肝缺血再灌注損傷機制及相應保護措施的研究進展

彭方毅綜述，李 波審校

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000）

肝缺血再灌注損傷機制及相應保護措施的研究進展

彭方毅綜述，李 波審校

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000）

再灌注損傷； 肝細胞； 線粒體； 保護措施

肝缺血再灌注損傷（HIRI）的具體機制仍處在研究階段，包括鈣超載線粒體通透轉換孔道、氧化應激、缺血再灌注損傷相關炎癥因子、核轉錄因子、熱休克蛋白、一氧化氮等。缺血再灌注損傷（IRI）是目前臨床上常見的問題，進一步了解IRI機制，以及運用合適的方法去預防、治療IRI仍然是研究熱點。本文結合近年來國內(nèi)外相關文獻，就缺血再灌注損傷的機制及與其相關的保護措施的研究進展做一綜述。

1 線粒體損傷及相應保護措施

肝細胞發(fā)生IRI時，線粒體膜通透轉換孔道（mPTP）在細胞凋亡的過程中起著關鍵作用。Bcl-2家族蛋白等許多因子作用于線粒體，使線粒體膜上的通透性改變孔開放，繼而造成線粒體跨膜電位降低甚至崩解并釋放細胞色素C和凋亡誘導因子等促凋亡因子，激活caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)氧化應激產(chǎn)物氧自由基（ROS）、低氧狀態(tài)、能量抑制狀態(tài)及高濃度的Ca2+等多種因素均可以誘導mPTP開放，然而細胞內(nèi)pH降低及環(huán)孢素A（CsA）可以抑制mPTP開放[1-2]。

顯然細胞損傷程度與mPTP開放的程度呈正相關，能夠通過某種方式抑制mPTP開放就可能減輕IRI。研究發(fā)現(xiàn)mPTP受親環(huán)素蛋白D（CypD）調(diào)控，能夠特異結合CsA，并且發(fā)現(xiàn)CsA能夠有效抑制mPTP開放，對線粒體起到一定的保護作用，IRI的動物模型中起到了保護作用[3]。國內(nèi)對CsA深入研究發(fā)現(xiàn)，CsA的治療作用與其劑量相關，高濃度的CsA反而會抑制線粒體功能，認為5 mg/kg是最適宜的劑量[4]。

2 氧化應激及相應保護措施

在生理情況下，體內(nèi)有少部分的氧參與到氧化反應，產(chǎn)生少量的ROS，但此時人體內(nèi)存在大量抗氧化物質(zhì)，然而當肝細胞發(fā)生缺血再灌注（I/R）時，ROS生成過多以致機體平衡打破。ROS主要來源有：黃嘌呤氧化酶途徑，庫普弗細胞（KCs），中性粒細胞，吞噬細胞，單核細胞，以及有氧呼吸鏈功能障礙等。過量的ROS可造成脂質(zhì)過氧化，DNA氧化及酶變性[5]。除此之外過量的ROS可以使大量的白細胞、免疫細胞、血小板聚集到肝臟的循環(huán)中，致使肝臟發(fā)生微循環(huán)障礙。

抗氧化物、抗氧化能力、抗氧化的信號通路等都是目前研究的方向。Schauer等[6]發(fā)現(xiàn)給予谷胱甘肽（GSH）超過100μmol/（h·kg）時候，對于肝缺血在灌注損傷有相當?shù)谋Ｗo作用。N-乙酰半胱氨酸與親電子的氧化基團直接發(fā)生作用的自由巰基（親核的巰基）而發(fā)揮直接抗氧化作用[7]。Masuda等[8]通過dh404誘導核轉錄因子（Nrf2）對動物進行缺血預處理，證實該通路可以減輕HIRI。Nrf2可以誘導抗氧化蛋白生成，在細胞抗氧化應激的過程中發(fā)揮重要作用，Nrf2誘導物可能成為有潛力的藥物[9]。Yu等[10]研究中發(fā)現(xiàn)通過高壓氧療可以增加細胞的抗氧化能力。

3 鈣超載及相應保護措施

在IRI的病理過程中，由于細胞在缺血缺氧過程中，細胞的生理平衡被打破，細胞能量供給不足，ATP急劇減少，導致能量因依賴的Na+-K+-ATP酶活性降低，細胞內(nèi)Na+增多，細胞通過Na+-Ca2+離子交換彌補離子交換不足，以維持膜電位，導致細胞內(nèi)Ca2+大量增多；此外Ca2+-ATP/Ca2+-Mg2+-ATP酶功能障礙，細胞不能將多余的Ca2+轉運到細胞外，進一步導致了細胞內(nèi)Ca2+的增多。鈣超載可以從多個方面損傷細胞：促使ROS增多、激活炎癥細胞釋放炎癥因子、促進細胞凋亡、破壞細胞膜、干擾線粒體功能等[11]。

Nauta等[12]在動物建立缺血再灌注模型前給予維拉帕米預處理，肝細胞內(nèi)Ca2+的聚集受到明顯抑制。線粒體ATD敏感鉀通道（mitoKATP）和mPTP的差異影響了線粒體內(nèi)Ca2+的平衡，誘導mitoKATP開放使線粒體膜部分去極化和抑制mPTP都可以減少Ca2+內(nèi)流，從而減輕鈣超載[13]。Lv等[14]使用Na+-Ca2+交換抑制劑KB-R7943，發(fā)現(xiàn)該抑制劑可以有效地抑制細胞凋亡，并且可以激活K+-ATP通道，促進K+和Ca2+交換，抑制鈣超載。

4 炎癥細胞激活及相應保護措施

HIRI可激活KCs。激活的KCs主要通過以下途徑發(fā)揮作用：激活的KCs釋放腫瘤壞死因子（TNF-α）及炎癥因子（IL-1、IL-6、IL-12、IL-23）。TNF-α和IL-1增強了細胞內(nèi)黏附因-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達，促進多形核白細胞（PMN）的趨化、黏附和遷移，導致中性粒細胞聚集于肝內(nèi)及血管內(nèi)皮細胞 （EC）損傷，從而引起微循環(huán)障礙，損傷肝組織。不僅如此，激活的KCs以及被趨化、激活的PMN還可以釋放ROS損傷肝組織[15]。PMN通過NADPH途徑產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物，導致肝細胞損傷甚至凋亡；PMN可以釋放彈性蛋白酶、組織蛋白酶等損傷肝組織；在PMN表達的選擇素和整合素，以及EC所表達的ICAM-1、VCAM-1的影響下，PMN和EC之間黏附增強，導致的PMN大量聚集到肝內(nèi)，可使血液黏度增加，阻塞微血管，造成血流阻力增加[16]。

Argenbright等[17]發(fā)現(xiàn)白細胞和內(nèi)皮細胞之間的黏附一定程度上可以被白細胞質(zhì)膜上所表達的CD11/ CD18糖蛋白和內(nèi)皮細胞所表達的ICAM-1調(diào)節(jié)的，使用相應的單克隆抗體可以一定程度上減少細胞間黏附，改善炎性反應和微循環(huán)。Tolba等[18]通過使用選擇性COX-2抑制劑和KCs的抑制物GdCl3在IR前24 h給藥預處理，發(fā)現(xiàn)二者均可以減少TNF-α，保護肝細胞。Kitagawa等[19]對BCAA是否對IRI有保護作用進行了探索性的研究，發(fā)現(xiàn)BCAA可以減輕I/R對肝功能的損傷，減少黏附分子和ET-1的表達，還可以降低門靜脈壓力，減輕PMN黏附，改善肝臟微循環(huán)；同時還單獨分離和培養(yǎng)了KCs用不同劑量的BCAA進行干預，結果顯示IL-1β、IL-6和ET-1均減少，而且與BCAA劑量跟反比。結果支持在圍術期使用BCAA用于治療I/R損傷。

5 炎癥介質(zhì)的作用及相應保護措施

細胞因子在HIRI過程中，發(fā)揮著促炎和抗炎的雙重作用。炎癥因子主要由KCs、PMN、內(nèi)皮細胞及淋巴細胞等產(chǎn)生，包括TNF-α、IL-1、IFN-γ、IL-6、IL-10、HGF、VEGF等。TNF-α可以激活和趨化PMN，可以激活NF-кB、絲裂原活化蛋白激酶，造成細胞凋亡，還可以誘導ROS產(chǎn)物，加重IRI；IL-1作為最主要的促炎癥因子，也可以激活NF-кB和巨噬細胞炎癥蛋白（MIP-2），進一步誘導KCs產(chǎn)生TNF-α等加速炎性反應，并且招募PMN產(chǎn)生更多的ROS和蛋白酶，損傷肝組織；IFN-γ主要是T細胞和NKT細胞產(chǎn)生，其可以誘導誘發(fā)型NO合成酶（iNOS）產(chǎn)生，還可以調(diào)節(jié)PMN的招募和激活，參與到I/R過程，其具體作用與其劑量相關；IL-6一般被認為是促炎因子，其與gp130相結合，可以通過STAT3通路發(fā)揮抗炎作用，可以下調(diào)IL-1和TNF-α的合成，同時還能抑制IFN-γ、GM-CSF及MIP-2，還可以增加GSH的產(chǎn)生，對抗氧化應激所產(chǎn)生的損傷；IL-10作為目前研究較多的抗炎因子，被認為是最重要的抗炎因子，可以抑制炎癥細胞產(chǎn)生細胞因子（如IFN-γ、IL-2），還具有抑制KCs促炎因子的表達、NF-кB的激活以及抑制IL-1、IL6、IL-12、MIP-2等的作用，IL-10是I/R損傷潛在的治療點；VEGF通過絡氨酸激酶途徑發(fā)揮作用，通過上調(diào)TNF-α、IFN-γ及MIP-1等促進炎癥細胞的聚集，導致I/R損傷；HGF可以促進肝細胞的增殖，下調(diào)ICAM-1并抑制PMN聚集發(fā)揮保護作用[15，20]。目前對于細胞因子相關治療的研究不少，比如白介素-1受體拮抗劑（IL-1ra）、TNF-α抑制劑等。

6 核轉錄因子的作用及相應護措施

NF-кB是二聚體，一般是p50和p65。正常KCs中，NF-кB處在未激活狀態(tài)下，與其抑制蛋白I-кB形成的復合物。HIRI時，NF-кB通過多種途徑被激活：NF-кB激活的經(jīng)典途徑，I-кB被其激酶復合物磷酸化，隨后降解；不依耐IKK復合物（I-кB激酶）途徑，I-кBa酪氨酸殘基磷酸化，NF-кB被激活。被激活的NF-кB轉移到細胞核并激活靶基因轉錄，從而參與HIRI。NF-кB通過調(diào)控NOS，細胞因子（TNF-α、IL-1），趨化因子（ENA78），ICAM-1等發(fā)揮效應。Matsui等[21]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，NF-кB的激活與I/R是相關的，并且使用NF-кB抑制物干預缺血再灌注可以有效減輕IRI。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)寡聚脫氧核苷酸（ODNs）通過抑制NF-кB的激活和炎癥介質(zhì)的表達從而達到保護大鼠原位肝移植術后IRI。

7 一氧化氮作用及相應保護措施

NO由血管內(nèi)皮細胞合成，其反應過程由NO合酶（NOS）催化。NOS包括3種形式：神經(jīng)型NO合成酶（nNOS）、iNOS及內(nèi)皮型NO合成酶（eNOS），其在肝內(nèi)存在形式是后2型。NO在HIRI時作用有：阻止體內(nèi)抗氧化劑的減少，減輕氧化應激損傷；對抗內(nèi)皮素（ET）的有害作用；改善微循環(huán)。Peralta等[23]在IRI動物實驗中發(fā)現(xiàn)NO對于肝功能的改善相當明顯同時改善肝血流灌注，還發(fā)現(xiàn)腺苷可以刺激NO產(chǎn)生發(fā)揮IRI保護作用。Lang等[24]在1個小樣本的前瞻性實驗中發(fā)現(xiàn)使用NO吸入劑可以有效地保護肝移植后肝細胞，加速移植后肝功能的恢復，縮短患者住院時間。

8 熱休克蛋白的作用及相應保護措施

血紅素氧化酶（HO）是血紅素分解代謝過程中的限速酶，分為3種類型：誘導型（HO-1）、組成型（HO-2）及發(fā)現(xiàn)不久的HO-3。目前研究較多的是HO-1，也稱熱休克蛋白32（HSP32），可以通過激活Nrf2達到抗氧化作用，其分解的產(chǎn)物膽綠素也具有抗氧化作用。有研究表明HO-1含量增加，可以使增加細胞外SOD和H2O2酶含量，使用HO-1拮抗劑可以使SOD和H2O2含量下降；HO-1還可以抗細胞凋亡，主要通過抗凋亡通路bcl-2和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶來達到細胞保護的作用；HO-1分解血紅素所產(chǎn)生的CO能保護EC，舒張血管平滑肌及抗血小板聚集改善微循環(huán)；另外HSP70也可以通過激活Nrf2通路參與HIRI保護[25-26]。

9 展 望

總結目前研究所知，可以從多個時間點對IRI進行干預：缺血預處理，缺血中處理，缺血后處理；也可以從多個方面對IRI進行干預：抗氧化應激、抗炎癥因子、抑制細胞因子、改善微循環(huán)、改善能量代謝、調(diào)節(jié)信號通路等；研究過程中還有多種方法：常見藥物、單克隆抗體、信號通路抑制劑、細胞因子拮抗劑、基因敲除、RNA干擾等。這些思路和方法大多數(shù)還在科學研究階段，但是已初見成效，在不斷研究HIRI機制的同時進一步提出更多、更好的保護方法，保證其能有效的、安全的用于臨床是未來將要完成的工作。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.023

:A

:1009-5519（2015）12-1821-03

2015-03-14）

彭方毅（1987-），男，四川瀘州人，在讀碩士研究生，主要從事肝膽外科臨床和科研工作；E-mail：494653428@qq.com。

李波（E-mail：liboer2002@126.com）。