化學(xué)修飾杏鮑菇多糖對K562細(xì)胞的抑制作用

陳　琳，　郝長春*，　梁　濤，　南　征，　孫潤廣

(1　陜西師范大學(xué)　物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院；

2　食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西　西安　710119)

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化學(xué)修飾杏鮑菇多糖對K562細(xì)胞的抑制作用

陳琳1，郝長春1*，梁濤2，南征1，孫潤廣1

(1陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院；

2食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119)

摘要：對堿提杏鮑菇粗多糖進(jìn)行了硫酸化、磷酸化、乙酰化修飾，并對其體外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。利用紅外光譜技術(shù)對化學(xué)修飾前后的堿提杏鮑菇粗多糖(PEAP)結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，并采用MTT法研究未修飾多糖與修飾后多糖對人白血病細(xì)胞K562體外增殖抑制作用。結(jié)果顯示:化學(xué)修飾后的PEAP分別具有硫酸基團(tuán)、磷酸基團(tuán)、乙?；鶊F(tuán)的特征吸收峰?；瘜W(xué)修飾后的PEAP均對白血病細(xì)胞K562的抑制作用有一定提高，其中乙?；吁U菇粗多糖(Ac-PEAP)對白血病細(xì)胞K562的抑制作用最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞:杏鮑菇；多糖；化學(xué)修飾；抗腫瘤活性

腫瘤是當(dāng)今世界直接危及人類生命的一種最常見、最嚴(yán)重的疾病，如何有效地預(yù)防和治療腫瘤已成為醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)[1]。研究表明，部分真菌多糖一方面能夠有效提高機(jī)體免疫力，同時(shí)對癌變細(xì)胞還表現(xiàn)出顯著抑制作用[2]，優(yōu)選具一定抗癌作用的天然多糖，并了解該類多糖的抗癌機(jī)理已成為現(xiàn)在腫瘤研究的熱門問題。因此，多糖有望成為協(xié)同抗癌藥物，緩解甚至治療腫瘤的有效來源。

多糖(Polysaccharide)是由10個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中[3]。大量研究證實(shí)部分真菌類多糖不但具有能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長的特點(diǎn)，同時(shí)其相對機(jī)體毒性較低[4-5]。多糖的生物活性直接或間接受分子結(jié)構(gòu)的影響，因此對多糖的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾可以增強(qiáng)多糖的活性[6]，降低其毒副作用[7-11]。

杏鮑菇又名刺芹側(cè)耳，屬于真菌門，側(cè)耳屬植物，營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，并且具有多糖、酚類、海藻糖等多種活性成分，已成為一種食療一體的兩用食用菌新品種。杏鮑菇具有抗氧化[12]、抗病毒[13-14]、抗腫瘤[14-15]、降血脂[16]及潤腸胃[17]等多種功效，其中杏鮑菇多糖成分的結(jié)構(gòu)和生物活性等諸多方面都受到了研究者的關(guān)注。

本文對三種化學(xué)修飾的杏鮑菇多糖體外抑制K562細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行了研究，為杏鮑菇多糖的生物活性研究及開發(fā)抗腫瘤藥物市場提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料與試劑

杏鮑菇粗多糖(PEAP)由陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院提供；K562細(xì)胞由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

胎牛血清購于杭州四季青生物有限公司；DMSO購于美國Sigma公司；MTT購于美國Amresco公司；RPMIMedium1640培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2　儀器與設(shè)備

DG5032型酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子集團(tuán)意料設(shè)備有限公司)；XDS-2B倒置生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；Avatar360E.S.P.FTIR傅里葉變換紅外光譜儀(尼高力)；HH·CP-01W型細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；H-H-4型恒溫水浴鍋(上海浦東物理光學(xué)儀器公司)；SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器有限公司)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1堿提杏鮑菇粗多糖的化學(xué)修飾硫酸酯化堿提杏鮑菇粗多糖(S-PEAP)的制備：量筒量取無水吡啶10mL加入到三頸瓶中，并持續(xù)攪拌裝置及其冷凝管，待到三頸瓶中量取的無水吡啶經(jīng)過冰水浴使其充分冷卻后，此時(shí)快速攪拌，并用滴液漏斗緩緩加入4mL氯磺酸，滴加完畢后繼續(xù)攪拌30min。量取7mL二甲基甲酰胺用來溶解酯化試劑，再加入堿提杏鮑菇粗多糖樣品100mg，80℃攪拌，待反應(yīng)3h后，用氫氧化鈉來中和反應(yīng)液，此時(shí)離心，移取上清液分別用自來水和蒸餾水各透析2d，并收集透析液濃縮，醇淀12h后，再離心，稱取沉淀溶于定量蒸餾水中，之后分別用自來水和蒸餾水透析2d，離心后取上清液，經(jīng)冷凍干燥即得硫酸酯化堿提杏鮑菇粗多糖樣品(S-PEAP)[18]。

磷酸酯化堿提杏鮑菇粗多糖(P-PEAP)的制備[19]：精確稱取堿提杏鮑菇粗多糖100mg溶解于100mL蒸餾水中，并在室溫下調(diào)節(jié)pH=8.0，之后分別加入三氯氧磷(POCl3)，在60℃恒溫水浴鍋中使其反應(yīng)40min。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫并調(diào)節(jié)pH=6.5，后用無水乙醇沉淀，離心，再醇沉，經(jīng)冷凍干燥即得磷酸酯化堿提杏鮑菇粗多糖樣品(P-PEAP)。

乙酰化堿提杏鮑菇粗多糖(Ac-PEAP)的制備[20]：精確稱取堿提杏鮑菇粗多糖100mg溶解于10mL蒸餾水中，并用0.5mmol/LNaOH調(diào)節(jié)到pH=9，之后30℃保溫反應(yīng)4h。在此期間分為6次加入乙酸酐，每次加入量為2.5mL，同時(shí)不斷逐滴加入0.5mol/LNaOH以保持pH=8.0。待反應(yīng)結(jié)束后，用5mol/LHCL調(diào)節(jié)pH=7.0，混合溶液經(jīng)透析，濃縮，冷凍干燥后即得乙?；瘔A提杏鮑菇粗多糖樣品(Ac-PEAP)。

1.3.2修飾前后多糖的紅外光譜(IR)分析稱取適量杏鮑菇多糖與干燥后的溴化鉀粉末混合研磨，待至細(xì)末狀，稱取適量杏鮑菇多糖和溴化鉀混合物壓片，進(jìn)行IR掃描，掃描范圍從4000至400cm-1，以溴化鉀壓片為掃描背景[21]。

1.3.3白血病細(xì)胞K562的培養(yǎng)人白血病細(xì)胞K562經(jīng)復(fù)蘇后，常規(guī)培養(yǎng)于滅菌后的RPMI1640培養(yǎng)基中(含10%的胎牛血清和青霉素、鏈霉素各100IU/mL)，置于溫度37℃、二氧化碳濃度為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[22]。

1.3.4MTT法檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)[23-24]取對數(shù)生長期白血病細(xì)胞K562，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)并以1×105的密度接種于96孔板中，設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。待培養(yǎng)24h后，調(diào)零組及其對照組每孔加入100μL滅菌后RPMI1640培養(yǎng)基溶液,而處理組分別加入體積為100μL不同濃度的杏鮑菇粗多糖溶液，設(shè)置多糖溶液的濃度梯度為25、50、100、200、400和800μg/mL。多糖溶液與細(xì)胞接觸24、48、72h后，每孔中加入20μLMTT(5mg/mL)溶液，置于培養(yǎng)箱孵育4h，1000r/min的條件下離心5min，移除上清液，每孔加入180μLDMSO溶液，輕微振蕩96孔板10min，使用酶標(biāo)儀在492nm波長處測定每孔吸光度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算細(xì)胞抑制率：

細(xì)胞相對生長抑制率=

1.4　數(shù)據(jù)處理

利用OriginPro8.5作圖，SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1　紅外結(jié)果分析

圖1　PEAP和S-PEAP的紅外光譜Fig.1　IR　spectrum　of　PEAP　and　S-PEAP

圖2　PEAP和P-PEAP的紅外光譜Fig.2　IR　spectrum　of　PEAP　and　P-PEAP

圖3　PEAP和Ac-PEAP的紅外光譜Fig.3　IR　spectrum　of　PEAP　and　Ac-PEAP

2.2　抗腫瘤實(shí)驗(yàn)分析

PEAP對人白血病K562細(xì)胞作用24、48、72h后，結(jié)果顯示出一定的抑制作用。PEAP對細(xì)胞的抑制效果表現(xiàn)為72h最明顯，其次是48h，多糖作用于細(xì)胞24h呈現(xiàn)最弱抑制效果(P<0.05,P<0.01)。多糖濃度在0~400μg/mL范圍內(nèi)，對K562細(xì)胞的生長呈現(xiàn)時(shí)間及計(jì)量依賴方式(P<0.05,P<0.01)；在400~800μg/mL范圍內(nèi)，多糖對細(xì)胞生長抑制程度未保持原有變化趨勢，而是隨多糖濃度的增大而逐漸減小，結(jié)果如圖4所示。

圖4　PEAP對K562細(xì)胞的抑制效果Fig.4　Inhibition　effects　of　PEAP　against　K562　cells

S-PEAP在實(shí)驗(yàn)作用時(shí)間內(nèi)對白血病K562細(xì)胞的抑制作用較PEAP有所增強(qiáng)，抑制效果在48h達(dá)到最大，24h次之，72h抑制作用較弱。在S-PEAP濃度為200μg/mL時(shí)，對白血病K562細(xì)胞的抑制率最大，抑制率可達(dá)到33.82%；隨著多糖濃度的持續(xù)增加，抑制率開始有所下降，結(jié)果見圖5。研究表明正因?yàn)槭秤镁嗵堑纳锘钚耘c其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有著密切聯(lián)系，所以多糖經(jīng)硫酸化修飾后，引入的硫酸根基團(tuán)改變了多糖支鏈的空間結(jié)構(gòu)，在一定程度上提高了其水溶性與糖鏈的屈伸程度，這可能是引起生物活性改變的重要原因[28]。

圖5　S-PEAP對K562細(xì)胞的抑制效果Fig.5　Inhibition　effects　of　S-PEAP　against　K562　cells

P-PEAP對人白血病K562細(xì)胞的體外抑制作用較為顯著(如圖6所示)。多糖濃度在25~400μg/mL范圍內(nèi)，多糖對細(xì)胞的抑制程度隨濃度的遞增而逐漸增大，當(dāng)濃度為400μg/mL時(shí)，P-PEAP對人白血病K562細(xì)胞的抑制率達(dá)到最大，其中72h抑制率最大約為30.11%。在400~800μg/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞生長抑制程度隨著濃度增大反而逐漸減小，故P-PEAP多糖濃度為400μg/mL，作用時(shí)間為72h時(shí)，P-PEAP對白血病細(xì)胞K562顯示出最大的抑制率。研究表明化學(xué)基團(tuán)的引入也可能會增強(qiáng)多糖的活性，使多糖產(chǎn)生新的活性，磷酸化修飾是將磷酸基團(tuán)引入多糖的殘基上，但其具體的作用機(jī)制研究較少，有待得到進(jìn)一步的研究。

圖6　P-PEAP對K562細(xì)胞的抑制效果Fig.6　Inhibition　effects　of　P-PEAP　against　K562　cells

Ac-PEAP對白血病K562細(xì)胞的體外抑制作用最為顯著。多糖溶液濃度在0~200μg/mL之間，Ac-PEAP對K562細(xì)胞的抑制活性與多糖濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度持續(xù)增大，Ac-PEAP對K562細(xì)胞的抑制作用逐漸減弱。Ac-PEAP對細(xì)胞的抑制作用在48h表現(xiàn)最為顯著，結(jié)果見圖7。魏文青等[29]的研究證明，腫瘤藥物通常存在一個(gè)最佳的作用時(shí)間，腫瘤細(xì)胞的生長處于該時(shí)間時(shí)，抑制作用最強(qiáng)，先于或超過這個(gè)最佳作用時(shí)間點(diǎn)，抑制作用效果并不理想。Ac-PEAP作用時(shí)間48h時(shí)，濃度在200μg/mL抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到35.32%。研究表明對多糖進(jìn)行化學(xué)修飾后，引入不同類型的基團(tuán)，有助于提高多糖的生物學(xué)活性，乙?；囊肟梢愿淖兌嗵堑臋M次序和定向性，使活性基團(tuán)暴露，最終影響多糖在水中的溶解性[30]。

圖7　Ac-PEAP對K562細(xì)胞的抑制效果Fig.7　Inhibition　effects　of　Ac-PEAP　against　K562　cells

3結(jié)論

多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)密切相關(guān)，杏鮑菇多糖經(jīng)過化學(xué)修飾后，引入不同類型的基團(tuán)后，原多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響了多糖的抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)通過對杏鮑菇粗多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后研究其體外抗腫瘤活性，PEAP對人白血病細(xì)胞K562具有一定的抑制效果，特別是經(jīng)化學(xué)修飾后對白血病細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，其中Ac-PEAP濃度為200μg/mL和作用時(shí)間為48h時(shí)的抗腫瘤活性最強(qiáng)；硫酸化修飾與磷酸化修飾多糖的抗癌活性與對多糖C—H伸縮振動(dòng)的取代度有關(guān)，硫酸化修飾完全取代抗癌活性最高，磷酸化修飾部分取代，抗癌活性次之。

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〔責(zé)任編輯李博〕

第一作者：蘇玉波，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橘Y源環(huán)境遙感與GIS應(yīng)用。E-mail:398444617@qq.com

StudiesoninhibitioneffectonK562cellsofchemical

modifiedpolysaccharideofPleurotuseryngii

CHENLin1，HAOChangchun1*，LIANGTao2，NANZheng1，SUNRunguang1

(1SchoolofPhysicsandInformationTechnology；

2SchoolofFoodEngineeringandNutritionalScience，ShaanxiNormalUniversity，

Xi′an710119，Shaanxi，China)

Abstract:ThepolysaccharideswereextractedfromPleurotuseryngiibyalkalisolution,thenweremodifiedbysulfation,phosphorylation,andacetylation.Thecorrespondingantitumoractivitieshavebeenstudied.ThestructureofmodifiedandunmodifiedPleurotuseryngiialkalipolysaccharide(PEAP)wastestedbytheinfraredspectroscopy.ThentheantitumorabilityweretestedbyMTTassayinvitro.Theresultsshowthatthecharacteristicabsorptionpeaksofsulfuricgroup,phosphategroupandacetylgroupwereobservedrespectively.Theabilityoftheanti-tumorHumanLeukemiaCellK562activityofthechemicalmodifiedPEAPwereallimprovedandtheacetylatedmodifiedPEAP(Ac-PEAP)hasthebestinhibitoryability.

Keywords:Pleurotuseryngii；polysaccharide；chemicalmodification；antitumoractivity

通信作者：*張福平，男，副教授。E-mail:zhangfuping@163.com

基金項(xiàng)目：陜西省“百人計(jì)劃”項(xiàng)目；國家科技支撐計(jì)劃(2012BAC08B07)；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011M501496)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(GK201101002)

收稿日期：2014-07-15

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2015.02.421

文章編號：1672-4291(2015)02-0079-06

中圖分類號:R273

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A