脂多糖和(1，3)-β-D 葡聚糖與克羅恩病疾病活動(dòng)度的關(guān)系*

郭艷敏 劉占舉

上海市第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科(200072)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性復(fù)發(fā)性非特異性腸道炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，可能與腸黏膜免疫調(diào)節(jié)異常、腸道持續(xù)感染、腸黏膜屏障破壞、遺傳和環(huán)境因素等密切相關(guān)［1-2］。本研究組近期發(fā)現(xiàn)細(xì)菌毒素與IBD發(fā)病和預(yù)后有關(guān)，在活動(dòng)期IBD患者血清中難辨梭狀芽孢桿菌、沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157分泌的細(xì)菌毒素水平較緩解期IBD患者和健康者明顯升高，活動(dòng)期CD患者接受英夫利西單抗治療后，上述細(xì)菌毒素水平明顯下降［3］。為進(jìn)一步研究細(xì)菌毒素在IBD發(fā)展過(guò)程中的作用，本研究通過(guò)檢測(cè)CD患者血清脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和(1，3)-β-D 葡聚糖［(1，3)-β-D glucan，BG］濃度，旨在探討兩者與CD的關(guān)系。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

納入2013年4月-2014年7月上海市第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科收治的CD患者68例。CD診斷標(biāo)準(zhǔn)參考“炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2012年·廣州)”［4］。按蒙特利爾世界胃腸病大會(huì)推薦的蒙特利爾分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)CD患者進(jìn)行亞型分組(根據(jù)年齡分為A1、A2、A3型;根據(jù)病變部位分為 L1，累及回腸末段;L2，結(jié)腸型;L3，回結(jié)腸型)［5］。納入同時(shí)期20名健康志愿者作為對(duì)照組。本研究方案經(jīng)上海市第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選患者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1.光度法測(cè)定血清LPS和BG水平:采集入選者空腹外周血4 mL，3000×g離心1 min，分離富血小板血漿0.1 mL加入0.9 mL樣品處理液中待測(cè)。取待測(cè)血漿0.2 mL，10 min內(nèi)分別加至革蘭陰性菌LPS檢測(cè)試劑盒和BG檢測(cè)試劑盒(光度法)(北京金山川科技發(fā)展有限公司)，于MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)LPS、BG水平。

2.采用克羅恩病活動(dòng)指數(shù)(CDAI)和克羅恩病簡(jiǎn)化內(nèi)鏡活動(dòng)度評(píng)分(SES-CD)［6］分別判定CD疾病嚴(yán)重程度和內(nèi)鏡下疾病活動(dòng)度。采集CD患者ESR、CRP水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，LPS和BG水平以對(duì)數(shù)(log10)轉(zhuǎn)換表述，計(jì)量資料以表示。多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)(兩兩比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn))。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

68例CD患者中活動(dòng)期CD(A-CD組)41例，其中男25例，女16例，年齡12～74歲，平均(34.6±15.2)歲;緩解期CD(R-CD組)27例，其中男20例，女7 例，年齡15～66 歲，平均(33.1 ±15.7)歲;對(duì)照組中男8名，女12名，年齡24～66歲，平均(45.4±12.7)歲。三組患者性別構(gòu)成、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。A-CD 組患者 A1、A2、A3型分別為5 例、23 例、13 例，L1、L2、L3 型分別為 4、8、29例，R-CD組患者A1、A2、A3型分別為2例、19例、6例，L1、L2、L3 型分別為7、2、18 例。

二、血清 LPS、BG 水平

68例患者 CDAI為 39.60～335.80分，SES-CD為0.00 ～23.40 分，血清 LPS 為(0.30 ～2.70)pg/mL，BG 為(0.48～3.00)pg/mL。A-CD 組 LPS 水平較R-CD組和對(duì)照組顯著升高(P=0.023;P=0.000)，R-CD組LPS水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.081)(圖1，表1)。A-CD組BG水平較R-CD組和對(duì)照組明顯升高(P=0.007;P=0.000)，R-CD組BG水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.204)(圖2，表1)。

圖1 三組患者血清LPS水平

圖2 三組患者血清BG水平

三、LPS、BG 與 CDAI、SES-CD、ESR、CRP 的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，LPS水平與 CDAI、SES-CD、ESR 呈正相關(guān)，(r=0.264，P=0.030;r=0.330，P=0.006;r=0.337，P=0.022);BG 水平與 CDAI、SESCD、ESR 呈正相關(guān)(r=0.332，P=0.006;r=0.417，P=0.000;r=0.292，P=0.049);LPS、BG 與 CRP 不相關(guān)(r=0.169，P=0.172;r=0.182，P=0.141)(圖3，圖4)。

表1 三組患者試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較()

表1 三組患者試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較()

圖3 LPS水平與CDAI、SES-CD、ESR、CRP 的相關(guān)性

圖4 BG水平與CDAI、SES-CD、ESR、CRP 的相關(guān)性

討 論

正常生理狀態(tài)下成人腸道細(xì)菌約1014個(gè)，共計(jì)1000個(gè)不同種群，主要屬于擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和變形桿菌門(mén)，以高濃度革蘭陰性菌和低濃度革蘭陽(yáng)性菌為主［7-8］。IBD患者與健康人相比，腸道內(nèi)細(xì)菌生物多樣性明顯減少，且以厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主［9］。此外，IBD患者回腸末端異常定植黏附型/侵襲型大腸桿菌明顯增多，柔嫩梭菌群明顯減少，且此種狀態(tài)分別與回腸末端疾病嚴(yán)重程度和預(yù)測(cè)回腸末端CD發(fā)病危險(xiǎn)度密切相關(guān)［10］。一項(xiàng)系統(tǒng)性回顧和meta分析［11］顯示，抗菌藥物可誘導(dǎo)活動(dòng)期CD、UC以及CD并發(fā)肛瘺患者達(dá)到緩解。此外，Levine等［12］的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，采用阿奇霉素和甲硝唑治療輕中度活動(dòng)期兒童/青年CD患者8周后可有效誘導(dǎo)緩解，證實(shí)抗菌藥物可通過(guò)直接清除腸道內(nèi)細(xì)菌治療CD。研究［13］發(fā)現(xiàn)，遺傳易感小鼠結(jié)腸炎動(dòng)物模型在無(wú)菌環(huán)境中無(wú)疾病發(fā)生，而野生型小鼠在與特定基因改變自發(fā)性結(jié)腸炎小鼠共同飼養(yǎng)或直接喂飼結(jié)腸炎小鼠腸道中某些細(xì)菌后可發(fā)生腸道炎癥，表明腸道微生物具有IBD致病潛力。

腸黏膜屏障由共生腸道菌群、黏液層、腸上皮以及腸道相關(guān)淋巴組織和免疫細(xì)胞組成，上述結(jié)構(gòu)相互作用共同維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和腸道通透性［14］。腸黏膜屏障通透性增加在IBD發(fā)病機(jī)制中起有重要作用［15］。研究［16］指出CD患者腸上皮細(xì)胞緊密連接功能受損，腸黏膜通透性增加，導(dǎo)致大量微生物抗原被吸收，誘導(dǎo)腸黏膜內(nèi)特異性巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量促炎因子，引起腸黏膜炎癥。Balda等［17］的研究顯示，腸上皮通透性缺陷區(qū)域的腸道黏膜炎癥較通透性正常部位嚴(yán)重，提示腸道上皮通透性增加可持續(xù)刺激腸黏膜免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。CD患者腸黏膜通透性增加的機(jī)制亦包括緊密蛋白數(shù)量減少、連接斷裂、含量和組成改變以及上皮細(xì)胞凋亡增加。另有研究［18］顯示，病原體和細(xì)菌毒素可通過(guò)直接或間接改變緊密蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，使上皮通透性增加。腸上皮屏障破壞可使微生物或微生物抗原穿過(guò)腸道固有層組織，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活免疫細(xì)胞，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致炎癥發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)A-CD組患者血清LPS和BG較RCD組和對(duì)照組明顯升高，且上述兩項(xiàng)指標(biāo)與CDAI、SES-CD和ESR呈正相關(guān)，與CRP無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明LPS和BG水平可能與CD疾病活動(dòng)度有關(guān)。在ACD患者，腸道黏膜屏障受損、腸上皮黏膜通透性增加，促使腸道內(nèi)大量抗原物質(zhì)(如LPS、BG)吸收，同時(shí)腸上皮表達(dá)高水平人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)-Ⅱ和HLA-Ⅰ類(lèi)抗原，增強(qiáng)抗原遞呈，誘導(dǎo)腸上皮黏膜組織內(nèi)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞激活，產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)。另外，腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)亦可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞激活，使其細(xì)胞毒殺傷作用增強(qiáng)，促使炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，最終引起上皮細(xì)胞損傷、腸黏膜屏障破壞加重［19］。經(jīng)糖皮質(zhì)激素、生物制劑、免疫抑制劑治療后，腸黏膜屏障完整性改善，腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)無(wú)法吸收入血，血清LPS可恢復(fù)正常。CRP是由肝臟合成的急性期蛋白，半衰期為19 h，在炎癥損傷時(shí)肝臟合成CRP迅速增加是機(jī)體急性炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)。本研究中部分患者最初就診時(shí)誤診以及錯(cuò)誤治療，可能導(dǎo)致CRP與LPS、BG相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，血清LPS和BG可作為評(píng)判CD疾病活動(dòng)度和內(nèi)鏡下黏膜緩解程度的指標(biāo)，為臨床診斷、治療提供了理論依據(jù)。

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