凝血酶在腦卒中保護(hù)作用的研究進(jìn)展

陳 麗綜述，何曉英審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州646000）

凝血酶在腦卒中保護(hù)作用的研究進(jìn)展

陳 麗綜述，何曉英審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州646000）

凝血酶；卒中；神經(jīng)再生；腦/血液供給；綜述

腦卒中是一組突然起病，是以局灶性神經(jīng)功能缺失為共同特征的急性腦血管疾病，包括腦出血、腦梗死及蛛網(wǎng)膜下腦出血。中國腦卒中發(fā)病率排名世界第一，比美國高1倍，腦卒中已成為中國第1位死因。腦卒中除了高致死率外，還具有高致殘率，全國存活的腦卒中患者中有3/4患有不同程度的殘疾，且呈年輕化趨勢，使正值盛年的殘疾人給家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會問題。但是腦卒中病理機(jī)制復(fù)雜，治療效果仍不容樂觀，積極尋找有效措施減輕腦卒中造成的神經(jīng)功能缺失、降致殘率，是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)研究的重要課題。

1 凝血酶結(jié)構(gòu)

人體凝血酶由輕鏈A和重鏈B構(gòu)成，其中A鏈主要作用是穩(wěn)定凝血酶的整體結(jié)構(gòu)。B鏈結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，主要包括以下3個(gè)位點(diǎn)。（1）精氨酸側(cè)鏈口袋：催化位點(diǎn)，主要由Asp102、His47和Set195構(gòu)成；（2）非極性結(jié)合位點(diǎn)：可與底物發(fā)生疏水作用；（3）陰離子結(jié)合位點(diǎn)：由B鏈中的6個(gè)Lys構(gòu)成，包括：LysB21、B52、B65、B106、B107、B154，可與血小板受體相互作用，另外B鏈內(nèi)有3個(gè)二硫鍵（Cys42-Cys58、Cys168-Cys182、Cys191-Cys220），具有穩(wěn)定凝血酶結(jié)構(gòu)的作用。

2 凝血酶生物特性

不管是正常生理還是在病理狀態(tài)下，凝血酶都發(fā)揮著重要的作用[1]。主要包括：（1）激活凝血因子，促進(jìn)血小板聚集及加快纖維蛋白的形成；（2）趨化并促進(jìn)炎性細(xì)胞到達(dá)損傷部位及分泌炎癥介質(zhì)，增強(qiáng)NK細(xì)胞的溶解及殺傷能力；（3）增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞合成能力，加快細(xì)胞因子釋放及血管的通透性；（4）促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞的增殖；（5）可調(diào)節(jié)神經(jīng)起源細(xì)胞的生長分化及死亡、血管新生、神經(jīng)保護(hù)、影響疼痛信號的傳遞、骨的形成。

3 凝血酶受體（TR）

TR經(jīng)水解后生成蛋白酶活化受體（PARs），由425個(gè)氨基酸構(gòu)成，為經(jīng)典的7次穿膜G蛋白偶聯(lián)受體，與凝血酶結(jié)合后可切斷PAR胞外N-端Arg41-Ser42間的肽鍵，激活G蛋白，從而將信號傳到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞變化。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，凝血酶受體活化后產(chǎn)生的細(xì)胞信號更為廣泛，機(jī)制更加復(fù)雜。目前，已有4種PAR的cDNA被克隆，PAR1、PAR2、PAR3基因定位于5q13，PAR4基因定位于19p12。在神經(jīng)系統(tǒng)以PAR1介導(dǎo)細(xì)胞信號作用最為顯著[2]。腦卒中后TR被激活，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)具體包括肌醇1、三磷酸肌醇（IP3）、甘油二酯（DAG）、Ca2+、蛋白磷酸化、腺苷酸環(huán)化酶等發(fā)生改變，將細(xì)胞外信號傳入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)甚至神經(jīng)毒性作用[3]。

4 凝血酶在神經(jīng)中樞的產(chǎn)生、作用特點(diǎn)及清除

腦出血后凝血酶的數(shù)量明顯增加，主要由腦出血后血腫組織團(tuán)塊產(chǎn)生，此外也有一部分來自血液及受損傷的腦組織本身。凝血酶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有兩面性，既可加重腦細(xì)胞水腫，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，又可提高神經(jīng)細(xì)胞耐受能力，免受外界損傷，主要取決于受體的活化率和第二信號的清除之間的比例，低濃度（＜50 nmol/L）活化的凝血酶可不斷失活，不斷降解，使凝血酶還未發(fā)揮細(xì)胞毒性，就已經(jīng)被消除。反之，高濃度（≥50 nmol/L）時(shí)將加重腦水腫、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)及誘發(fā)癲癇等神經(jīng)毒性作用。腦卒中后，受損傷的腦組織缺血、缺氧，新陳代謝減慢，加之腦脊液循環(huán)本身就較緩慢，故凝血酶在腦組織中的清除緩慢，其作用效應(yīng)也將較其他部位延長。

5 凝血酶促進(jìn)神經(jīng)突觸可塑性

神經(jīng)細(xì)胞之間信息傳遞功能的特殊接觸部位叫神經(jīng)突觸，與大腦的神經(jīng)沖動(dòng)、學(xué)習(xí)、記憶有密切關(guān)系。腦卒中后神經(jīng)突觸遭到破壞，凝血酶通過直接或間接激活PAR1，參加突觸傳遞和可塑性恢復(fù)。Stein等[4]在急性腦缺血的C57BL/6小鼠中，測得細(xì)胞外LTP，指給突觸前纖維一個(gè)短暫的高頻刺激后，突觸傳遞效率和強(qiáng)度增加幾倍且能持續(xù)數(shù)小時(shí)至幾天保持這種增強(qiáng)的現(xiàn)象）明顯增強(qiáng)，且N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）也明顯增多，且使用凝血酶抑制劑或PAR1抑制劑可阻礙上述物質(zhì)的變化。Shimon等[5]在總結(jié)凝血酶可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性來影響神經(jīng)功能恢復(fù)中，指出凝血酶調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸是通過激活PAR1來完成的。Becker等[6]研究表明，在去神經(jīng)的小鼠齒狀顆粒細(xì)胞中，通過PAR1激活門冬氨酸受體使突觸可塑性改變。具體機(jī)制如下：腦卒中后，凝血酶活性增強(qiáng)，激活PAR1，NMDA通道復(fù)合體激活，LTP增強(qiáng)，使突觸傳遞效率增強(qiáng)，加快神經(jīng)突觸可塑性功能恢復(fù)，提高記憶及學(xué)習(xí)能力。

6 凝血酶促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生

神經(jīng)元細(xì)胞屬于永久性細(xì)胞，無再生能力，但Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，存在于腦室下帶、海馬齒狀回、成年哺乳動(dòng)物的皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)祖細(xì)胞存在再生的潛能，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)凝血酶能促進(jìn)DCX（神經(jīng)元前體細(xì)胞移行過程中表達(dá)的一種微管結(jié)合蛋白），應(yīng)用水蛭素后該物質(zhì)明顯減少。d′Audigier等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在凝血酶及其受體可刺激內(nèi)皮前體細(xì)胞的分化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Liu等[9]在脊髓損傷模型中，通過免疫印跡分析和免疫組織化學(xué)染色方法，證明Ras/Raf/ERK1/2（細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶）傳導(dǎo)途徑參加了神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)。Sayyah等[10]在人類1 321 n1膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，凝血酶可通過激活Rap1/β1整合素傳導(dǎo)途徑，激活下游RhoA介導(dǎo)和磷脂酶D，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。凝血酶促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生可能機(jī)制：（1）凝血酶通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白使Raf活化形成Ras-GTP，與激活的PKC和Raf共同激活ERK1/2，使細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和（或）P70核蛋白體S6激酶數(shù)量增多，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生。（2）血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）：腦神經(jīng)細(xì)胞再生與血管再生緊密聯(lián)系，VEGF為一種特異性內(nèi)皮細(xì)胞絲裂原，凝血酶通過刺激細(xì)胞分泌VEGF，為神經(jīng)細(xì)胞再生提供條件。

7 凝血酶促進(jìn)腦血管再生

血管新生主要指在原有的毛細(xì)血管與微靜脈基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生（或稱套迭）的形式生成新的毛細(xì)血管，主要包括：血管生成因子釋放，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和浸潤；血管結(jié)構(gòu)的修整、改建。Tsopanoglou等[11]在雞尿囊絨膜（CAM）系統(tǒng)和基質(zhì)膠系統(tǒng)證實(shí)凝血酶具有促進(jìn)血管新生。主要通過兩條途徑促進(jìn)血管新生：（1）凝血非依賴途徑，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，如缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、VEGF、促血管生成素-1（Ang-1）、Ang-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9等，促進(jìn)血管新生；（2）凝血依賴途徑，通過纖維蛋白產(chǎn)生，促進(jìn)腦血管新生。

7.1 凝血非依賴途徑

7.1.1 凝血酶與HIF-1α HIF-1α在缺血缺氧條件下增多，常氧條件下幾乎不被檢測到，但凝血酶在常氧條件下就能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)[12]。凝血酶促進(jìn)血管新生的可能機(jī)制是凝血酶受體活化后，通過增加HIF-1α蛋白的翻譯或抑制蛋白降解，使細(xì)胞中的HIF-1α蛋白水平升高，也可調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)依賴G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）促進(jìn)血管新生。

7.1.2 凝血酶與VEGF VEGF與其受體（VEGFR-1、VEGFR-2）在血管新生過程中有重要的作用。Wang等[13]將人類臍平滑肌細(xì)胞（HUASMC）暴露于凝血酶10 U/mL中，12 d后研究結(jié)果顯示，凝血酶顯著增加了HUASMC增殖（n=11，P=0.002）和 VEGF mRNA表達(dá)（n=4，P= 0.024）。凝血酶促進(jìn)VEGF釋放機(jī)制：凝血酶與其受體PAR結(jié)合活化細(xì)胞內(nèi)p42/p44 MAPK，使轉(zhuǎn)錄因子SP1 Thr453和Thr739磷酸化，活化的SP1與活化蛋白-2（AP-2）形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，結(jié)合于VEGF啟動(dòng)子（-88、-66）GC富含區(qū)，促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄，加快血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成。最近研究表明，血小板活化后，通過激活PAR1、PAR4，不僅可使VEGF增多促進(jìn)血管新生，也能增加內(nèi)皮抑素的釋放抑制血管生成，但VEGF的釋放占主導(dǎo)地位，從而促進(jìn)血管生成[14]。

7.1.3 凝血酶與Ang-1、Ang-2 Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)血管形成，主要通過激活或阻礙內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體（Tie2）。凝血酶活化后仍可通過激活PAR1使Ang-2基因的轉(zhuǎn)錄增多，也可促進(jìn)Ang-1誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管生成。凝血因子Ⅹa可以通過不經(jīng)典的途徑激活PAR3受體，活化Tie2，調(diào)節(jié)血管生成及穩(wěn)定血管的完整性[15]。

7.1.4 凝血酶與整合素 整合素αVβ3表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，其表達(dá)被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的標(biāo)志。凝血酶通過增加整合素αVβ3 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，使整合素αVβ3明顯增多，加快內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移、存活[16]。凝血酶的RGD序列起著不可替代的作用。

7.1.5 凝血酶與MMP MMP在體內(nèi)主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。主要通過4個(gè)方面促進(jìn)血管新生：（1）降解血管基底膜及周圍的ECM，使血管新生的出芽和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；（2）釋放調(diào)控血管新生的細(xì)胞因子；（3）暴露ECM與integrin結(jié)合的位點(diǎn)；（4）分離細(xì)胞間的黏附。腦卒中后，凝血酶通過增加MMP-1、MMP-2的蛋白表達(dá)，使緊密聯(lián)系的內(nèi)皮細(xì)胞相互分離且分泌相關(guān)細(xì)胞因子，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞能力遷移。Machida等[17]發(fā)現(xiàn)，腦出血后凝血酶活化后通過PAR1受體使大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞釋放MMP9，其中以周細(xì)胞釋放最多。

7.2 凝血依賴途徑 此途徑主要研究集中于腫瘤血管新生方面的研究，主要是通過凝血酶裂解纖維蛋白原進(jìn)而形成纖維蛋白，也可誘導(dǎo)相關(guān)因子的釋放，促進(jìn)血管新生。

7.3 凝血酶與Na+/Ca2+交換體（NCX） Andrikopoulos等[18]發(fā)現(xiàn)，在人血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中，NCX參與凝血酶促進(jìn)血管新生過程。具體機(jī)制：凝血酶活性增強(qiáng)，通過NCX使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+增多，NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（ROS），進(jìn)一步促進(jìn)PAR1及ERK1/2的活化，使用抑制劑SEA0400或NCX1 siRNA均將使ERK1/2的磷酸化減弱，新生血管減少。

8 凝血酶提高神經(jīng)元耐受能力

8.1 凝血酶提高神經(jīng)元耐受能力主要表現(xiàn) 低濃度（50 pmol/L～50 nmol/L）凝血酶不僅不會損傷神經(jīng)細(xì)胞，反而可增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞在低血糖、缺氧、缺血、外界損傷等情況下的耐受能力，使神經(jīng)細(xì)胞存活，保證其正常功能。凝血酶還可以加快神經(jīng)生長因子的合成及分泌，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)，不僅如此，小劑量凝血酶預(yù)處理腦出血大鼠后可減輕之后較大劑量凝血酶引起的腦水腫。Wang等[19]將PAR1基因敲除后可明顯加重腦水腫及神經(jīng)元的死亡及行為障礙。激活內(nèi)源性蛋白質(zhì)C使用凝血酶突變W215A/E217A治療缺血性卒中可以提高神經(jīng)元的存活和減少腦梗死灶，與組織纖溶酶原激活物治療腦梗死相比，可大大減少出血風(fēng)險(xiǎn)[20]。

8.2 凝血酶提高神經(jīng)元耐受能力可能機(jī)制 （1）與凝血酶受體PAR1活化有關(guān)，預(yù)先激活PAR1，可刺激新蛋白質(zhì)合成，并與凝血酶受體mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，從而產(chǎn)生保護(hù)作用；（2）促進(jìn)熱休克蛋白（heatshock protein，HSP）激活，TPC通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活HSP 27，使腦細(xì)胞耐受性增加，減輕細(xì)胞腫脹及減少凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)元；（3）PAI-1增多，PAI-1屬于體內(nèi)凝血酶抑制物，凝血酶促進(jìn)PAI-1 mRNA增加，及PAI-1蛋白水平的增加，減少由于腦卒中生成大量凝血酶毒性作用，從保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損害。

近年來，凝血酶的腦保護(hù)作用已引起人們的廣泛關(guān)注，但其具體機(jī)制仍在研究中，能否在凝血酶的神經(jīng)毒性作用與神經(jīng)保護(hù)作用找到平衡，是作者奮斗的目標(biāo)。合理地調(diào)節(jié)凝血酶的水平，盡可能地減少腦損傷，加快腦康復(fù)提供理論依據(jù)，為臨床治療提供新的觀念和思路。

[1]Archiniegas E，Neves CY，Candelle D，et al.Thrombin and its proteaseactivated receptor-1（PAR1）participate in the endothelial-mesenchymal transdifferentiation process[J].DNA Cell Biol，2004，23（12）：815-825.

[2]Ayala YM，Cantwell AM，Rose T，et al.Molecular mapping of thrombinreceptor interactions[J].Proteins，2001，45（2）：107-116.

[3]Canobbio I，Cipolla L，Guidetti GF，et al.The focal adhesion kinase Pyk2 links Ca2+signaling to Src family kinase activation and protein tyrosine phosphorylation in thrombin-stimulated platelets[J].Biochem，2015-05-13 [2015-05-30].http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=The+focal+ adhesion+kinase+Pyk2+links+Ca2%2B+signaling+to+Src+family+kinase +activation+and+protein+tyrosine+phosphorylation+in+thrombin-stimulated.

[4]Stein ES，Itsekson-Hayosh Z，Aronovich A，et al.Thrombin induces ischemic LTP（iLTP）：implications for synaptic plasticity in the acute phase of ischemic stroke[J].Sci Rep，2015，21（5）：7912.

[5]Shimon BM，Lenz M，Ikenberg B，et al.Thrombin regulation of synaptic transmission and plasticity：implications for health and dise[J].Front Cell Neurosci，2015，21（9）：151.

[6]Becker D，Ikenberg B，Schiener S，et al NMDA-receptor inhibition restores Protease-Activated Receptor 1（PAR1）mediated alterations in homeostatic synaptic plasticity of denervated mouse dentate granule cells[J].Neuropharmacology，2014，86：212-218.

[7]Yang S，Song S，Hua Y，Nakamura T，et al.Effects of thrombin on neurogenesis after intracerebral hemorrhage[J].Stroke，2008，39（7）：2079-2084.

[8]d′Audigier C，Cochain C，Rossi E，et al.Thrombin receptor PAR-1 activation on endothelial progenitor cells enhances chemotaxis-associated genes expression and leukocyte recruitment by a COX-2-dependent mechanism[J].Angiogenesis，2015，18（3）：347-359.

[9]Liu T，Cao FJ，Xu DD，et al.Upregulated Ras/Raf/ERK1/2 signaling pathway：a new hope in the repair of spinal cord injury[J].Neural Regen Res，2015，10（5）：792-796.

[10]Sayyah J，Bartakova A，Nogal N，et al.The Ras-related protein，Rap1A，mediates thrombin-stimulated，integrin-dependent glioblastoma cell proliferation and tumor growth[J].Biol Chem，2014，289（25）：17689-17698.

[11]Tsopanoglou NE，Pipili-Synetos E，Maragoudakis ME，et al.Thrombin promotes angiogenesis by a mechanism independent of fibrin formation[J]. Am J Physiol，1993，264（5 Pt 1）：C1302-1307.

[12]Zhou HJ，Tang T，Cui HJ，et al.Thrombin-triggered angiogenesis in rat brains following experimental intracerebral hemorrhage[J].Neurosurg，2012，117（5）：920-928.

[13]Wang B，Pearson T，Manning G，et al.In vitro study of thrombin on tubule formation and regulators of angiogenesis[J].Clin Appl Thromb Hemost，2010，16（6）：674-678.

[14]Etulain J，Mena HA，Negrotto S，et al.Schattner M Stimulation of PAR-1 or PAR-4 promotes similar pattern of VEGF and endostatin release and pro-angiogenic responses mediated by human platelets[J].Platelets，2015，17：1-6.

[15]Stavenuiter F，Mosnier LO.Noncanonical PAR3 activation by factor Xa identifies a novel pathway for Tie2 activation and stabilization of vascular integrity[J].Blood，2014，124（23）：3480-3489.

[16]Tsopanoglou NE，Andriopoulou，Maragoudakis ME，et al.On the mechanism of thrombin-induced angiogenesis：involvement of alphavbeta3-integrin[J].Am J Physiol Cell Physiol，2002，283（5）：C1501-1510.

[17]Machida T，Takata F，Matsumoto J，et al.Brain pericytes are the most thrombin-sensitive matrix metalloproteinase-9-releasing cell type constituting the blood-brain barrier in vitro[J].Neurosci Lett，2015，599：109-114.

[18]Andrikopoulos P，Kieswich J，Harwood SM，et al.Endothelial angiogenesis and barrier function in response to thrombin requires Ca2+influx through the Na+/Ca2+exchanger[J].Biol Chem，2015-04-14[2015-05-12].http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Endothelial+angiogenesis+and+ barrier+function+in+response+to+thrombin+requires+Ca2%2B+influx+ through+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger.

[19]Wang J，Jin H，Hua Y，et al.Role of protease-activated receptor-1 in brain injury after experimental global cerebral ischemia[J].Stroke，2012，43（9）：2476-2482.

[20]Berny-Lang MA，Hurst S，Tucker EI，et al.Thrombin mutant W215A/E217A treatment improves neurological outcome and reduces cerebral infarct size in a mouse model of ischemic stroke[J].Stroke，2011，42（6）：1736-1741.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.021

A

1009-5519（2015）16-2468-03

2015-05-04）

陳麗（1989-），女，重慶忠縣人，碩士研究生，主要從事腦血管方向的研究；E-mail：1156506016@qq.com。

何曉英（E-mail：102050228@qq.com）。