流感病毒逃避宿主天然免疫抗病毒應答研究進展

李永濤，王川慶

(1.河南農業(yè)大學禽病研究所，鄭州 450001；2.華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070)

流感病毒逃避宿主天然免疫抗病毒應答研究進展

李永濤1，2，王川慶1*

(1.河南農業(yè)大學禽病研究所，鄭州 450001；2.華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070)

流感病毒是一種重要的呼吸道疾病病原，在人群中每年都會造成地方性流行，因其抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行。流感病毒也可在多種動物群體持續(xù)傳播，偶爾可經動物感染人類并在人群中傳播和適應，一定條件下給人類健康造成潛在的威脅。天然免疫應答，特別是干擾素應答是機體早期抵御病毒感染的關鍵屏障；病毒突破這道屏障，才能成功感染宿主。為對抗病毒感染，宿主細胞利用一系列精密的抗病毒策略：利用模式識別受體識別病毒表達的產物，激活一系列信號級聯反應，并導致干擾素等細胞因子的產生；干擾素誘導下游效應分子的表達，進而抑制病毒復制，并輔助機體引發(fā)特異性免疫。在與宿主共進化過程中，流感病毒也形成一套完善的拮抗宿主干擾素通路的策略，使病毒能有效地在宿主細胞中感染和傳播。最近幾年，關于病毒誘導和調控宿主天然免疫應答的研究取得突飛猛進的發(fā)展，特別是大量研究發(fā)現病毒可以利用各種策略逃避宿主的抗病毒應答。因此，本綜述主要介紹流感病毒如何拮抗宿主的干擾素產生而逃避細胞抗病毒應答，有助于揭示流感病毒的致病機制和發(fā)現新的抗病毒靶標，從而為防控流感病毒感染奠定基礎。

流感病毒；天然免疫；干擾素；免疫逃避

流感病毒是分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科，包含8個片段，至少編碼11種蛋白質。流感病毒內部核心由核蛋白NP和基質蛋白M組成，根據它們抗原性的差異，可分為A、B、C三種類型。其中，A型流感病毒(influenza A virus，IAV)是最重要的病原體，它在人群和動物中呈季節(jié)性流行，很大程度上威脅著人類和動物健康。根據囊膜表面蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的抗體反應，IAV可再分為16種 HA亞型(H1～H16)和9種NA亞型(N1～N9)，而這些均可從天然宿主水禽體內分離出來[1]。在自然界，IAV宿主眾多、分布廣泛，給IAV的進化研究與監(jiān)控帶來了很大困難。IAV與其他病原體最大的區(qū)別是具有宿主泛嗜性，它幾乎可以感染所有家禽、水禽、野禽、水生哺乳動物、馬、牛、狗、豬及人等[2]。在與宿主共進化的過程中，IAV 獲得多種策略來逃避宿主的免疫反應，從而在宿主群體中持續(xù)感染，并不時造成流行或大流行，不僅給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經濟損失，而且對人類健康構成嚴重威脅[3]。IAV 對宿主致病性的強弱在很大程度上與其逃避宿主抗病毒免疫應答能力的強弱有關，因此，深入理解 IAV 如何逃避宿主抗病毒天然免疫應答的策略，不僅有助于揭示 IAV 的致病機制，而且更有利于發(fā)現新的藥物靶標，從而為 IAV 防控奠定基礎。

1 IAV激活干擾素應答

病原微生物感染宿主后，宿主細胞通過體內廣泛表達的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)監(jiān)測病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的存在，PRR被激活后通過招募下游接頭蛋白，觸發(fā)一系列磷酸化或泛素化介導的信號級聯反應，最終活化轉錄因子NF-κB(nuclear factor κB)和干擾素調節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)，誘導干擾素(interferon，IFN)和促炎性細胞因子的表達[4]。

干擾素是一類低相對分子質量、具有多種生物學活性的細胞因子。根據來源、序列和生物學功能等方面來劃分，干擾素分為三大家族，分別是Ⅰ型干擾素(主要包括人體內發(fā)現的IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-κ，以及在反芻動物中發(fā)現的IFN-τ和小鼠中IFN-ζ等亞家族)、Ⅱ型干擾素(即IFN-γ)以及后來發(fā)現的Ⅲ型干擾素(包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3)[5]。目前，在動物疾病防控中，干擾素得到廣泛應用。比如，大量的體內和體外試驗表明，豬Ⅰ型干擾素對威脅養(yǎng)豬業(yè)的許多病毒性傳染病均具有很好的抑制作用。有人用IFN-α處理豬的細胞，然后感染各種豬的病毒，結果發(fā)現除了豬細小病毒和輪狀病毒外，其他病毒的復制都不同程度受到影響，尤其是對水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)等RNA病毒抗病毒效果非常明顯。同樣，也有很多文獻報道了豬的IFN-β抗病毒譜，除了豬輪狀病毒，幾乎所有病毒對IFN-β都比較敏感[6-7]。

干擾素產生以后，并不直接發(fā)揮抗病毒作用，而是結合在鄰近細胞的相應受體——干擾素受體上，并通過下游的JAK-STAT通路激活多種效應分子的表達，如干擾素誘導基因(IFN-induced genes，ISGs)和轉錄調節(jié)因子的表達，從而發(fā)揮抗病毒作用。JAK-STAT通路最早是在研究Ⅰ型干擾素信號通路中被發(fā)現的，其激活一個三聚體轉錄因子，是由SH2-磷酸酪氨酸介導的異源二聚體STAT1和STAT2，以及結合的干擾素調節(jié)因子9(inteferon regulatory factor 9，IRF9)組成。這樣一個三聚體復合物，經活化后進入細胞核與ISGs的啟動子元件(IFN-stimulated response element，ISRE)結合，共同組成ISGF3(IFN-stimulated gene factor-3 transcription factor complex 3)激活Ⅰ型和Ⅲ型干擾素誘導的下游基因的轉錄和表達[8]。

2 IAV逃避干擾素應答

盡管干擾素系統具有強大的抗病毒活性，但是也并不能完全控制IAV的感染。在進化過程中，包括IAV在內的很多病毒已經形成一套完善的拮抗干擾素通路的策略，使得病毒能夠有效地在宿主細胞中感染和傳播。有趣的是，IAV可以表達多種蛋白質、利用不同途徑拮抗或逃避干擾素介導的抗病毒應答。

2.1 NS1蛋白

作為非結構蛋白，NS1蛋白是IAV表達的最重要也是研究最多的干擾素拮抗蛋白，它可以作用于多個靶點、通過多種方式阻止宿主的干擾素應答。NS1蛋白在宿主細胞質和細胞核高度表達，并與細胞質或細胞核的多種參與干擾素通路的蛋白質相互作用，抑制干擾素產生[9]。首先，NS1蛋白利用其氨基端73個氨基酸組成的RNA結合區(qū)(RNA binding domain)與病毒的雙鏈RNA(dsRNA)結合，競爭性的抑制dsRNA介導的RLRs(RIG-I-like receptors)、PKR(Protein kinase R)以及OAS(2′-5′oligoadenylate synthetase)的激活。活化的RLRs、PKR以及OAS對細胞抵抗病毒感染起著非常重要的作用。由于OAS與dsRNA親和力最低，所以NS1與dsRNA的結合大大降低OAS的激活[10]。有趣的是，NS1還能與PKR互作以及通過結合并降低TRIM25活性，有效地抑制PKR和RIG-I的激活以及下游干擾素的產生[11]。當人為突變流感病毒NS1蛋白的第92位氨基酸(天冬氨酸)，NS1蛋白則喪失了抑制RIG-I泛素化激活的能力，說明該位點在NS1蛋白調控干擾素通路中至關重要[12]。此外，還有研究發(fā)現在鴨的細胞，流感病毒NS1蛋白可以抑制MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)介導的細胞抗病毒免疫應答，但是具體機制還有待于進一步研究[13]。

前面提到，當細胞被病毒感染時，病毒dsRNA作為激活劑活化PKR，進而誘導抗病毒細胞因子的產生。后來科學家發(fā)現一個新的可與PKR互作并激活PKR的蛋白質，命名為PACT(PKR-activating protein)[14]。進一步研究發(fā)現PACT還可以通過與RIG-I互作激活RIG-I介導的抗病毒信號通路，證明了PACT在病毒激活干擾素信號通路中必不可少[15]。但是，最近研究發(fā)現，流感病毒可以通過其NS1蛋白與PACT發(fā)生相互作用，干擾PACT與RIG-I以及PKR的互作，最終破壞了二者介導的細胞抗病毒應答[16]。

其次，NS1還可以通過抑制細胞核內宿主mRNA的加工，進而抑制宿主基因(包括抗病毒基因)表達。其抑制功能主要通過與宿主因子CPSF30(30kDa subunit of the cleavage and polyadenylation factor)的互作以及抑制宿主細胞mRNA由細胞核向細胞質轉運來實現[17]。一般來講，NS1不但抑制宿主的干擾素表達，還抑制ISGs的表達?，F在已經知道了NS1結合dsRNA和CPSF30的結構，通過人為突變這些結合位點，構建出的重配病毒則喪失拮抗干擾素應答的能力。然而，在IAV毒株中，NS1對CPSF30 抑制效應并不是保守的，很多病毒沒有結合CPSF30的能力，如2009年新出現的H1N1大流行病毒(2009/H1N1)。即便如此，2009/H1N1病毒仍能成功感染人并在人群中傳播。需要注意的是，將2009/H1N1病毒人為突變使其獲得與CPSF30結合的能力，并不能增強其在小鼠上的復制和致病力[18]。因此，在其他IAV毒株上肯定還存在其他的機制彌補NS1功能的缺乏。

此外，早期有人發(fā)現NS1蛋白可以通過抑制NF-κB活性降低IFN-α和IFN-β的產生，但是具體機制不太清楚[19]。后來，有報道顯示NS1蛋白通過與NF-κB通路中重要激酶IKKα和IKKβ存在相互作用進而阻止這些激酶的磷酸化，最終破壞NF-κB復合物的入核和下游基因的表達，包括干擾素的產生[20-21]。IAV不但可以在RLRs介導的信號通路中抑制干擾素產生，而且還可以通過JAK-STAT通路阻止干擾素介導的下游信號通路，減弱干擾素誘導的下游效應分子的抗病毒作用。具體說來，NS1主要通過降低STAT1、STAT2和STAT3磷酸化水平進而抑制STAT2進入細胞核以及與ISGs啟動子區(qū)DNA序列的結合，從而抑制了ISGs和干擾素的表達[22]。

最近，研究者發(fā)現人類機體細胞產生的名為DDX21(DEAD box helicase 21)的蛋白質可以有效阻斷流感病毒的復制過程，但是流感病毒產生的NS1蛋白可以反過來阻斷蛋白質DDX21的功能并且促進病毒復制。流感病毒正是利用了NS1蛋白來作為逃避機體天然防御機制的盾牌[23]。

除了可以拮抗干擾素以及下游通路，NS1還參與了病毒感染的其他過程，這也反映出NS1多功能的特點。在病毒感染的不同階段，NS1蛋白如何協調諸多功能仍然不清楚，未來這也將是一個有趣的研究方向。

2.2 PB1-F2蛋白

一些IAV毒株的PB1基因具有第二個開放閱讀框，可以編碼由80個氨基酸組成的多肽，即PB1-F2蛋白。PB1-F2也是IAV一個重要的毒力因子，具有獨特的多態(tài)性。比如1918年大流行IAV，其PB1-F2的66位氨基酸由天冬酰胺變成絲氨酸，與其毒力增強密切相關[24]。當PB1-F2的66位氨基酸由N變成S后，病毒拮抗干擾素的能力顯著上升，這也是66位突變后病毒毒力增強的一個原因[25]。后來發(fā)現，PB1-F2有一個線粒體定位信號，通過與線粒體上干擾素通路重要的接頭蛋白——線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS，也稱IPS-1、VISA或Cardif)互作以及降低線粒體膜電勢來拮抗RLRs介導的干擾素信號通路[26-27]。有趣的是，也有報道PB1-F2可以抑制宿主的炎癥應答，降低NF-κB通路介導的細胞因子(如IL-1β、IL-6和IL-8)的產生[28]。最近，有人進一步證實PB1-F2與IKKβ相互作用，通過未知的機制阻止激活的NF-κB進入細胞核后與相應啟動子的結合，最終降低炎癥相關細胞因子的產生[29]。

2.3 PB2蛋白

PB1-F2并不是唯一可以定位在線粒體的IAV蛋白質。病毒的聚合酶復合物中另一成員PB2蛋白，也可以定位到線粒體；不過在病毒開始復制時，PB2主要在細胞核存在。通過系統生物學分析病毒蛋白質與宿主蛋白質的相互作用，已經揭示了病毒的PB2蛋白也具有干擾素拮抗功能[30]。進一步的研究顯示，與PB1-F2作用機制相似，PB2也是通過與MAVS相互作用進而逃避宿主的干擾素抗病毒應答[31]。同樣有趣的是，一些具備特殊PB2蛋白的病毒的聚合酶活性非常高，復制速度很快，因此可以間接逃避宿主的干擾素應答[32]。最近，本實驗室趙宗正等[33]發(fā)現PB2蛋白第588位氨基酸由T突變?yōu)镮可以增強2009/H1N1 IAV拮抗宿主干擾素應答的能力，進而導致病毒毒力的顯著增強。

2.4 病毒編碼的其他蛋白質

流感病毒的NS1、PB1-F2和PB2蛋白并不是僅有的可以拮抗宿主干擾素應答的蛋白質。最近，S.Liedmann等通過比較兩株對干擾素誘導能力不同的流感病毒的基因差異，發(fā)現流感病毒編碼的聚合酶蛋白PB1和PA也能夠參與調節(jié)宿主的干擾素產生水平，暗示PB1和PA可能也是潛在的干擾素拮抗蛋白[34]。

IAV的M2蛋白是一個小分子離子通道跨膜蛋白，在病毒膜融合過程中參與病毒核糖核蛋白的有效脫殼。最近，有人發(fā)現，M2蛋白可以干擾宿主的自噬過程[35]。病毒感染過程中，Toll樣受體(TLRs)的激活離不開細胞自噬，提示M2蛋白可能利用這個機制抑制TLRs通路的激活和干擾素的產生。但是，這也需要進一步的證實。

我們知道，除了編碼公認的11個蛋白質，流感病毒還可以編碼PA-X、PA-N155、PA-N182和N40等其他幾個非結構蛋白[36]。雖然這些蛋白質只是在流感病毒復制過程中短暫出現，但是它們是否如NS1蛋白一樣，也參與病毒逃避宿主的天然免疫抗病毒應答，仍需要進一步探索。

2.5 利用宿主因子

從已有的文獻資料看，多數研究聚焦病毒編碼的蛋白質如何拮抗宿主的天然免疫應答，很少涉及到病毒利用宿主因子逃避細胞抗病毒應答，因此這方面的研究進展是很緩慢的。事實上，除了利用病毒自身合成的蛋白質直接拮抗干擾素，病毒還巧妙地利用特異性的細胞負調控因子來降低干擾素的抗病毒效果[22，37]。比如，IAV感染導致SOCS(suppressors-of-cytokine-signaling)蛋白上調表達，SOCS蛋白主要參與拮抗干擾素信號通路。此外，IAV還可以誘導細胞PKR抑制蛋白P58(IPK)的表達，間接抑制PKR激活。這個過程需要病毒誘導的P58蛋白從HSP40解離。最近，K.Sharma 等[38]發(fā)現，病毒NP蛋白也參與P58解離，因此，可以說NP和NS1蛋白共同抑制PKR激活。LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)也是IAV利用宿主拮抗分子抑制干擾素產生的一個手段。LGP2與RIG-I同屬于RLRs家族蛋白，二者在IAV引起干擾素生成后都能上調表達，但是它們的功能截然相反。RIG-I是結合病毒RNA誘導干擾產生的主要的模式識別受體，在細胞抗病毒免疫應答中起著關鍵作用；相反，LGP2卻是一個拮抗干擾素產生的負調控分子，因為其缺乏結合病毒RNA的關鍵結構域，而只有一個抑制結構域，所以在病毒感染過程中抑制了干擾素的產生[39]。有些IAV毒株在感染過程中誘導LGP2上調表達，間接輔助病毒逃逸細胞免疫應答。

在 IAV等包膜病毒的病毒顆粒中，除包含病毒編碼的結構蛋白外，還包含來源于宿主細胞的多種蛋白質。2008年，M.L.Shaw等[40]首次通過蛋白質組學方法對在Vero細胞中增殖的流感病毒進行分析，發(fā)現成熟的病毒顆粒結合有36種宿主蛋白質。目前，對這些宿主蛋白在IAV逃逸細胞抗病毒免疫應答過程中所起作用的研究還很有限。最近，F.Berri等[41]發(fā)現IAV包裝的宿主膜連蛋白Annexin V可以抑制IFN-γ介導的抗病毒應答信號。同時，我們和其他研究者均發(fā)現IAV包裝的另外一個宿主蛋白質——熱休克蛋白27(HSP27)可以被病毒誘導表達以拮抗宿主的干擾素應答，從而逃避機體抗病毒免疫反應[42]。我們發(fā)現，流感病毒誘導的HSP27主要通過靶向干擾素信號通路中的TRAF3和TRAF6蛋白，導致二者發(fā)生泛素化降解，從而阻斷干擾素的產生[43]。未來需要系統性篩選還有哪些病毒包裝的宿主蛋白質可以幫助病毒逃逸宿主的免疫應答，以及揭示這些宿主蛋白質通過哪些方式或機制拮抗宿主抗病毒天然免疫應答。

2.6 利用宿主蛋白修飾系統

S．Pal等[44]曾經開創(chuàng)性地探索IAV與宿主小泛素相關修飾物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)之間的聯系，首次報道并發(fā)現IAV 的NS1蛋白是該病毒已知的第一個SUMO化修飾的靶蛋白，NS1蛋白的SUMO化修飾豐度非常高。接著，他們又發(fā)現NS1蛋白不但受SUMO1化修飾，而且還受SUMO2/3修飾，并且發(fā)現NS1蛋白219位和70位氨基酸是關鍵修飾位點。通過拯救不能被SUMO修飾的突變病毒發(fā)現，突變病毒的增殖顯著下降，抑制干擾素信號通路的能力也大大降低，提示NS1蛋白可能利用宿主蛋白SUMO修飾系統獲得最大的逃避機體抗病毒應答的能力[45]。最近，中科院上海巴斯德研究所分子病毒課題組發(fā)現流感病毒核蛋白NP同樣利用人細胞的SUMO修飾系統將自身進行翻譯后修飾，同時還找到了調控NP蛋白SUMO化的特異性E3泛素化酶PIASxa，這對深入揭示流感病毒的致病性和抗病毒治療具有重要意義[46]。

3 干擾素系統對IAV的宿主嗜性和致病性的影響

盡管IAV可以利用不同蛋白質在多個層次拮抗細胞干擾素應答，但是干擾素仍然是防治急性流感感染的關鍵策略。有人利用小鼠模型發(fā)現當敲除干擾素基因時，IAV的復制能力和對小鼠的致病力大大提高；而當干擾素存在時，則能很好的保護小鼠存活[47]。因此，IAV 對宿主致病性的強弱在很大程度上與其逃避宿主抗病毒免疫應答能力的高低有關。IAV拮抗干擾素的產生都會涉及到與宿主蛋白質的相互作用，這種互作很大程度上決定了病毒的宿主嗜性，因為一些毒株在特異性宿主已經適應以便于抑制干擾素通路相關的宿主因子。大量研究表明，病毒NS1拮抗干擾素的特征是病毒復制和持續(xù)感染的前提[48]。并且，NS1不但影響天然免疫，還影響后續(xù)的獲得性免疫?；诜墙Y構蛋白NS1作為IAV最重要的毒力因子，這就可以將NS1基因進行人工突變獲得重配的弱毒株，使之成為有效的候選疫苗[49]。另外，通過靶向抑制NS1蛋白的功能這一策略，可以篩選小分子抗IAV化合物。最近有人鑒定出一個小分子化合物可以阻止NS1蛋白對細胞基因表達的拮抗能力，并且有效抑制IAV的復制[50]。今后的研究重點可能需要發(fā)掘更多的能夠幫助病毒逃逸細胞抗病毒應答的宿主因子，并構建一系列相應宿主因子基因過表達細胞系，以期發(fā)現更好的細胞株供病毒增殖和疫苗生產。通過以上這些途徑能否開發(fā)出新的疫苗平臺和抗病毒藥物，以便用于IAV的預防和治療，仍需要后續(xù)的研究來確定。因此，深入理解 IAV 如何逃避宿主抗病毒天然免疫應答的策略，不僅有助于揭示 IAV 的致病機制，而且有助于發(fā)現新的抗病毒藥物靶標，從而為 IAV 的防控奠定基礎。

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(編輯 白永平)

Evasion of Host Innate Immune Antiviral Responses by Influenza Viruses

LI Yong-tao1，2，WANG Chuan-qing1*

(1.InstituteofPoultryDiseases，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450001，China；2.StateKeyLaboratoryofAgricultureMicrobiology，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

Influenza virus is an important respiratory pathogen，which can bring endemic infection in people every year，and can cause worldwide pandemic due to its easy variation of antigenicity.Influenza viruses can also spread in a variety of animal populations，transmit occasionally from animal species to the humans and spread in the population，resulting in potential threats to human health under certain conditions.Host innate immune response，especially early interferon response is the body’s first defense barrier against viral infections.Viruses must breakthrough that barrier in order to successfully infect the host.To fight viral infections，the host cells use a range of sophisticated anti-viral strategies：the cells firstly use pattern recognition receptor to recognize viral products，and then activate signaling cascades，leading to a range of interferon and other cytokines；downstream effector molecules are induced by interferons and inhibit viral replication；the activated cytokines contribute to adapted immune response.In the process of co-evolution with the host，influenza virus also develops perfect antagonist strategies to host interferon pathway，which help virus infect the host and spread efficiently in host cell.In recent years，the studies on how virus induces and modulates host innate immune response have made rapid development，and a large study found that the virus can utilize a variety of strategies to evade host antiviral response.Therefore，this review focuses on how influenza virus antagonizes host interferon production and evades cellular antiviral response，which will be contributed to uncover the pathogenicity mechanisms of influenza virus and reveal novel antiviral targets for the prevention and control of influenza infection.

influenza virus；innate immune；interferon；immune evasion

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.003

2014-08-18

河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(14IRTSTHN015)；河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃(14HASTIT022)；華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室開放基金(AMLKF201308)

李永濤(1985-)，男，河南西華人，講師，博士，主要從事畜禽天然免疫研究，E-mail：yongtaole@126.com，Tel：0371-63555516

*通信作者：王川慶，教授，E-mail:wchuanq@163.com

S852.659.5；S852.4

A

0366-6964(2015)04-0526-08