大鼠彌漫性軸索損傷后海馬CA1區(qū)錐體神經元電活動變化

段吉強，宋錦寧，郝璞珩，馬旭東，李丹東，趙永林，郭小葉，趙君杰

(1.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科，陜西西安 710061；2.渭南市中心醫(yī)院神經外科，陜西渭南 714000)

◇專題研究◇

大鼠彌漫性軸索損傷后海馬CA1區(qū)錐體神經元電活動變化

段吉強1,2，宋錦寧1，郝璞珩1，馬旭東1，李丹東1，趙永林1，郭小葉1，趙君杰1

(1.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科，陜西西安 710061；2.渭南市中心醫(yī)院神經外科，陜西渭南 714000)

目的 觀察彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)后大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞自發(fā)放電的特征，揭示DAI對大鼠海馬CAl區(qū)錐體神經元興奮性的影響。方法 雄性健康成年SD大鼠30只，隨機分為正常對照組及DAI后6 h組、12 h組、24 h組、72 h組。采用玻璃微電極細胞外記錄的方法記錄海馬神經元的放電活動，每只動物記錄2個單位放電。分析比較各組各個單位放電的放電類型、放電頻率等差異。結果 ①DAI后各組與正常組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞觀察到3種類型放電，即不規(guī)則放電、規(guī)則放電和簇式放電。在放電類型上各組差異無統(tǒng)計學意義。②比較各組的12個單位放電的平均放電頻率、平均ISI可得出DAI后12 h組的平均放電頻率低于其他組，差異有統(tǒng)計學意義；其他組比較差異則無統(tǒng)計學意義。③比較各組簇式放電的簇內ISI：DAI后12 h組最小，其次是24 h組、72 h 組，6 h組與正常組最大且差異無統(tǒng)計學意義。結論 DAI對大鼠海馬CAl區(qū)錐體神經元興奮性具有明顯影響，并且呈不同放電類型的動態(tài)變化。

顱腦損傷；彌漫性軸索損傷；簇式放電；細胞外放電；椎體神經元

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)在原發(fā)性顱腦損傷中很常見，主要特征為胼胝體、腦干等部位的局灶性病變以及腦白質廣泛性的軸索損傷，患者通常表現(xiàn)為傷情危重，治療困難，預后差[1]。但DAI后的病理機制目前仍然不十分清楚。近年來，人們開始關注腦外傷后中樞神經系統(tǒng)突觸電活動，研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷改變了海馬局部存活的神經元的興奮性和抑制性神經遞質的細微平衡，破壞了突觸電位的正常功能[2]，創(chuàng)傷可以極大增加興奮性和抑制性突觸活動，損傷的一小部分神經元細胞產生動作電位，這些動作電位傳播開去導致未損傷區(qū)神經元發(fā)生高波幅放電。因此，機械性腦損傷立即導致超出損傷部位的組織功能改變[3]。在通常條件下海馬CA1的錐體細胞都是規(guī)律放電細胞[4]，但在創(chuàng)傷狀態(tài)下卻被轉變?yōu)榧ぐl(fā)放電細胞，微電極記錄的放電形式主要為簇式(爆發(fā)式)放電。研究證明在離體狀態(tài)下，全細胞膜片鉗記錄分析簇式放電的離子流本質為Ni2+敏感性Ca2+電流的增加，T型鈣電流濃度對神經元放電模式改變起重要作用[5]。目前，研究還主要集中在離體模式下對腦片或原代培養(yǎng)神經元細胞進行膜片鉗研究，而本實驗擬研究在體情況下DAI損傷后海馬CA1錐體細胞電生理變化情況，以揭示DAI對大鼠海馬CAl區(qū)錐體神經元興奮性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康成年SD大鼠30只，體質量220～280 g之間。在標準環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水，飼養(yǎng)1周后進行實驗。分組：動物編號后，采用隨機數(shù)字表法進行隨機分組，共分為5組：正常對照組及DAI后6 h 組、12 h組、24 h組、72 h組，每組6只。所用動物均購于西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 動物模型的建立 采用劉曉斌等[6]的大鼠頭顱瞬間旋轉損傷裝置，制作大鼠頭顱DAI模型。模型建立后驗證DAI模型是否成功：選取DAI后24 h組和正常組行腦組織石蠟切片鍍銀染色，光鏡下觀察神經軸突形態(tài)并進行比對。

1.3 麻醉、手術和生命體征監(jiān)測 采用1 g/kg的250 g/L烏拉坦進行腹腔麻醉。麻醉滿意后頭頂部剪毛(剔除范圍大于前后囟)，將大鼠仰臥位固定于木板上，行氣管插管和頸靜脈插管。頸靜脈插管接含100 g/L苯巴比妥鈉溶液的注射器，為減少動物活動對記錄電極的影響，可根據(jù)麻醉深度酌情加量5 mg/(kg·h)。將大鼠俯臥位放置于大鼠腦立體定位儀上，下墊體溫毯(調至恒溫37 ℃)，整個實驗過程中監(jiān)測大鼠的直腸溫度，維持在(37±0.5)℃。

1.4 記錄海馬神經元放電 采用玻璃微電極細胞外記錄的方法記錄海馬神經元的放電活動，電極尖端直徑1～2 μm，阻抗10～20 MΩ，電極充灌含0.5 mmol/L氯化鈉溶液。確定海馬CA1區(qū)的位置為前囟后3.0～4.5 mm，中線旁開2 mm，腦組織表面下2～3.2 mm。微電極推進器將玻璃微電極尖端對準骨窗緩慢向下降，當電極尖端接觸腦表面，推進器深度值歸零，當深度值顯示為2 mm時以10 μm每脈沖的速度向下尋找神經元放電；當出現(xiàn)放電時，上下微調深度值，當調整的放電幅值較大時，固定深度值，觀察2～3 min，如放電較穩(wěn)定，開始記錄神經元放電，持續(xù)20 min。同樣方法記錄第2個放電。放電記錄完畢后，將玻璃微電極退出。將微量注射器(吸入2 g/L滂胺天藍溶液約0.15 mL)接在微電極推進器上，下降至原玻璃微電極的深度值，推注注射器內滂胺天藍，推注完后停留約3 min，再將注射器退出。觀察和分析30只大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經元放電，每只大鼠記錄了2個神經元放電，總共是60個神經元放電(單位放電)。每個神經元放電記錄時間為20 min，用Clampfit 10.0軟件檢測出放電峰的瞬時頻率(instant frequency, IF)和峰峰時間間隔(interspike interval, ISI)，計算出各組神經元平均放電瞬時頻率(mean of IF, MIF)、平均放電峰峰時間間隔(mean of ISI, MISI)，統(tǒng)計各組各個單位神經元放電的ISI。

1.5 標本取材及處理 放電實驗記錄結束后，對電極尖端位置進行組織學鑒定。用300 mL、37 ℃的生理鹽水對大鼠進行左心室灌流，直至大鼠眼球顏色發(fā)白，換成40 g/L多聚甲醛溶液300 mL灌注，灌注時間大于30 min。灌注成功后斷頭開顱取腦，以記錄點為中心，在其前后2 mm處以冠狀面切除兩端，保留中間部分。取腦后固定4 h，再置于200 g/L蔗糖溶液中過夜，待組織塊沉底或懸浮狀態(tài)時，行連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚40 μm，進行尼氏(Nissl)染色，以確定記錄點的位置。當標識點在海馬CA1區(qū)錐體層時將數(shù)據(jù)保留，否則補做該組數(shù)據(jù)。CA1區(qū)位置的確定根據(jù)Paxinos編寫的《大鼠腦立體定位圖譜》給定的坐標標注。CA1區(qū)的位置為前囟后3.0～4.5 mm，中線旁開2 mm，腦組織表面下2～3.2 mm。

2 結 果

2.1 大鼠的一般情況 DAI后大鼠均出現(xiàn)不同程度的原發(fā)性昏迷，表現(xiàn)為自主活動消失、刺痛反應差或無、瞳孔對光反應減弱，持續(xù)時間1 min～1 h不等?；杳郧逍押?自主復正體位、瞳孔對光反應恢復、刺痛反應恢復)表現(xiàn)為：不同程度的反應性下降，四肢活動遲緩、行走不穩(wěn)，持續(xù)1～2 h。正常組大鼠麻醉清醒后，生命體征正常，四肢活動敏捷，出現(xiàn)探索表現(xiàn)。

2.2 腦組織標本的病理學觀察 選取DAI后24 h組和正常組海馬上部大腦皮質區(qū)腦組織行石蠟切片鍍銀染色，光鏡下觀察神經軸突形態(tài)：正常組大鼠神經元胞膜染色適中，軸突形態(tài)完整、伸直；DAI后24 h可見神經元細胞膜固縮深染，神經軸突呈分段狀，“軸索球”形成，軸索球之間軸突直徑變小，甚至斷裂。

2.3 各組的MIF及MISI的比較 正常組的MIF高于DAI后各組。正常組與DAI后12 h組MIF差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與DAI后其他時間組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DAI后各組間MIF比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

正常組MISI低于DAI后各組。正常組與DAI后12 h組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；正常組與其他DAI組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DAI各組間進行MISI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

2.4 各組放電的類型 共觀察到海馬CA1區(qū)錐體層神經元自發(fā)放電的類型主要有3種特征：分別為不規(guī)則放電、單波規(guī)則放電和簇式放電型。

不規(guī)則放電：放電信號單位出現(xiàn)的頻率及放電ISI不是很穩(wěn)定，單個發(fā)放與陣發(fā)夾雜進行；ISI的頻數(shù)分布較分散，各組段頻數(shù)無集中趨勢(圖1)。

表1 各組平均放電頻率(MIF)及平均放電峰峰間期(MISI)

Tab.1 Mean interspike frequency and mean of interspike interval in each group

組別神經元數(shù)量MIF(Hz)MISI(ms)正常組1267.64±14.08182.44±68.31DAI后6h1239.73±9.37278.33±75.64DAI后12h1225.28±5.90*430.81±120.24*DAI后24h1242.64±11.59263.19±121.86DAI后72h1236.60±8.30213.25±99.68

與正常組比較，*P<0.05。

圖1 神經元不規(guī)則放電

Fig.1 Irregular discharge of neurons

A：玻璃微電極細胞外記錄的海馬神經元放電活動；B：神經元規(guī)則放電峰峰時間間隔(ISI)頻數(shù)分布(組距=10 ms)。

單波規(guī)則放電：放電信號單位出現(xiàn)的頻率、幅度及放電ISI都比較穩(wěn)定，ISI的頻數(shù)分布較集中，大致呈鐘形分布，ISI平均值為186.56 ms，標準差為68.04 ms(圖2)。

神經元簇式放電：發(fā)放特點有明顯的周期性且呈簇式發(fā)放，每串的放電為2～20個波形，不同神經元簇出現(xiàn)的周期不盡相同，從幾十微秒到數(shù)秒不等，每個周期內可明顯地區(qū)分放電期和靜息期，放電期的總脈沖數(shù)沒有一定規(guī)律。簇式放電的ISI的頻數(shù)分布較分散，ISI主要集中于0～50 ms，另外在500～2 500 ms區(qū)間大致呈鐘形分布(圖3)。

2.5 各組大鼠神經元放電類型構成比 正常組、DAI后6 h組、12 h組、24 h組、72 h組神經元放電表現(xiàn)均為3種放電類型，實驗各組放電類型構成比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

圖2 神經元規(guī)則放電

Fig.2 Regular discharge of neurons

A：玻璃微電極細胞外記錄的海馬神經元放電活動；B：神經元規(guī)則放電峰峰時間間隔(ISI)頻數(shù)分布(組距=10 ms)。

圖3 神經元簇式放電

Fig.3 Burst discharge of neurons

A：玻璃微電極細胞外記錄的海馬神經元放電活動；B：神經元簇式放電峰峰時間間隔(ISI)頻數(shù)分布(組距=10 ms)。

2.6 各組簇式放電的形式及簇內ISI的平均值比較 各組簇內ISI均值單因素方差分析兩兩比較的結果為：DAI后12 h組、24 h組、72 h組與正常組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DAI后6 h組、72 h組與DAI后12 h組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表2 各組大鼠神經元放電形式構成比較

Tab.2 Constituent ratio of rat neuron discharge types in each group

[n(%)]

表3 各組簇內峰峰時間間隔(ISI)均值統(tǒng)計

Tab.3 Mean interspike interval (ISI) of burst discharge in each group

組別總簇數(shù)(n)各組簇內ISI正常組71360.59±18.32DAI后6h組48758.57±22.67DAI后12h組36318.89±5.79*#△DAI后24h組24126.21±15.07*DAI后72h組37633.00±9.23*

與正常組比較，*P<0.05；與DAI后6 h組比較，#P<0.05；與DAI后72 h組比較，△P<0.05。

3 討 論

神經元的自發(fā)簇式放電是神經通訊的一種形式，它的簇周期、頻率，簇內頻率及簇內放電串數(shù)都是通訊的編碼信號，其中一個重要方面就是時間編碼，時間參數(shù)運載著豐富的傳遞信息，這種信息傳遞可能由ISI的尺度變化而表達。對培養(yǎng)的神經元進行電生理研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，突觸連接不斷增加，神經元網(wǎng)絡逐漸復雜和成熟，其自發(fā)放電的模式由零星、孤立的形式向簇式放電并進而向更復雜的交替模式轉化。神經元之間建立的廣泛突觸聯(lián)系并通過這些聯(lián)系進行化學和電信息交流，這可促進自發(fā)簇式放電活動的活躍，而簇式放電的活躍能反過來加強突觸連接，促進神經元之間的信息傳遞[7]。

簇式放電發(fā)生需同時滿足2個條件：一是足夠水平的興奮性，二是發(fā)放之前的一段時間靜息。本實驗中觀察到DAI后12 h組的各個單位放電的平均放電頻率增加，分析其原因，由于DAI后12 h不僅神經元的興奮性增加，而且軸突損傷可激活Ca2+濃度快速升高，造成突觸前膜去極化，當沖動傳入時，突觸前膜釋放神經遞質減少，這樣突觸后神經元將有一段時間靜息，這兩方面作用的結果導致了DAI后12 h組簇式放電增多。另外，損傷神經產生自發(fā)放電模式改變的原因也可能與損傷區(qū)中終球膜離子通透性發(fā)生了變化有關，因為DAI后其離子通道數(shù)量、類型均與正常軸突有很大差異。

有關DAI后自發(fā)簇式放電降低的機制，本研究發(fā)現(xiàn)DAI后12 h組大鼠的海馬CA1區(qū)錐體層神經元的放電頻率低于其他各組，分析其原因，可能與下列因素有關：①由于DAI后12 h可見腦干、大腦皮髓質交界區(qū)、胼胝體等部位軸突腫脹、斷裂，軸索球形成[6]，雖沒有直接證據(jù)表明perforant投射纖維損傷，但我們的前期研究[8]證實，DAI后腦組織中微血管有微血栓形成，從病理學角度分析，腦微血管堵塞是腦損傷后主要病理學改變之一，這種微循環(huán)障礙造成的腦缺血可導致繼發(fā)性神經組織損害[9]；另外，海馬結構為脈絡膜前動脈終末血管供血[10]，極易引起缺血損傷。故推測這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與perforant通路的損傷，海馬門部傳入的刺激信號到達CA1區(qū)減少有關。②DAI損傷后軸突Ca2+濃度快速升高，延長了神經元的不應期使興奮性降低。③schaffer側支也可傳遞海馬門部的信號跨過CA3區(qū)到CA1區(qū)。ABEGG等[3]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的海馬腦片中將CA3區(qū)錐體細胞成熟的軸突被切斷后，又會生成新的軸突側枝，這提示機械損傷有可能誘導CAI區(qū)schaffer側支軸突側支的產生，有更多的側支與CAl的神經元形成更多的突觸聯(lián)系。④谷氨酸能使突觸前結構發(fā)生改變[11]。這種改變使得與CA1區(qū)神經元相接的突觸前膜因興奮性毒性作用暫時或永久失去了信號傳遞的能力。但是，這還需要進一步實驗，研究其是否會影響突觸后錐體神經元興奮性改變。

總之，DAI后不僅軸突發(fā)生了腫脹、斷裂，軸索球形成，而且DAI對神經元興奮性具有明顯影響，并且呈不同放電類型的動態(tài)變化，進一步揭示這些電生理變化的規(guī)律及其發(fā)生機制，將對深入認識DAI的病理生理變化具有重要意義。

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(編輯 國 榮)

Changes in the electrical activity of hippocampal CAl pyramidal neurons in rats with diffuse axonal injury

DUAN Ji-qiang1,2, SONG Jin-ning1, HAO Pu-heng1, MA Xu-dong1, LI Dan-dong1, ZHAO Yong-lin1, GUO Xiao-ye1, ZHAO Jun-jie1

(1. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 2. Department of Neurosurgery, Weinan Central Hospital, Weinan 714000, China)

Objective To study the excitatory feature of hippocampal CAl pyramidal neurons affected by traumatic brain injury by investigating the spontaneous discharge characteristics of hippocampal CA1 pyramidal cells after diffuse axonal injury (DAI). Methods Thirty healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups: the control group, the group of 6 h after DAI, the group of 12 h after DAI, the group of 24 h after DAI, and the group of 72 h after DAI. Glass microelectrode was used to record extracellular hippocampal neurons discharge. Two unit discharges were recorded for each animal. The differences in unit discharge type and discharge frequency were analyzed among the groups. Results ① The three types of discharges were observed in the hippocampal CA1 pyramidal cells from the normal and DAI rats as irregular discharge, regular discharge and burst discharge. There was no difference in the discharge among the groups. ② Twelve-unit discharges were recorded in each group. The mean frequency and the average ISI of 12 hours in the DAI group significantly differed from those of the other groups. ③ For the cluster ISI, the group of 12 h after DAI had the smallest ISI, followed by the groups of 24 h and 72 h after DAI. However, no significant difference in cluster ISI was found between the group of 6 h after DAI and the control group. Conclusion The electrical activity of hippocampal CAl pyramidal neurons is obviously affected by diffuse axonal injury, which makes dynamic changes with various kinds of discharge.

brain injury; diffuse axonal injury; burst discharge; extracellular discharge; pyramidal neurons

2014-04-21

2014-08-14

國家自然科學基金資助項目(No.30471774)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助項目(No.NCET-05-0831)；陜西省自然科學基金資助項目(No.2003C1-16) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471774), the New-Century Excellent Talents Program of Ministry of Education (No.NCET-05-0831), and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2003C1-16)

宋錦寧. E-mail: jinnings@126.com

R651.1+5

A

10.7652/jdyxb201501012

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20141119.1709.019.html(2014-11-19)