病毒合劑(Ⅱ)中黃芩苷、綠原酸和橙皮苷的含量測定

張 囡，錢宇坤，李維超

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

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病毒合劑(Ⅱ)中黃芩苷、綠原酸和橙皮苷的含量測定

張 囡，錢宇坤，李維超

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300074)

目的：建立HPLC法同時測定病毒合劑中黃芩苷、綠原酸和橙皮苷的含量。方法：色譜柱為Acclaim120 C18120A(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為0.4%磷酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫，流速1.0 ml/min，檢測波長300 nm，進樣量10 μl。結果：黃芩苷、綠原酸和橙皮苷分別在29.16～121.50 μg/ml(r=0.999 9)、3.23～13.44 μg/ml(r=0.999 7)和6.55～27.30 μg/ml(r=0.999 9)范圍內與峰面積呈良好線性關系。平均回收率黃芩苷為102.6%(RSD為0.87%，n=6)，綠原酸為100.1%(RSD為0.96%，n=6)，橙皮苷為98.38%(RSD為0.38%，n=6)。結論：本方法簡便、快速、結果準確、重現(xiàn)性好、靈敏度高，可用于病毒合劑的質量控制。

病毒合劑，黃芩苷，綠原酸，橙皮苷，HPLC

病毒合劑(Ⅱ)為本院院內制劑，由玄參、淡豆豉、黃芩、金銀花、陳皮等14味中藥制成，具有止咳定喘、清熱解表的功效，在治療小兒感冒發(fā)燒、有汗或無汗、鼻流清涕及病毒性肺炎方面療效顯著。黃芩苷為黃芩的主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理學研究表明, 黃芩苷具有多種藥理作用, 但以解熱鎮(zhèn)痛、抗感染、抗菌抗病毒、降壓等作用尤為突出[1]，其抗病毒作用機制可能是抑制ATP合成酶[2]。綠原酸為金銀花的主要有效成分,有多種生物活性，如：心血管保護作用、抗氧化作用、抗紫外及抗輻射作用、抗菌抗病毒作用等[3]。橙皮苷為陳皮的主要成分，其具有保護毛細血管、防止微血管破裂出血的作用，陳皮是治療高血壓和心肌梗塞的藥物[4]，同時也是健脾通氣、助消化的良藥?！短旖蚴嗅t(yī)療制劑規(guī)范2008年版》中收錄病毒合劑(Ⅱ)的質量標準含量測定要求中僅有黃芩苷的含量測定，現(xiàn)為提高其標準、有效控制產(chǎn)品質量，本文參照文獻[5-7]，采用HPLC法通過優(yōu)化色譜條件，建立不需經(jīng)過提取分離，直接利用梯度洗脫的方式同時測定病毒合劑中黃芩苷、綠原酸和橙皮苷含量的方法，并以此作為該制劑的質量控制指標。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津)；LC solution 色譜工作站；AL-104電子天平(瑞士-梅特勒托利多公司)；EQ-AS1000GVDE型雙頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52A 旋轉蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110715-201318)，綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-201314)，橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110721-200613)，病毒合劑(Ⅱ)(本院制劑室，批號20140202、20140301、20140302，規(guī)格100 ml/瓶)，甲醇、乙腈和磷酸均為色譜純，去離子水(自制)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Acclaim120 C18120A (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以0.4%磷酸為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫條件見表1。檢測波長：300 nm；流速：1 ml/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μl[8-10]。

表1 梯度法脫條件

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、綠原酸各適量，分別加50%甲醇制成濃度為121.5 μg/ml的黃芩苷及濃度為13.44 μg/ml的綠原酸對照品溶液；精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成濃度為27.3 μg/ml的橙皮苷對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取病毒合劑(Ⅱ)2 ml，置100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方配比，制備不含黃芩、金銀花和陳皮的陰性樣品，依“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖1。理論板數(shù)按黃芩苷、綠原酸和橙皮苷峰計算均應不低于2 500。

1.綠原酸 2.橙皮苷 3.黃芩苷

2.4 線性關系考查 分別精密量取黃芩苷對照品溶液(48.6 μg/ml)、綠原酸對照品溶液(5.38 μg/ml)、橙皮苷對照品溶液(10.92 μg/ml)6.00、8.00、10.00、12.00、15.00和25.00 ml置25 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積A為縱坐標，進樣濃度C(μg/ml)為橫坐標繪制標準曲線。黃芩苷、綠原酸和橙皮苷的回歸方程分別為：A=16 644.99C+13 953.09(r=0.999 9，n=6)、A=22 728.88C-580.84(r=0.999 7，n=6)和A=9 208.49C-959.4(r=0.999 9，n=6)。結果表明黃芩苷在29.16～121.50 μg/ml范圍內與峰面積呈現(xiàn)良好線性關系；綠原酸在3.23～13.44 μg/ml范圍內與峰面積呈現(xiàn)良好線性關系；橙皮苷在6.55～27.30 μg/ml范圍內與峰面積呈現(xiàn)良好線性關系。

2.6 精密度試驗 取濃度0.060 8 mg/ml黃芩苷、0.006 72 mg/ml綠原酸和0.006 83 mg/ml橙皮苷的混合對照品溶液，重復進樣6次，其中黃芩苷RSD為0.97%，綠原酸RSD為1.1%，橙皮苷RSD為0.47%，表明本試驗所用的方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品(20140301)1份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、6、8、12和24 h后，按“2.1”項下色譜條件測定，測得24 h內峰面積，結果顯示黃芩苷RSD為0.43%，綠原酸RSD為0.85%，橙皮苷RSD為0.72%，表明樣品溶液24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗 取同一批號樣品(20140202)6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依“2.1”項下色譜條件進樣，結果樣品中黃芩苷、綠原酸、橙皮苷RSD分別為0.64%、1.45%和0.95%。

2.9 加樣回收率試驗 分別取黃芩苷對照品的50%甲醇溶液(0.588 0 mg/ml)、綠原酸的50%甲醇溶液(0.062 4 mg/ml)、橙皮苷的甲醇溶液(0.180 0 mg/ml)，各精密量取5 ml，每種對照品6份，分別置50 ml圓底燒瓶中，減壓蒸干，分別精密加入同一批號(20140202)供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析測定，計算回收率。結果顯示黃芩苷平均回收率為102.6%，RSD為0.87%；綠原酸平均回收率為100.1%，RSD為0.96%；橙皮苷平均回收率為98.38%，RSD為0.38%。結果見下表2-表4。

表2 黃芩苷回收率試驗結果

表3 綠原酸回收率試驗結果

表4 橙皮苷回收率試驗結果

2.10 樣品測定 取病毒合劑(Ⅱ)樣品3批(批號20140202、20140301、20140302)，每批各兩份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，用外標法計算樣品中黃芩苷、綠原酸和橙皮苷的含量。結果見表5。根據(jù)測定結果暫定本品每1 ml含黃芩以黃芩苷計，不得少于3.0 mg；含金銀花以綠原酸計不得少于0.3 mg；含陳皮以橙皮苷計，不得少于0.5 mg。

表5 3批病毒合劑樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 黃芩苷、綠原酸和橙皮苷在《中國藥典》測定方法中檢測波長分別為[7]280、328和283 nm，綜合考慮這3種成分的波長及色譜峰的峰形、分離度等，最終選定300 nm作為本試驗的檢測波長。

3.2 本試驗考慮到成品制劑工藝中無醇沉步驟，不宜使用稀醇溶液進行稀釋，故確定用水直接稀釋定容后測定幾種成分含量，該方法經(jīng)濟、環(huán)保，而且滿足定量分析準確度的要求。

1 劉學杰，姜慧禎，林娜.雙貝糖漿中黃芩苷的含量測定[J].西北藥學雜志，2011,26(1)：8-10

2 Chinnam H N，Dadi P，Sabri S，etal．Dietary bioflavonoids inhibit Escherichia coli ATP synthase in a differential manner[J]．Int J Biol Macromol，2010，46(5)：478-486

3 劉穎，郭明曄，白根本.綠原酸的研究進展[J].中藥材，2012，35(7):1180-1185

4 Fernandez Sebastion P，Wasowski Cristina,Paladini Alejandro C.Synergistic interaction between hesperidin,a natural flavonoid,and diazepam[J].European Journal of Pharmacology，2005，512(2-3):189-198

5 喬巖巖，彭家鋼，楊瑞芬，等.高效液相色譜法測定清開靈顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量[J].湖北中醫(yī)藥大學學報，2013，15(3)：38-41

6 王健，陳雙璐，林宏，等.HPLC法同時測定小兒抗病毒顆粒中黃芩苷和橙皮苷的含量[J].天津藥學，2013，25(5)：12-15

7 中國藥典[S].二部.2010：159，205，282

8 劉紅，劉輝，劉彬果. 高效液相色譜法測定急麻顆粒中黃芩苷的含量[J].天津藥學，2014，26(6)：11-12

9 張囡，陳雙璐，錢宇坤. HPLC法測定清肺丸中黃芩苷和柚皮苷含量[J].天津藥學，2011,23(6)：6-8

10 王洪志，喬曉莉，劉勇，等. 高效液相色譜法測定復方承氣顆粒中芍藥苷和橙皮苷的含量[J].天津藥學，2012,24(6)：9-11

2015-02-09

R927.2

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1006-5687(2015)03-0013-03