不同活血化瘀方對擴張型心肌病小鼠心肌細胞的作用及對NF-κB通路的影響*

王鳴瑞,韓明向

1)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院 合肥 230038　2)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年科 合肥 230031

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不同活血化瘀方對擴張型心肌病小鼠心肌細胞的作用及對NF-κB通路的影響*

王鳴瑞1),韓明向2)#

1)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院 合肥 2300382)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年科 合肥 230031

關(guān)鍵詞活血化瘀；擴張型心肌病；NF-κB通路；小鼠

摘要目的：研究不同活血化瘀方對擴張型心肌病小鼠心肌細胞的作用及對NF-κB通路的影響。方法：240只BALB/c小鼠隨機分為方劑A組、方劑B組、模型組和空白組，每組60只。前3組采用柯薩奇B3m病毒制作實驗室病毒性擴張型心肌病模型，方劑A組、方劑B組小鼠造模后分別以方劑A和方劑B灌胃治療，模型組和空白組小鼠均灌注等量的純水，1次/d，連續(xù)5周。比較各組小鼠的心臟質(zhì)量指數(shù)。運用HE和VG染色法觀察各組小鼠心肌細胞的病理學(xué)改變。采用TUNEL法檢測小鼠心肌細胞的凋亡情況。采取RT-PCR法和免疫組化法檢測各組小鼠心肌細胞NF-κB mRNA和蛋白的表達情況。結(jié)果：方劑A組、方劑B組和模型組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)、心肌膠原容積分數(shù)、凋亡心肌細胞數(shù)及NF-κB mRNA和蛋白的表達均高于空白組(P<0.05)；方劑A組和方劑B組小鼠的上述5個指標均低于模型組(P<0.05)；方劑A組上述5個指標均低于方劑B組(P<0.05)。結(jié)論：不同活血化瘀方對擴張型心肌病小鼠心肌細胞的改善作用和對NF-κB通路的影響有差異。

AbstractAim: To study the effect of different promoting blood circulation to remove blood stasis prescriptions on myocardial cells of mice with dilated cardiomyopathy and the effect on the NF-κB pathway.Methods: A total of 240 BALB/c mice were allocated into 4 groups with 60 in each group:group A,group B,model group,and control group.The model of dilated cardiomyopathy was made by B3m virus in the first 3 groups. The model mice in group A and group B were treated by two kinds of activating blood and removing blood stasis decoction. The heart mass index of the mice was compared. The pathological changes of myocardial cells from the mice were observed by HE and VG staining. The apoptosis of myocardial cells was detected by TUNEL. The expressions of NF-κB protein and mRNA were detected by immunohistochemical method and RT-PCR.Results: The heart mass index, myocardial collagen volume fraction, apoptosis of myocardial cells, and expressions of NF-κB protein and mRNA of group A, group B and the model group were higher than the control group(P<0.05). The 5 indexes of group A and group B were lower than those in the model group(P<0.05). And the 5 indexes of group A were lower than those in group B(P<0.05).Conclusion: The effects of different promoting blood circulation to remove blood stasis prescriptions on myocardial cells of mice with dilated cardiomyopathy and the effect on the NF-κB pathway are different.

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)主要臨床表現(xiàn)為心腔擴大、心律失常和心力衰竭等[1-2]；其發(fā)病機制多與病毒感染和自身免疫有關(guān)，慢性病毒性心肌炎會導(dǎo)致DCM的發(fā)生[3-5]。近年來，DCM的發(fā)病率和致死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。當DCM出現(xiàn)心力衰竭癥狀后，患者的5 a生存率僅為40%[6-7]。NF-κB在病理狀態(tài)下具有誘發(fā)心肌重塑、心肌肥大的作用，與DCM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，DCM主要采取對癥治療、免疫藥物治療、介入治療、心臟移植和細胞移植等手段，但總體療效并不樂觀[8-9]。中醫(yī)藥在治療疾病時基于辨證論治的原則，立足于整體，通過多靶點和多途徑對患者機體進行整體調(diào)節(jié)，優(yōu)于機制單一的化學(xué)藥物，且患者易于接受。中醫(yī)藥在治療該病時多從氣虛血瘀論治。該研究采取柯薩奇B3m病毒制作病毒性DCM小鼠模型，對模型小鼠采用兩種不同的活血化瘀方劑灌胃治療，觀察這兩種方劑對DCM的治療效果及其對NF-κB通路的影響，報道如下。

1材料與方法

1.1材料實驗藥品:活血化瘀方A(以下簡稱方劑A)由黃芪、紅參、生地、遠志、川芎、桔梗、丹參、合歡皮、大青葉、升麻等藥物組成?；钛龇紹(以下簡稱方劑B)由當歸、川芎、熟地、紅花、桃仁和白芍組成。方劑A和B均經(jīng)水提取后制成浸膏，用純水稀釋至每mL懸液含生藥4.3 g備用。主要試劑：Trizol RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國NEB公司)，5 U/μL Taq DNA聚合酶(廣州東盛生物科技有限公司)；NF-κB p65抗體(A):SC-109抗體(美國DAKO公司)，PV-9001兔超敏免疫組化檢測試劑盒(美國Santa Cruz公司)，DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。實驗動物：BALB/c小鼠240只，雄性，4周齡左右，購自中國科學(xué)院斯萊克實驗動物中心(SCXK京2011-0012)。造模用病毒：柯薩奇B3m病毒購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)克山病研究所。購回后于Hela細胞中培養(yǎng)傳代，凍融3次后，以2 000 r/min離心，取上清液，Hela細胞中測50%組織感染率為10-7，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2實驗動物分組與取材BALB/c小鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后隨機分為方劑A組、方劑B組、模型組和空白組，每組60只。前3組小鼠均于實驗開始的第1、8、15、22、36和50 天腹腔注射RPMI 1640稀釋的B3m，空白組口服相同劑量生理鹽水。造模結(jié)束,超聲心動圖檢查顯示前3組小鼠左室舒張末徑、左室收縮末徑均高于空白組；4組均隨機選取2只小鼠，處死后病理切片顯示小鼠心腔明顯擴大，心肌細胞變性、壞死以及出現(xiàn)纖維化，說明造模成功。4組小鼠均于實驗開始的第60天后開始灌胃。方劑A組和B組分別灌注由活血化瘀方A和B制備的中藥懸液，灌注劑量均為20.5 g/(kg·d)，1次/d，連續(xù)5周;模型組和空白組小鼠灌注等量的純水。5周后，方劑A組、方劑B組、模型組和空白組存活小鼠數(shù)量分別為56、51、43和58只。所有存活小鼠經(jīng)稱重后采用頸椎脫臼法處死，經(jīng)體積分數(shù)75%乙醇消毒后，無菌條件下開胸取出心臟，用4 ℃的預(yù)冷生理鹽水沖洗掉血污，經(jīng)濾紙吸干后用電子天平稱量。心臟質(zhì)量指數(shù)為心臟質(zhì)量(mg)與體重(kg)的比值。所取心肌組織采用40 g/L的多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)石蠟包埋，切片機連續(xù)切片后用于病理學(xué)檢查。

1.3各組小鼠心肌細胞的病理學(xué)檢查采用HE染色法觀察各組小鼠心肌細胞的病理學(xué)改變，采用VG染色法觀察小鼠心肌細胞間質(zhì)膠原纖維的變化。在腦梗死區(qū)以及梗死周圍區(qū)域，于100倍光鏡下，每張切片選擇8~10個視野，采用多媒體彩色病理圖像分析儀計算單個視野中膠原組織占心肌面積的百分比，即心肌膠原容積分數(shù)。

1.4小鼠心肌細胞凋亡檢測采用TUNEL法檢測小鼠心肌細胞的凋亡情況。組織切片脫蠟脫水后，經(jīng)蛋白酶K孵育30 min，PBS洗片，以含體積分數(shù)0.3%過氧化氫的甲醇溶液孵育30 min，PBS淋洗，加入TUNEL液孵育60 min，PBS淋洗，蘇木精復(fù)染，封片。以細胞核棕黃色染色為陽性。在400倍光鏡下選取8~10個視野，計數(shù)陽性細胞。

1.5小鼠心肌細胞NF-κB mRNA表達的檢測采用RT-PCR法。用Trizol法提取小鼠心肌細胞RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體實驗操作按照RT-PCR試劑盒的說明進行。NF-κB上游引物序列5’-ATCAGACTGGGCTTAAGCCTAC-3’，下游引物序列5’-TAGCCGCTATCGCAGATGGCTGTGC-3’； β-actin上游引物序列5’-TGATGCAGTTGGTCGCTGATG GCA-3’，下游引物序列5’-CTAGCGCGCTAT GTCGACATTGCATG-3’(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計并合成)。PCR反應(yīng)體系為50 μL。94 ℃下先預(yù)變性4 min；然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，30個循環(huán)；最后72 ℃下延伸10 min。結(jié)果判定：取10 μL RT-PCR產(chǎn)物進行電泳，使用凝膠掃描系統(tǒng)掃描，以目的基因與β-actin基因光密度的比值表示該目的基因mRNA的表達水平。

1.6小鼠心肌細胞NF-κB蛋白表達的檢測采用免疫組化法檢測。4 μm組織切片常規(guī)脫蠟后，60 ℃烤箱過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；抗原修復(fù)后以PBS淋洗；滴加過氧化物酶，室溫孵育10 min；滴加NF-κB一抗(按1500稀釋)(陰性對照采用PBS作為一抗)，室溫下孵育30 min，PBS淋洗；分兩步滴加二抗PV9001；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫色，光學(xué)顯微鏡下觀察。陽性細胞為細胞質(zhì)染為棕黃色或者黃色。采用光密度值表示NF-κB蛋白的表達水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較4組小鼠的心臟質(zhì)量指數(shù)、心肌膠原容積分數(shù)和心肌細胞凋亡情況以及NF-κB mRNA及蛋白的表達水平，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1各組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)、心肌組織病理學(xué)改變及心肌細胞凋亡情況比較結(jié)果見圖1、表1。HE染色結(jié)果(圖1)顯示，空白組小鼠心肌纖維整齊，無間質(zhì)血管改變，心肌細胞未見變性和壞死；模型組小鼠心肌纖維紊亂，血管充血出血，心肌細胞呈肥大空泡狀，間質(zhì)纖維化明顯；方劑B組心肌纖維較紊亂，血管充血出血，心肌細胞空泡變性，間質(zhì)輕度纖維化；方劑A組心肌纖維輕微紊亂無斷裂，間質(zhì)輕微纖維化。VG染色結(jié)果(圖1)顯示，空白組小鼠心肌細胞偶見染成紅色的膠原纖維；模型組小鼠可見壞死心肌周圍存在大量膠原纖維；方劑B組小鼠壞死心肌周圍可見較多膠原纖維；方劑A組小鼠壞死心肌周圍只有少量膠原纖維聚集。由表1可知，方劑A組、方劑B組和模型組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)、心肌膠原容積分數(shù)、心肌細胞凋亡均高于空白組；方劑A組和方劑B組上述3指標均低于模型組；方劑A組上述3指標均低于方劑B組。

圖1　各組小鼠心肌組織HE染色和VG染色結(jié)果(×400)

表1　各組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)、

*：與空白組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與方劑A組比較，P<0.05。

2.2各組小鼠心肌細胞NF-κB mRNA和蛋白的表達比較見表2、圖2。由表2可知，方劑A組、方劑B組和模型組小鼠NF-κB mRNA和蛋白的表達均高于空白組；方劑A組和方劑B組小鼠NF-κB mRNA和蛋白的表達均低于模型組，且方劑A組低于方劑B組。

表2　各組小鼠心肌細胞NF-κB mRNA和蛋白的表達

*：與空白組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與方劑A組比較，P<0.05。

圖2　各組小鼠心肌細胞NF-κB蛋白的表達(PV,×400)

3討論

有研究[10-11]表明，正常心臟組織細胞外基質(zhì)的合成和降解存在著一種平衡，當平衡破壞時，心臟的形態(tài)和功能就會受到影響。心臟膠原的合成是一個動態(tài)過程，合成增加或降解減弱都會造成膠原的累積，最終導(dǎo)致心室重塑[12-13]。該研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的心臟質(zhì)量指數(shù)和心肌膠原容積分數(shù)均高于空白組，心肌纖維紊亂、撕裂，間質(zhì)纖維化；說明DCM會促使心肌膠原纖維增生，最終導(dǎo)致心肌重塑。與模型組相比，經(jīng)灌注方劑A或方劑B治療后，小鼠的心臟質(zhì)量指數(shù)和心肌膠原容積分數(shù)均有降低，且方劑A的療效優(yōu)于方劑B。

DCM的發(fā)病多與病毒感染有關(guān)。有研究[14-15]認為，病毒感染心肌細胞會誘導(dǎo)心肌細胞凋亡蛋白的表達，使得心肌細胞不斷丟失，最終發(fā)展為DCM。該研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠心肌細胞凋亡高于空白組，說明病毒感染會誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，與已有研究[16]一致。與模型組相比，經(jīng)灌注方劑A或方劑B治療后，小鼠的心肌細胞凋亡均有降低，且方劑A的療效要優(yōu)于方劑B。

有文獻[17-18]報道，NF-κB會導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌細胞因子系統(tǒng)的過度激活，誘發(fā)心肌重塑，誘導(dǎo)心肌肥大，誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生凋亡。該研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠心肌細胞NF-κB mRNA和蛋白的表達均高于空白組，與上述報道[17-18]一致。經(jīng)灌注方劑A或方劑B治療后，小鼠心肌細胞NF-κB mRNA和蛋白的表達均降低，且方劑A的療效要優(yōu)于方劑B。有研究[19]表明，DCM是以氣虛為本，血瘀、痰濁為標。觀方劑A用藥，方中黃芪為補氣之首，常用于氣虛衰弱，補氣升陽，常與方中升麻配伍，再配以大補元氣的紅參，以達補氣之目的。所謂“氣為血之帥”“氣滯則血瘀”，方中多種補氣藥，能有效改善實驗小鼠氣虛病癥。此外，方劑A在補氣的同時，佐以生地、川芎、丹參、大青葉、合歡皮等活血藥和遠志、桔梗等祛痰藥。再觀方劑B用藥，是養(yǎng)血、補血的經(jīng)典藥方，桃紅四物湯。該方以祛瘀為主，再輔以養(yǎng)血、行氣。方中以強勁的桃仁、紅花為主，力主活血化瘀；以甘溫熟地、當歸養(yǎng)血調(diào)經(jīng)；芍藥養(yǎng)血和營，川芎活血行氣。方劑A中，以大補元氣的黃芪、紅參為主，力主補氣，再佐以多種活血化瘀、祛痰藥，以達標本兼治的目的，而方劑B重在強調(diào)活血化瘀的對癥治療，可以改善疾病癥狀，但不能完全消除病因。所以，方劑A的治療效果要優(yōu)于方劑B，這與實驗所得的結(jié)果相一致。

總之，臨床上對于DCM的治療，可采取補氣加活血化瘀的方法，以達標本兼治的目的。

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*國家自然科學(xué)基金資助項目81071724；河南省基礎(chǔ)與前沿基金資助項目142300413224

Effects of different activating blood and removing stasis prescriptions on myocardial cells of mice with dilated cardiomyopathy and NF-κB pathway

WANGMingrui1)，HANMingxiang2)

1)IntegrativeMedicineClinicalSchool,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei2300382)DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospital，AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230031

Key wordsactivating blood and removing blood stasis;dilated cardiomyopathy;NF-κB pathway；mouse

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.019

中圖分類號Q95-3

通信作者#，男，1940年11月生，教授，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)老年病學(xué)方向，E-mail：HMX401125@sina.com