TFF2、CLDN18、MUC5AC蛋白在胃黏膜病變過程中的表達變化及其臨床意義*

TFF2、CLDN18、MUC5AC蛋白在胃黏膜病變過程中的表達變化及其臨床意義*

宋潔郭瑞芳#蘇日拉秦二平王佳林

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院消化科(010017)

*本課題由內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金重點項目(20080404Zd26)、內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金項目(2009MS1154)和內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)科研項目(20110903)資助

背景：胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，胃黏膜病變過程中早期分子標記是近年胃癌研究的重點。目的：探討三葉因子2(TFF2)、閉合蛋白18(CLDN18)和黏蛋白5AC(MUC5AC)在不同胃黏膜病變中的表達情況及其臨床意義。方法：選取2008年12月-2009年5月內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院的胃鏡活檢和手術標本71例，其中正常胃黏膜組織20例，腸化生組織20例，異型增生組織11例，胃癌組織20例，采用免疫組化SP法檢測TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達情況。結果：正常胃黏膜組織中TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白均為陽性表達，表達率為100%，而腸化生、異型增生以及胃癌組織中，三種蛋白陽性表達率依次逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論：TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達水平與胃黏膜組織惡性程度密切相關，是潛在的預測胃癌發(fā)生、發(fā)展和預后的重要生物學標記。

關鍵詞胃腫瘤；癌前狀態(tài)；三葉因子2；閉合蛋白18；黏蛋白5AC

胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人們的健康。胃癌普查和癌前疾病的定期隨訪是發(fā)現(xiàn)早期胃癌的重要手段，而簡單、有效、經(jīng)濟、實用的普查方法是腫瘤學研究的熱點。目前胃癌的診斷主要依靠影像學和病理學，但發(fā)現(xiàn)時多數(shù)患者已處于中晚期，手術、放化療的5年生存率仍較低。因此，發(fā)現(xiàn)胃黏膜病變過程中早期分子標記已成為近年胃癌研究的重點。

本課題的前期研究[1]通過寡基因芯片技術發(fā)現(xiàn)三葉因子2(TFF2)、閉合蛋白18(CLDN18)和黏蛋白5AC(MUC5AC)在正常胃黏膜、胃癌和癌旁組織中有差異性表達，經(jīng)生物信息學功能分析發(fā)現(xiàn)，這三種基因?qū)儆谖葛つて琳虾头置诠δ芟嚓P基因。但三種蛋白的表達變化與胃黏膜病變不同過程的關系尚不明確。本研究通過采用免疫組化法檢測三種蛋白在正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的表達情況，旨在初步探討三者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

材料與方法

一、資料來源

選取2008年12月-2009年5月內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院收治的胃鏡活檢和手術切除標本71例，其中正常胃黏膜組織20例，胃黏膜腸化生組織20例，胃上皮異型增生組織11例，胃癌組織20例，不同組織的性別構成和年齡見表1。

表1　各組患者性別、年齡

二、研究方法

采用免疫組化SP法檢測TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達，抗體分別購自美國Proteintech公司和福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，一抗工作濃度均為1∶50，具體步驟參照試劑盒說明書。

結果判定：腺體細胞質(zhì)呈棕黃色為陽性染色。TFF2和CLDN18評分標準：在高倍顯微鏡下，每張切片任取5個視野，每個視野隨機計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞率(%)，取均值。陽性細胞率≤5%或細胞無棕色顆粒與背景一致為“-”；陽性細胞率≤30%為“+”；30%<陽性細胞率≤60%為“++”；陽性細胞率>60%為“+++”。MUC5AC評分標準：陽性細胞染色強度：無著色為陰性“-”；淡黃色為弱陽性“+”；黃色為陽性“++”；棕黃色為強陽性“+++”。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

TFF2、CLDN18、MUC5AC在正常胃黏膜組織中的陽性表達率均為100%；隨著胃黏膜病變程度不斷加重，腸化生組織中的TFF2蛋白陽性表達率為35.0%，CLDN18為70.0%，MUC5AC為30.0%；在異型增生組織中，TFF2蛋白陽性表達率為27.3%，CLDN18為45.5%，MUC5AC為36.4%；在胃癌組織中，TFF2蛋白陽性表達率為25.0%，CLDN18為40.0%，MUC5AC為15.0%，表達強度逐漸減弱(圖1)。正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=29.064，P<0.01；χ2=18.591，P<0.01；χ2=33.633，P<0.01)。

討論

胃黏膜屏障是由胃黏膜上皮細胞頂部以及細胞與細胞之間的緊密連接構成，包括胃表面活性磷脂形成的疏水層和黏液凝膠層的完整性和連續(xù)性，以及調(diào)節(jié)上述結構和成分的一系列生理、化學、生物和免疫因素和活性介質(zhì)[2]。胃黏膜在損傷因子的持續(xù)刺激下，屏障功能受損，導致相關疾病的發(fā)生。胃癌的發(fā)生是多因素、多階段、多基因參與的復雜過程，其中胃黏膜屏障功能的破壞是重要因素之一[3-4]。胃黏膜屏障功能由多種因素介導，包括TFF、氧自由基、幽門螺桿菌、胃泌素、CLDN18、生長抑素、MUC以及一氧化氮等，這些因素相互協(xié)調(diào)，有著密切交聯(lián)的網(wǎng)絡調(diào)節(jié)方式[5]。

TFF是胃黏膜上的一種小肽分子，二級結構中具有“三葉草”形狀的結構域，具有較強的抗酸、耐熱以及抗蛋白酶水解能力，因而具有維持胃黏膜完整性和修復上皮損傷的功能。TFF有3個亞型，分別為TFF1、TFF2和TFF3，TFF1和TFF2主要表達于胃組織和胃黏膜，TFF3主要表達于小腸、直腸以及肺部組織。TFF2又稱解痙多肽，生理狀態(tài)下主要表達于潰瘍易發(fā)部位，如胃體、胃竇的黏液頸細胞和十二指腸，而病理狀態(tài)下主要表達于消化性潰瘍、炎癥性腸病等胃腸道黏膜損傷部位[6-7]。TFF2保護胃黏膜的機制可能為[8-9]：在胃黏膜表面形成凝膠層，減少刺激因子的進一步損傷；通過與受體結合，促進上皮細胞向損傷位點轉(zhuǎn)移，從而起臨時的保護作用；通過抑制胃酸分泌減少對胃黏膜的刺激。本研究發(fā)現(xiàn)，TFF2在正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的陽性表達率依次降低，且組間差異有統(tǒng)計學意義， 表明TFF2蛋白表達水平與胃黏膜病變程度相關，具有抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用，可作為判斷胃癌預后的分子生物學標記。此外，Schmidt等[10]和Jiang等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，TFF2不僅與胃癌發(fā)生關系密切，而且與胃癌的組織分化程度相關，分化程度越低，其表達水平越弱。

TFF2A：正常黏膜組織；B：腸化生；C：異型增生；D：胃癌；CLDN18E：正常黏膜組織；F：腸化生；G：異型增生；H：胃癌；MUC5ACI：正常黏膜組織；J：腸化生；K：異型增生；L：胃癌

圖1不同病變黏膜組織中TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達(免疫組化SP法，×400)

、

CLDN18屬于Claudins多基因家族，是新近發(fā)現(xiàn)的緊密連接結構的重要組成分子[12]。該跨膜蛋白具有2個亞型，分別為CLDN18a1和CLDN18a2，其中CLDN18a2多表達于胃部和肺部，屬于胃黏膜上皮細胞的特異性標記物。Claudins蛋白異常表達可引起上皮細胞或內(nèi)皮細胞結構發(fā)生變化，導致細胞功能受到損傷，特別在心血管疾病、代謝類疾病和消化系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。Claudins在癌組織中常表達降低，導致腫瘤細胞出現(xiàn)異常的緊密連接，降低分化和細胞極性，使腫瘤細胞更易脫離原發(fā)部位進入脈管轉(zhuǎn)移至遠隔部位[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLDN18在正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的陽性表達率依次降低，且組間差異有統(tǒng)計學意義，表明CLDN18蛋白表達水平與胃黏膜病變程度相關，可作為早期檢測胃癌發(fā)生的分子生物學標記。胃黏膜病變過程中的CLDN18蛋白表達下調(diào)可能與轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Cdx2的調(diào)節(jié)有關[14]。

MUC5AC屬于黏蛋白家族，由上皮細胞分泌，主要作用是保持空腔臟器，如胃腸道、呼吸道管腔的潤滑。此外，黏蛋白可調(diào)節(jié)整合素和鈣黏素，從而影響細胞粘附和遷移功能[15-16]。MUC5AC蛋白在正常胃黏膜組織呈高表達，隨著黏膜組織病變的加重，其硫基化、糖基化水平降低，蛋白結構發(fā)生變化，導致保護功能減弱，促進病變進展，甚至發(fā)生胃癌。研究[17]表明，MUC5AC蛋白表達水平與腫瘤的病理類型和發(fā)生部位關系密切。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)，胃癌中MUC5AC蛋白表達與組織病理學分級和腫瘤TNM分期有關，其表達是合理的預測因素。本研究發(fā)現(xiàn)MUC5AC在正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的表達水平依次降低，且組間差異有統(tǒng)計學意義，進一步證實該蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要性。

總之，TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達水平隨著胃黏膜病變進展呈逐漸下降趨勢。本研究進一步證實了胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因參與的過程，不同的基因表達組成了復雜的胃癌抑制或促進網(wǎng)絡，任一蛋白的表達水平發(fā)生變化，均有可能使病變惡化。TFF2、CLDN18和MUC5AC三種蛋白的動態(tài)表達特點，使其有可能成為潛在的預測胃癌發(fā)生、發(fā)展和預后的重要生物學標記。

本研究20例胃癌組織分型、分期并不一致，可能會對研究結果有一定影響，后續(xù)應收集相同病理類型的標本進行檢測，明確在不同類型胃癌中的蛋白表達情況。此外，本研究的樣本數(shù)較少，尤其是異型增生標本，導致蛋白表達弱陽性，表明組織提取操作可能存在問題，下一步應擴大樣本進行研究。

參考文獻

1 Zang S, Guo R, Zhang L, et al. Integration of statistical inference methods and a novel control measure to improve sensitivity and specificity of data analysis in expression profiling studies[J]. J Biomed Inform, 2007, 40 (5): 552-560.

2 房殿春，彭志紅. 胃粘膜屏障功能研究概況[J]. 現(xiàn)代消化及介入診療, 2007, 12 (1): 48-52.

3 Shi SQ, Cai JT, Yang JM. Expression of trefoil factors 1 and 2 in precancerous condition and gastric cancer[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12 (19): 3119-3122.

4 Ito T, Kojima T, Yamaguchi H, et al. Transcriptional regulation of claudin-18 via specific protein kinase C signaling pathways and modification of DNA methylation in human pancreatic cancer cells[J]. J Cell Biochem, 2011, 112 (7): 1761-1772.

5 Madsen J, Nielsen O, Torn?e I, et al. Tissue localization of human trefoil factors 1, 2, and 3[J]. J Histochem Cytochem, 2007, 55 (5): 505-513.

6 穆標，劉之武，王志川，等. 幽門螺桿菌感染對胃粘膜三葉因子2表達的影響[J]. 臨床薈萃, 2005, 20 (14): 787-789.

7 Peterson AJ, Menheniott TR, O’Connor L, et al.Helicobacterpyloriinfection promotes methylation and silencing of trefoil factor 2, leading to gastric tumor development in mice and humans[J]. Gastroenterology, 2010, 139 (6): 2005-2017.

8 Blanchard C, Durual S, Estienne M, et al. IL-4 and IL-13 up-regulate intestinal trefoil factor expression requirement for STAT6 anddenovoprotein synthesis[J]. J Immunol, 2004, 172 (6): 3775-3783.

9 Beck PL, Wong JF, Li Y, et al. Chemotherapy- and radiotherapy-induced intestinal damage is regulated by intestinal trefoil factor[J]. Gastroenterology, 2004, 126 (3): 796-808.

10Schmidt PH, Lee JR, Joshi V, et al. Identification of a metaplastic cell lineage associated with human gastric adenocarcinoma[J]. Lab Invest, 2009, 79 (6): 639-646.

11Jiang P, Yu G, Zhang Y, et al. Promoter hypermethylation and down regulation of trefoil factor 2 in human gastric cancer[J]. Oncol Lett, 2014, 7 (5): 1525-1531.

12Tsukita S, Furuse M, Itoh M. Structural and signalling molecules come together at tight junctionsr[J]. Curr Opin Cell Biol, 1999, 11 (5): 628-633.

13Martin TA, Jiang WG. Tight junctions and their role in cancer metastasis[J]. Histol Histopathol, 2001, 16 (4): 1183-1195.

14Sanada Y, Oue N, Mitani Y, et al. Down-regulation of the claudin-18 gene, identified through serial analysis of gene expression data analysis, in gastric cancer with an intestinal phenotype[J]. J Pathol, 2006, 208 (5): 633-642.

15Imbert Y, Darling DS, Jumblatt MM, et al. MUC1 splice variants in human ocular surface tissues: possible differences between dry eye patients and normal controls[J]. Exp Eye Res, 2006, 83 (3): 493-501.

16Jia Y, Persson C, Hou L, et al. A comprehensive analysis of common genetic variation in MUC1, MUC5AC, MUC6 genes and risk of stomach cancer[J]. Cancer Causes Control, 2010, 21 (2): 313-321.

17Kageyama-Yahara N, Yamamichi N, Takahashi Y, et al. Gli Regulates MUC5AC transcription in human gastro-intestinal cells[J]. PLoS One, 2014, 9 (8): e106106.

18Wang C, Wang J, Liu Y, et al. MUC5AC upstream complex repetitive region length polymorphisms are associated with susceptibility and clinical stage of gastric cancer[J]. PLoS One, 2014, 9 (6): e98327.

(2014-12-22收稿；2015-03-16修回)

Expressions and Significance of TFF2, CLDN18 and MUC5AC Protein in Gastric Mucosal LesionsSONGJie,GUORuifang,SURila,QINErping,WANGJialin.DepartmentofGastroenterology,InnerMongoliaPeople’sHospital,Huhhot(010017)

Correspondence to: GUO Ruifang, Email: grf_6872@163.com

Background: Gastric cancer is one of the malignant tumors with highest morbidity and mortality, and the early change of molecular marker in gastric mucosal lesion is the hot spot of gastric cancer study. Aims: To investigate the expressions and clinical significance of trefoil factor 2 (TFF2), claudin 18 (CLDN18), mucin 5AC (MUC5AC) in gastric mucosal lesions. Methods: Gastroscopy biopsies and surgery specimens from Dec. 2008 to May 2009 at Inner Mongolia People’s Hospital were collected, including 20 normal gastric mucosal tissues, 20 intestinal metaplasia tissues, 11 dysplasia tissues and 20 gastric cancer tissues. The protein expressions of TFF2, CLDN18, MUC5AC were determined by immunohistochemical SP method. Results: The positive expression rates of TFF2, CLDN18 and MUC5AC in normal gastric mucosal tissues were all 100%, and were gradually decreased in the order of intestinal metaplasia, dysplasia and gastric cancer tissue, the differences were statistically significant (P<0.01). Conclusions: Expressions of TFF2, CLDN18 and MUC5AC protein are closely related to the degree of malignancy of gastric mucosal lesions, and can be considered as a potential biological marker for predicting the development and prognosis of gastric cancer.

Key wordsStomach Neoplasms;Precancerous Conditions;Trefoil Factor 2;Claudin 18;Mucin 5AC

通信作者#本文，Email: grf6872@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.07.003