丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清腫瘤壞死因子α和白介素6水平的影響

鄧 楠，楊光偉，李小剛

·論著·

丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清腫瘤壞死因子α和白介素6水平的影響

鄧 楠，楊光偉，李小剛

目的 探討丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平的影響。方法 采用自體動脈血制備腦出血模型，將48只清潔級SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(F組，n=8)、腦出血組(ICH組，n=20)和丙酮酸乙酯干預組(EP組，n=20)。F組大鼠只進針，不注血；ICH組大鼠建立腦出血模型后腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；EP組大鼠建立腦出血模型后腹腔注射丙酮酸乙酯，每組大鼠按建模時間(6 h、24 h、3 d、7 d)不同分為4個亞組。評估各組大鼠不同建模時間點神經(jīng)功能缺損程度，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測大鼠不同建模時間點血清TNF-α、IL-6水平。結(jié)果 ICH組不同建模時間點神經(jīng)功能缺損評分低于EP組，EP組低于F組(P<0.05)。ICH組大鼠不同建模時間點血清TNF-α水平高于F組和EP組，ICH組和EP組大鼠不同建模時間點血清IL-6水平高于F組，除建模24 h 外ICH組大鼠血清IL-6水平均高于EP組(P<0.05)。結(jié)論 腦出血后大鼠神經(jīng)功能受損，血清TNF-α、IL-6等炎性因子水平升高。丙酮酸乙酯能降低血清TNF-α、IL-6等炎性因子水平，抑制炎性反應，對腦出血大鼠具有腦保護作用。

腦出血；丙酮酸乙酯；腫瘤壞死因子α；白介素6；大鼠

腦出血是一種常見的腦血管疾病，其發(fā)病率和致殘、致死率均高。大量研究表明，腦出血后炎性細胞趨化于血腫周圍并釋放炎性因子[1]，從而誘導腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等炎性因子的表達，參與腦水腫、炎性反應等引起繼發(fā)性腦損害[2]。丙酮酸乙酯可以通過減少TNF-α和IL-6的表達而減輕炎性反應和缺血再灌注引起的器官損傷[3]，從而實現(xiàn)腦保護作用。目前，關(guān)于丙酮酸乙酯對腦出血后血清炎性因子影響的相關(guān)研究尚少，本實驗通過檢測大鼠腦出血后不同時間點血清炎性因子TNF-α、IL-6的表達情況，探討丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清炎性因子TNF-α和IL-6水平的影響，以闡述丙酮酸乙酯對腦出血大鼠的腦損傷保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠48只，成年雄性，體質(zhì)量300～350 g，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 丙酮酸乙酯(98%)(美國Sigma公司)用Ringer′s液配制濃度為1 mg/ml，TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(上海西塘)，IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(上海西塘)，低溫離心機(上海安亭科學儀器廠)，MK3酶標儀(德國Thermo公司)，MK2洗板機(德國Thermo公司)，數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)，眼科手術(shù)器械一套，腦立體定位儀，分光光度儀。

1.3 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將SD大鼠分為3組。(1)假手術(shù)組(F組)(n=8)：只進針，不注血。(2)腦出血組(ICH組)(n=20)：建立腦出血模型后2 h腹腔注射0.9%氯化鈉溶液(40 mg/kg)，之后1次/d，至動物被處死。(3)丙酮酸乙酯干預組(EP組)(n=20)：建立腦出血模型后2 h腹腔注射丙酮酸乙酯(40 mg/kg)，之后1次/d，至動物被處死。每組按建模時間(6 h、24 h、3 d、7 d)不同分為4個亞組。

1.4 腦出血模型制備 參照文獻[4]方法建立腦出血模型，將1%戊巴比妥鈉按0.4 ml/100 g劑量進行腹腔注射，取大鼠自體動脈血后將其固定于立體定向儀上，微量進針器沿進針點垂直進針6 mm，達到大腦尾狀核后將血液緩慢注入大鼠顱內(nèi)，假手術(shù)組方法同前，但只進針，不注血。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分 處理后大鼠在各亞組相應時間點采用Garcia等[5]制定的評分法進行神經(jīng)功能缺損評分，最高分18分，最低分3分，分數(shù)越低神經(jīng)功能缺損程度越嚴重。

1.6 標本的采集與檢測 取大鼠腔靜脈血4 ml，離心(3 000 r/min)10 min后吸取上清液保存于-20 ℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6水平，具體操作步驟嚴格按說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠不同建模時間點神經(jīng)功能缺損評分比較 3組大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d神經(jīng)功能缺損評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中ICH組不同建模時間點神經(jīng)功能缺損評分低于EP組，EP組低于F組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ICH組大鼠建模3 d神經(jīng)功能缺損評分低于其他建模時間點，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1、圖1)。

Table 1 Comparison of neural function defect score among 3 groups of rat at different modeling time points

組別只數(shù)6h24h3d7dF組214 5±0 715 5±0 716 0±0 015 5±0 7ICH組57 4±0 9?7 2±0 8?6 0±1 0?★7 6±0 9?EP組59 8±0 8?▲10 4±0 5?▲11 4±0 7?▲9 8±0 8?▲F值51 81111 57121 9063 79P值0 000 000 000 00

注：與F組比較，*P<0.05；與ICH組比較，▲P<0.05；與同組其他時間點比較，★P<0.05。F組=假手術(shù)組，ICH組=腦出血組，EP組=丙酮酸乙酯干預組

注：F組=假手術(shù)組，ICH組=腦出血組，EP組=丙酮酸乙酯干預組

圖1 3組大鼠不同建模時間點神經(jīng)功能缺損評分比較

Figure 1 Comparison of neural function defect score among 3 groups of rat at different modeling time points

2.2 3組大鼠不同建模時間點血清TNF-α水平比較 3組大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d血清TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中ICH組大鼠不同建模時間點血清TNF-α水平高于F組和EP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ICH組大鼠建模3 d血清TNF-α水平高于其他建模時間點，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖2)。

2.3 3組大鼠不同建模時間點血清IL-6水平比較 3組大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d血清IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中ICH組和EP組大鼠不同建模時間點血清IL-6水平高于F組，除建模24 h 外ICH組大鼠血清IL-6水平均高于EP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ICH組大鼠建模3 d血清IL-6水平高于其他建模時間點，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3、圖3)。

Table 2 Comparison of serum TNF-α level among 3 groups of rat at different modeling time points

組別只數(shù)6h24h3d7dF組257 07±6 6731 65±2 6438 70±2 8545 95±3 40ICH組5136 09±14 19?201 29±23 03?253 08±16 61?★219 81±45 17?EP組569 28±7 04▲135 97±17 27?▲50 18±5 53▲56 20±11 15▲F值62 8056 82452 8342 06P值0 000 000 000 00

注：與F組比較，*P<0.05；與ICH組比較，▲P<0.05；與同組其他時間點比較，★P<0.05

圖2 3組大鼠不同建模時間點血清TNF-α水平比較

Figure 2 Coparison of serum TNF-α level among 3 groups of rat at different modeling time points

Table 3 Comparison of serum IL-6 level among 3 groups of rat at different modeling time points

組別只數(shù)6h24h3d7dF組227 26±1 2419 03±2 6133 80±2 6018 89±1 46ICH組580 83±6 12?162 15±17 34?191 21±21 66?★171 11±20 79?EP組564 38±7 55?▲126 68±18 81?78 85±7 16?▲44 17±5 84?▲F值48 6150 31104 81128 71P值0 000 000 000 00

注：與F組比較，*P<0.05；與ICH組比較，▲P<0.05；與同組其他時間點比較，★P<0.05

圖3 3組大鼠不同建模時間點血清IL-6水平比較

Figure 3 Comparison of serum IL-6 level among 3 groups of rat at different modeling time points

3 討論

腦出血是一種常見的腦血管疾病，其發(fā)病率和致殘、致死率均較高。腦損傷包括血腫占位效應及腦水腫、血-腦脊液屏障破壞、細胞凋亡[6]、細胞興奮性損害等，其中炎性因子貫穿于腦損傷與修復的整個過程，被認為與神經(jīng)元損傷、預后有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后小膠質(zhì)、巨噬細胞、白細胞等炎性細胞迅速浸潤到出血組織中參與血腫清除，而另一方面過度活化的炎性細胞大量釋放氧自由基、一氧化氮(NO)、炎性因子等參與免疫炎性反應，增加血-腦脊液屏障通透性，導致腦損傷和神經(jīng)元凋亡[7]。張健等[8]研究認為，血清TNF-α、IL-6水平與腦出血嚴重程度呈正相關(guān)，其水平持續(xù)升高提示患者預后差。IL-6由膠質(zhì)細胞、淋巴細胞、血管內(nèi)皮細胞等多種細胞產(chǎn)生，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮神經(jīng)保護及神經(jīng)毒性雙重作用，低水平IL-6具有促進神經(jīng)分化與修復的作用，而高水平IL-6則具有損傷神經(jīng)的作用[9]。周洪霞等[10]在大鼠腦出血的血腫周圍腦組織內(nèi)檢測到高水平IL-6，其水平與腦水腫變化趨勢一致，因此認為IL-6參與腦水腫的形成。TNF-α是一種多功能的促炎性細胞因子，具有多種生物活性，能廣泛參與炎性反應及免疫調(diào)節(jié)，腦出血后其可迅速被炎性細胞激活[11]，通過改變血-腦脊液屏障和誘導趨化因子的表達而加重腦組織炎癥，還能誘導星形膠質(zhì)細胞分泌谷氨酸參與細胞毒性作用[12]。Manye等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能促進腦出血血腫周圍炎性反應，引起腦出血后繼發(fā)性腦損傷。

既往丙酮酸乙酯常用于治療心肌梗死、急性胰腺炎、休克、燒傷、急性顱腦損傷、缺血再灌注損傷等，具有抗感染、清除自由基、保護心肌、降低膽固醇等作用[14]。曾漣等[15]在膿毒血癥大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，丙酮酸乙酯能減少血清中炎性因子如TNF-α、IL-6等水平、減輕器官功能損害。丙酮酸乙酯中的丙酮酸(CH3COCOOH)能穿透血-腦脊液屏障進入腦內(nèi)發(fā)揮腦保護作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸乙酯能抑制由中性粒細胞激活釋放的炎性因子(如TNF-α、IL-6等)及黏附因子的表達，通過抑制TNF的釋放及活性而達到減輕腦內(nèi)炎性損傷、保護腦組織的作用[17]。

本研究結(jié)果表明，大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺損評分下降，血清TNF-α、IL-6水平升高，提示腦出血后存在炎性反應。ICH組大鼠建模6 h血清TNF-α、IL-6水平開始上升，于建模3 d達到高峰，且其水平高于F組和EP組。這與國內(nèi)外相關(guān)實驗報道相符合，進一步證實了腦出血后炎性反應對腦組織的損傷。經(jīng)丙酮酸乙酯治療的腦出血大鼠不同建模時間點神經(jīng)功能缺損評分高于ICH組，血清TNF-α、IL-6水平低于ICH組，表明丙酮酸乙酯有助于恢復腦出血大鼠的神經(jīng)功能，其作用機制可能與減少炎性因子、減輕氧化應激反應有關(guān)。

綜上所述，丙酮酸乙酯能保護腦出血大鼠神經(jīng)元、改善神經(jīng)功能、抑制炎性反應，為臨床治療腦出血提供新的思路，但藥物治療劑量、治療時間窗及藥物不良反應仍有待進一步研究。

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(本文編輯：謝武英)

Influence of Ethyl Pyruvate on Serum Levels of TNF-α and IL-6 in Rats with Cerebral Hemorrhage

DENGNan，YANGGuang-wei，LIXiao-gang.DepartmentofNeurology，People′sHospitalofLuzhou，Luzhou646000，China

Objective To investigate the influence of ethyl pyruvate on serum levels of TNF-α and IL-6 in rats with cerebral hemorrhage.Methods A total of 48 specific pathogen free Sprague-Dawley rats were selected and randomly divided into groups A(n=8)，B(n=20)，C(n=20).A group was given sham-operation，B group was given autologous arterial blood to build cerebral hemorrhage model and then given intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride solution，C group was given autologous arterial blood to build cerebral hemorrhage model and then was given intraperitoneal injection of ethyl pyruvate.After 6 hours，24 hours，3 days，7 days of intervention，2，5，5 rats were randomly picked out from groups A，B，C，respectively，and the degree of nervous functional defects was evaluated，ELISA to used to detect the serum levels of TNF-α and IL-6.Results The nervous functional defects score of B group was lower than that of C group at each time point，respectively，and that of C group was lower than that of A group，respectively(P<0.05).The serum TNF-α level of B group was higher than that of groups A and C at each time point，respectively；the serum IL-6 level of groups B and C was higher than that of A group at each point，respectively，and serum IL-6 level of B group was higher than that of C group after 6 hours，3 days，7 days of intervention.Conclusion Rats with cerebral hemorrhage have different degrees of nervous functional defects，and the serum levels of TNF-α and IL-6 are higher；ethyl pyruvate can reduce the serum levels of TNF-α and IL-6，inhibit the inflammatory reactions，has some cerebral protection effect.

Cerebral hemorrhage；Ethyl pyruvate;Tumor necrosis factor-alpha；Interleukin-6；Rats

646000四川省瀘州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(鄧楠)；瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(楊光偉)，神經(jīng)內(nèi)科(李小剛)

鄧楠，楊光偉，李小剛.丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清腫瘤壞死因子α和白介素6水平的影響[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(2)：49-52.[www.syxnf.net]

R 743.34

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.02.015

2014-08-16；

2015-01-23)

Deng N，Yang GW，Li XG.Influence of ethyl pyruvate on serum levels of TNF-α and IL-6 in rats with cerebral hemorrhage[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(2)：49-52.