內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)基因與藏雞低氧適應(yīng)機(jī)制的研究

劉玲燕,蘭 茜,朱 慶

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，雅安 625014)

內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)基因與藏雞低氧適應(yīng)機(jī)制的研究

劉玲燕,蘭 茜,朱 慶*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，雅安 625014)

內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)作為調(diào)控血管舒張因子NO生成的限速酶，對維持機(jī)體NO平衡和適應(yīng)低氧環(huán)境具有重要作用。長期生活在高海拔低氧地區(qū)的藏雞，形成了一套獨(dú)特的低氧適應(yīng)機(jī)制。作者就eNOS基因結(jié)構(gòu)、編碼產(chǎn)物特征和功能進(jìn)行了綜述，并對藏雞eNOS基因參與低氧適應(yīng)的遺傳機(jī)制進(jìn)行探討，以期為家禽起源、進(jìn)化、育種等工作提供借鑒。

藏雞；低氧適應(yīng)；NO；eNOS

藏雞(Tibetan chicken)是全世界生活在高海拔地區(qū)歷史最長的雞種，它具有耐粗飼，抗病力強(qiáng)，肉味美，蛋營養(yǎng)價值高等特點(diǎn)，是中國高海拔地區(qū)發(fā)展養(yǎng)雞業(yè)不可缺少的品種，是開發(fā)西藏優(yōu)質(zhì)、特色禽產(chǎn)品的良好資源[1]，其機(jī)體已經(jīng)形成了低氧適應(yīng)的遺傳機(jī)制。內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial NO synthases，eNOS)在低氧適應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，低氧可通過轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和翻譯后水平多種模式調(diào)節(jié)eNOS的功能[2]。eNOS主要分布在脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮組織，它的結(jié)構(gòu)包括N端的氧化結(jié)構(gòu)域和C端的還原結(jié)構(gòu)域，只有兩個eNOS單體形成活性的異二聚體結(jié)構(gòu)才能催化L-精氨酸生產(chǎn)NO[3]。在生理?xiàng)l件下由eNOS產(chǎn)生的少量NO能夠維持生物體正常的生理功能，包括血管緊張度，血壓，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和抑制血栓形成等[4-5]，同時，研究表明低氧會刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的eNOS和NO[6]，以增大呼吸量，調(diào)節(jié)血壓和氧含量，這可能是eNOS的表達(dá)量與低氧適應(yīng)有關(guān)的主要原因。對藏雞eNOS基因的研究有助于為家禽起源、進(jìn)化、育種等工作提供借鑒。

1 eNOS 基因及其編碼產(chǎn)物

eNOS在不同物種中位于不同染色體上，人類的eNOS(NC_000007.13)位于7號染色體；家鼠的eNOS(NC_000071.6)位于5號染色體，雞的eNOS(NC_006089.3)位于2號染色體，全長10.7 kb，通過可變剪接可形成7個獨(dú)特的mRNA轉(zhuǎn)錄本(JQ434754.1、JQ434755.1、JQ434756.1、JQ434757.1、JQ434758.1、JQ434759.1、JQ434760.1)，其長度在3 000 bp左右；其中的一個轉(zhuǎn)錄本1(JQ434754.1)長度為3 310 bp，起始密碼子和終止密碼子分別位于281—283 bp和3 236—3 238 bp，編碼合成985個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為110 ku；哺乳動物中，eNOS基因核酸序列和蛋白質(zhì)序列相似性分別為86%～99%和91%～99%。而雞的eNOS的cDNA序列和蛋白質(zhì)序列與哺乳動物序列相比分別有72%～77%和71%～72%的相似性[7]。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶是一氧化氮合酶(NO synthases ，NOS)家族的成員之一，NOS共有4個亞型，包括神經(jīng)元型NOS(neuronal NO synthases，nNOS)、內(nèi)皮型NOS(endothelial NO synthases，eNOS)，誘導(dǎo)型NOS(inducible NO synthases，iNOS)和線粒體NOS(mitochondrial NO synthases，mtNOS)。以哺乳動物為例說明功能結(jié)構(gòu)域，N端是一個包含亞鐵素、L-精氨酸和四氫生物嘌呤(tetrahydrobiopterin，BH4)結(jié)合位點(diǎn)的氧化酶域(氨基酸1-491)，C端是一個含黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)結(jié)合位點(diǎn)的一個還原酶域(氨基酸492—1 205)[8-9]。在NO合成中，還原酶域中的NADPH得到電子，并轉(zhuǎn)給其余的電子受體，最終通過FMN再轉(zhuǎn)給氧化酶域的亞鐵素，亞鐵素得到電子后，能夠綁定O2并刺激L-精氨酸產(chǎn)生NO[10]。

2 eNOS的高海拔適應(yīng)功能

周錦等[11]的研究表明敲除eNOS基因(eNOS-/-)的小鼠顯示出低氧肺血管結(jié)構(gòu)重塑和肺動脈高壓，而吸入NO能有效地緩解這些癥狀[12]；轉(zhuǎn)入eNOS基因的轉(zhuǎn)基因小鼠不僅可以抑制由低氧引起的肺動脈壓增高，也可以抑制由低氧引起的肺小血管結(jié)構(gòu)重塑[13]。具有eNOS缺陷的小鼠也更容易患高海拔水腫。有研究者發(fā)現(xiàn)，在高海拔肺水腫病人中，NO的水平減少，而藏人、艾瑪拉人[14]和拉達(dá)克人[15]在他們呼出的氣體和循環(huán)血液中具有較高水平的NO。此外，在對日本民眾的研究發(fā)現(xiàn)，高海拔肺水腫易感性與eNOS的多態(tài)性有關(guān)[16]。這些研究支持了高水平的NO和eNOS具有高海拔的適應(yīng)作用，同時也表明了對低氧的敏感性是有遺傳基礎(chǔ)的。此外，相較于健康雞，飼養(yǎng)在高海拔的患肺動脈高壓雞的肺組織eNOSmRNA轉(zhuǎn)錄量和肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)都更低，而較低的eNOS表達(dá)與平滑肌增厚有關(guān)[17]。

3 eNOS 基因在藏雞低氧適應(yīng)性中的研究進(jìn)展

eNOS基因的研究已涉及生長、代謝以及病理學(xué)等領(lǐng)域，隨著eNOS在低氧適應(yīng)中的重要作用逐漸被人們接受，人們也對藏雞的低氧適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了探索。

盡管來自人類、小鼠、牛、豬和其他哺乳動物的eNOS基因的cDNA序列在20世紀(jì)末已經(jīng)被克隆，但是雞的eNOS基因直至2012年才被完全鑒定或克隆。作為調(diào)節(jié)血管舒張素NO生成的限速酶，eNOS基因在其低氧適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。研究表明，低氧條件下，低地雞與藏雞胚胎孵化過程中不同組織的eNOS的mRNA表達(dá)豐度存在差異，這可能與藏雞的低氧適應(yīng)有關(guān)[7]。

3.1 藏雞呼吸系統(tǒng)eNOS與低氧適應(yīng)機(jī)制的研究

胚胎發(fā)育是一個動態(tài)的過程，它不僅僅由生物體遺傳背景決定，還由所處的環(huán)境決定[18]。通過比較在低地飼養(yǎng)的藏雞和壽光雞的胚胎eNOS的 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，無論是低氧還是常氧，藏雞肺組織中eNOS的表達(dá)顯著高于壽光雞[7]。此外，張浩等[19]研究也表明，在低氧條件下，藏雞和低地雞的肺組織eNOS酶活力比生活在低海拔時明顯增加；但無論在低海拔還是在高海拔時，藏雞eNOS酶活力都比低地雞高，尤其在高海拔，差異更加明顯。同時，H.Zhang等[20]研究了低氧對孵化性能的影響，結(jié)果表明，具有不同低氧適應(yīng)遺傳背景的藏雞和矮小型雞，在2 900 m海拔上孵化，無論是孵化率，胚胎重還是雞重，藏雞都比矮小型雞高出一倍；補(bǔ)充O2后，矮小型雞的孵化率大大提高。說明O2不足是導(dǎo)致低地雞在2 900 m海拔孵化率低和小雞質(zhì)量差的主要因素，藏雞肺組織eNOS酶的高表達(dá)和高活力可能是其適應(yīng)低氧的重要因素之一。

3.2 藏雞血管系統(tǒng)eNOS與低氧適應(yīng)機(jī)制的研究

在血管系統(tǒng)中，雖然eNOS一直被認(rèn)為主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但是后來P.Kleinbongard等[21]運(yùn)用免疫熒光聚焦顯微鏡、WB等方法，證實(shí)了人的每個紅細(xì)胞中都存在eNOS蛋白，而且在紅細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，并證實(shí)了eNOS蛋白存在于細(xì)胞膜內(nèi)面和細(xì)胞液。這一發(fā)現(xiàn)使eNOS的定位得到補(bǔ)充，同時對eNOS在氧運(yùn)輸和血液動力學(xué)方面開辟新的領(lǐng)域。不過eNOS的mRNA是否在紅細(xì)胞中表達(dá)仍存在爭議[22]。而無論是藏雞還是低地雞，紅細(xì)胞中是否存在eNOS的表達(dá)，還未曾見報(bào)道。

藏雞和低地雞血液生理生化指標(biāo)的研究可能解釋eNOS在紅細(xì)胞中的存在。張浩等[23]研究表明，與矮小隱形白羽肉雞相比，藏雞的血液體積、紅細(xì)胞體積和血漿體積都更低，可能說明了雞紅細(xì)胞中存在eNOS蛋白且藏雞紅細(xì)胞中的eNOS酶活力比低地雞強(qiáng)；但是也有許多生活在高海拔的動物具有更高的血液體積或紅細(xì)胞體積的報(bào)道[24-25]，這是否表明了鳥類與哺乳動物在血液生理方面具有不同的低氧適應(yīng)機(jī)制還有待證實(shí)。在低氧刺激下，藏雞血液紅細(xì)胞數(shù)目升高，平均紅細(xì)胞體積降低，紅細(xì)胞的表面積擴(kuò)大，更有利于血紅蛋白綁定氧，提高血紅蛋白運(yùn)輸氧的效率；同時也可能是低氧刺激紅細(xì)胞中eNOS蛋白增加，血管擴(kuò)張，更有利于對低氧的適應(yīng)。飼養(yǎng)在高海拔的藏雞能一直維持高水平的紅細(xì)胞數(shù)目和穩(wěn)定的血細(xì)胞比容值，而飼養(yǎng)在高海拔的矮小隱形白羽肉雞隨著年齡增長，紅細(xì)胞數(shù)和血細(xì)胞比容逐漸增加。這些結(jié)果表明在低氧環(huán)境下，藏雞擁有高水平的紅細(xì)胞數(shù)量是遺傳適應(yīng)機(jī)制，而矮小型隱形白羽肉雞增加的紅細(xì)胞數(shù)量是對低氧的生理補(bǔ)償性反應(yīng)。其他研究也證實(shí)了藏雞在遺傳上具有更高的靜脈CO2含量，血紅蛋白濃度和血氧親和力及更低的靜脈pH值，這些血液生理指標(biāo)是藏雞對低氧的生理適應(yīng)[26-27]。以上這些血液特點(diǎn)是否與eNOS的表達(dá)有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究確定。

4 結(jié) 語

總之，藏雞能夠適應(yīng)高海拔低氧的環(huán)境是整個機(jī)體各系統(tǒng)的協(xié)調(diào)合作完成的，包括呼吸系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)。藏雞各器官組織eNOS的表達(dá)特性可能是其在低氧環(huán)境生存的有利憑證。

藏雞長期生活在高海拔地區(qū)，與外界的基因交流較少，形成了一套獨(dú)特的遺傳基礎(chǔ)。雖然對其低氧適應(yīng)機(jī)制的研究也在不斷開展，但是研究的力度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。在哺乳動物中eNOS的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、病理學(xué)等領(lǐng)域的研究較多，較深入，但是在藏雞中的研究程度還顯得比較單薄。鑒于其低氧適應(yīng)機(jī)制的研究晚于哺乳動物，其研究發(fā)展空間還很大，今后還需要對此進(jìn)一步深入探討，尤其是對eNOS基因的進(jìn)化及其分布的探討具有很大的研究價值。

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(編輯 白永平)

The Research of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene in Hypoxia Adaptation of Tibetan Chicken

LIU Ling-yan，LAN Xi，ZHU Qing*

(FarmAnimalGeneticResourcesExplorationandInnovationKeyLaboratoryofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

As rate-limiting enzyme of regulating Nitric Oxide (NO) generation，endothelia nitric oxide synthase (eNOS) plays an important role to maintain the balance of NO，which is a vasodilatation factor.Life for a long time in high altitude hypoxic regions of Tibetan chicken，formed a unique mechanism of hypoxia adaptation.In this paper，the structure ofeNOSgene，coding product features and functions were reviewed，meanwhile，eNOSgene of Tibetan chicken involved in genetic mechanism of hypoxia adaptation are discussed，in order to provide help for the researches of origin，evolution，breeding of poultry，etc.

Tibetan chicken；hypoxic adaptation；NO；eNOS

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.003

2014-06-18

劉玲燕(1989-)，女，四川南充人，碩士生，主要從事家禽遺傳育種與繁殖方面的研究，E-mail:liulingyan_602@163.com

*通信作者：朱 慶，E-mail:zhuqing5959@163.com

S813.1

A

0366-6964(2015)02-0192-04