，以Na2S2O5溶液為提取劑提取菊芋葉蛋白，在料液比1∶7、加鹽量0.5%、溫度90 ℃和pH 2.0的最佳提取條件下，葉蛋白得率為4.09%，粗蛋白含量為48.96%，粗蛋白提取率為27.36%。對(duì)所得葉蛋白的氨基酸組成分析表明，菊芋葉蛋白富含17種氨基酸，總氨基酸含量為42.07%，E/T為40.55%，E/N為0.68，達(dá)到FAO/WHO提出的參考蛋白模式，是一種具有開發(fā)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Leaf protein extraction process optimization and analysis of amino acids contents ofHelianthustuberosus

YU Meng-ni, BAO Wan-jun, CHEN Fu-jia, LONG Xiao-hua, LIU Ling, LIU Zhao-pu

(College of Resources and Environmental Science, Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The extraction process of fresh leaf protein concentrate (LPC) ofHelianthustuberosuswas studied. Four kinds of extraction agents were evaluated based on the extraction rate of LPC, protein content of LPC and extraction rate of crude protein and the result suggested that sodium metabisulfite was optimal for protein extraction. In order to optimize the extraction process of LPC, the solid-liquid proportion, dosage of salt, temperature and pH were optimized by single factor and orthogonal test. The optimal LPC extraction process conditions were solid-liquid proportion of 1∶7, salt dosage of 0.5%, temperature at 90 ℃ and pH 2.0. The amino acid content analysis suggested the LPC was rich in all kinds of amino acid with harmonious proportion. The total content of amino acid was 42.07%, the ratio of essential amino acids and total amino acids (E/T) was 40.55% and the ratio of essential amino acids and non-essential amino (E/N) was 0.68.

Helianthustuberosus; leaf protein concentrate; extraction; amino acid

LIU Ling E-mail：liuling@njau.edu.cn

2014-03-19 接受日期：2014-09-04

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目[CX(12)1005-06]；國家科技支撐項(xiàng)目(2011BAD13B09)

俞夢妮(1990-)，女，浙江嵊州人，在讀碩士生，研究方向?yàn)橹参镔Y源利用。E-mail：2012803170@njau.edu.cn

劉玲(1973-)，女，安徽石臺(tái)人，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)及利用。E-mail：liuling@njau.edu.cn

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A

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