梅毒血清固定患者外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)及意義

方銳華，吳愛武，莫 友，李 群，許志萍

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510180)

梅毒血清固定患者外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)及意義

方銳華1，吳愛武2，莫 友1，李 群1，許志萍1

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510180；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510180)

目的檢測并比較梅毒血清固定患者與治療后快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡生試驗(yàn)(RPR)轉(zhuǎn)陰患者外周血CD4+CD25+Treg以及CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)情況。方法運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測40例梅毒血清固定患者(實(shí)驗(yàn)組)和40例治療后RPR轉(zhuǎn)陰的梅毒患者(對照組)外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)水平并進(jìn)行比較。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞總數(shù)的(11.90±0.64)%，對照組為(9.09±0.28)%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.01，P<0.001)；實(shí)驗(yàn)組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞總數(shù)的(6.25±0.28)%，對照組為(3.37±0.24)%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.90，P<0.001)。結(jié)論血清固定梅毒患者外周血中抑制性CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例明顯高于RPR轉(zhuǎn)陰梅毒患者，且其中大部分為具有抑制活性的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群，推測這類Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占的比例增加與梅毒患者血清固定有一定關(guān)系。

梅毒；血清固定；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

梅毒是由梅毒螺旋體(treponema pallidum，Tp)感染引起的一種常見的性傳播疾病，主要通過直接、間接性接觸和血液傳播[1]。梅毒的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且近年來的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示越來越多的患者出現(xiàn)治療后非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)不轉(zhuǎn)陰的現(xiàn)象，即血清固定。發(fā)生血清固定的確切原因尚不明確，目前認(rèn)為，梅毒血清固定可能與Tp感染后患者機(jī)體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂從而引起免疫耐受相關(guān)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)對細(xì)胞免疫應(yīng)答的抑制可能在其中發(fā)揮重要的作用[2]，然而其具體原因及機(jī)制至今尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過檢測并比較梅毒血清固定患者與治療后RPR轉(zhuǎn)陰患者外周血CD4+CD25+Treg以及CD4+CD25+Foxp3+Treg的表達(dá)情況，以探究它們是否與梅毒血清固定的發(fā)生存在免疫相關(guān)。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2009—2013年在廣州第一人民醫(yī)院皮膚性病科門診部與住院部經(jīng)正規(guī)驅(qū)梅治療后出現(xiàn)梅毒血清固定的患者40例作為實(shí)驗(yàn)組，其中男21例，女19例;年齡24～46(34.1±2.3)歲;10例為曾經(jīng)出現(xiàn)過皮膚和/或黏膜損傷的早期梅毒者(包括一期梅毒3例，二期梅毒7例)，30例為從未出現(xiàn)過皮膚和/或黏膜損害的早期潛伏梅毒者。患者經(jīng)正規(guī)驅(qū)梅治療前后其血清中的梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)與快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)均為陽性，且隨訪期間血清RPR滴度均不轉(zhuǎn)陰，最后一次隨訪其RPR滴度有1例為1∶8，2例為1∶4，17例為1∶2，20例為1∶1。選取經(jīng)正規(guī)驅(qū)梅治療后血清RPR轉(zhuǎn)為陰性的40例梅毒患者作為對照組，其中男24例，女16例;年齡21～45(33.0±3.0)歲;治療前確診為一期梅毒者12例，二期梅毒者18例，早期潛伏梅毒者10例。2組患者的年齡、性別等一般情況比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2標(biāo)本準(zhǔn)備 分別抽取2組患者的外周靜脈血2 mL，采用EDTA作抗凝處理，保存于溫度為4 ℃的冰箱，用于外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)的分離及流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry， FCM)檢測，于24 h內(nèi)送檢。

1.3主要試劑與儀器 流式細(xì)胞儀(FACS Calibur型，Becton Dickinson公司，美國)，JY-B快速漩渦混勻儀，小型臺式高速離心機(jī)，水平離心機(jī)等；磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)，大鼠血清，胎牛血清(FBS)，PE標(biāo)記的鼠抗人CD4單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD25單克隆抗體， PE標(biāo)記鼠抗人IgG2b同型抗體，RP-MI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液，F(xiàn)icoll 分離液(以上試劑均為Becton Dickinson公司，美國)；FOXP3固定/破膜液緩沖系統(tǒng)(eBioscience公司，美國)，PE標(biāo)記的鼠抗人Foxp3單克隆抗體(eBioscience公司，美國)。

1.4實(shí)驗(yàn)步驟 將EDTA抗凝靜脈血經(jīng)Ficoll密度梯度離心法獲取單個核細(xì)胞(PBMC)，調(diào)整濃度為2×106/mL。取PBMC懸液各100 mL分別置于實(shí)驗(yàn)管和對照管，每管分別加入抗人PE-CD4單抗和抗人PITC-CD25單抗各20 μL，充分混勻后于室溫下避光孵育30 min，進(jìn)行細(xì)胞表面抗原染色。然后每管加入新配的固定破膜液2 mL混勻，室溫下避光孵育30 min，再用2 mL破膜液洗滌細(xì)胞2次后行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。兩管均用鼠血清2 mL封閉10 min后實(shí)驗(yàn)管加入PE標(biāo)記的Foxp3單克隆抗體20 mL，對照管加入PE標(biāo)記的鼠PE-IgG2b 10 μL，室溫下避光孵育30 min。再用PBS破膜液洗滌細(xì)胞2次后，用300 mL流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，用FACS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞總數(shù)的(11.90±0.64)%，對照組為(9.09±0.28)%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.01，P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞總數(shù)的(6.25±0.28)%，對照組為(3.37±0.24)%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.90，P<0.001)。

3 討 論

梅毒是由Tp感染引起的一種臨床常見的、慢性、傳染性疾病。它的傳染性較強(qiáng)，性接觸是最主要的傳播方式，此外也可通過輸血、產(chǎn)道、胎盤、共用注射器、器官移植等多種方式傳播。梅毒的臨床表現(xiàn)多種多樣，機(jī)制十分復(fù)雜，并可能對患者甚至其下一代的身心健康造成嚴(yán)重的影響[3]。大量流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，近年來梅毒發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并且更廣泛地分布于發(fā)展中國家，我國及全球梅毒發(fā)病率均在不斷上升，其中男同性戀患者也明顯增多，潛伏梅毒和胎傳梅毒報告數(shù)也明顯增多[4]，且越來越多的患者雖然經(jīng)正規(guī)驅(qū)梅治療后仍出現(xiàn)了血清固定現(xiàn)象。然而，引起血清固定的原因及其機(jī)制仍未完全明確，是懸而未決的醫(yī)學(xué)難題之一，同時也是臨床治療的阻礙。

目前，醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為：梅毒螺旋體感染后所刺激的體液免疫保護(hù)性是非常有限的，細(xì)胞免疫的作用更為重要，而梅毒血清固定的發(fā)生則可能與患者的細(xì)胞免疫功能受到抑制相關(guān)。國內(nèi)外對梅毒血清固定的研究主要著眼于細(xì)胞免疫的紊亂。細(xì)胞免疫被認(rèn)為是清除體內(nèi)Tp的主要方式，其中又以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主。 Fitzgerald[5]提出一期梅毒為Thl細(xì)胞占優(yōu)勢而二期梅毒因細(xì)胞免疫功能受到抑制轉(zhuǎn)化為Th2細(xì)胞占優(yōu)勢的“Thl/Th2漂移”假說。國內(nèi)也有學(xué)者認(rèn)為梅毒患者Th1和Th2免疫細(xì)胞確實(shí)存在漂移現(xiàn)象[6]。正常機(jī)體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)間維持著一定的動態(tài)平衡，但是在血清固定梅毒患者中CD4+T細(xì)胞明顯下降，而且以Th1細(xì)胞的減少為主，使Th1/Th2的這種動態(tài)平衡向Th2方向漂移。Th2細(xì)胞可阻遏由Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，還可抑制INF-γ的產(chǎn)生，從而抑制巨噬細(xì)胞活化，并進(jìn)一步導(dǎo)致IL-2、IL-6分泌水平紊亂，使得機(jī)體保護(hù)性清除Tp的細(xì)胞免疫功能明顯下降，同時細(xì)胞免疫抑制作用也相對增強(qiáng)。梅毒血清固定患者多數(shù)臨床癥狀比較隱匿，這可能與感染初期CD4+T淋巴細(xì)胞的Th1亞群及殺傷細(xì)胞相對減少、機(jī)體免疫反應(yīng)較遲鈍有關(guān)。Thl/Th2漂移假說是目前梅毒免疫學(xué)中關(guān)于細(xì)胞免疫的主要學(xué)說，它不僅僅是Tp能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視得以繼續(xù)增殖、疾病進(jìn)入潛伏階段的可能原因，同時也提示梅毒患者免疫功能的紊亂可能與發(fā)生血清固定相關(guān)。然而，機(jī)體Thl/Th2細(xì)胞的失衡又與Treg細(xì)胞的數(shù)量及功能密切相關(guān)[5]。趙建斌等[9]研究結(jié)果顯示：梅毒一期、二期及潛伏梅毒患者外周血Treg細(xì)胞比例和正常人相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是梅毒血清固定陽性患者的Treg細(xì)胞比例要明顯高于正常健康人群，并且不同組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。也就是說，當(dāng)感染Tp后，患者外周血中Treg細(xì)胞的比例異常增高的，提示患者自身細(xì)胞免疫功能會受到嚴(yán)重抑制，通過人體自身免疫并不能將病原體徹底清除。即使經(jīng)過規(guī)范的抗生素驅(qū)梅治療，體內(nèi)仍然有少量的Tp持續(xù)存在，刺激機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生抗體，從而導(dǎo)致血清固定現(xiàn)象的發(fā)生。所以，可初步推測Treg細(xì)胞在梅毒血清固定的發(fā)生中可能起著一定的作用，但是目前仍不能就此下定論。故而，本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，初步探討了梅毒血清固定的發(fā)生是否與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能存在明確的相關(guān)性。

迄今為止，Treg也是研究最為深入、被認(rèn)為是發(fā)揮免疫抑制作用的最主要的一類調(diào)節(jié)性細(xì)胞，它能有效抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖及其功能的發(fā)揮，從而減弱效應(yīng)性T細(xì)胞對病原體的有效應(yīng)答與清除，促進(jìn)多種慢性傳染病的進(jìn)一步發(fā)展，并與慢性炎癥的持續(xù)存在相關(guān)。因此，Treg細(xì)胞被認(rèn)為在感染相關(guān)性疾病，尤其是慢性感染性疾病中起重要作用。梅毒也是一種慢性、常見的感染性疾病，Treg細(xì)胞在梅毒血清固定中可能同樣起重要的作用。Treg細(xì)胞主要包括以下四大類細(xì)胞：分別為CD4+Treg、CD8+Treg、NKT (自然殺傷性T細(xì)胞) Treg、DN (雙陰性) Treg細(xì)胞等，其中又以CD4+Treg細(xì)胞為主，它在T淋巴細(xì)胞的增殖及其功能發(fā)揮過程中起重要的抑制性調(diào)控作用。

CD4+Treg細(xì)胞的表面主要表達(dá)CD25、細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR基因(GITR)等，這些分子一度被當(dāng)作Treg細(xì)胞的常用標(biāo)記，但后來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CD25、CTLA-4、GITR等分子同時也可以在其他活化的效應(yīng)性淋巴細(xì)胞上表達(dá)，所以它們?nèi)韵鄬θ狈μ禺愋?。Foxp3(叉頭/翼狀家族螺旋轉(zhuǎn)錄因子)具有較高特異性的形態(tài)與功能性的標(biāo)記，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞核內(nèi)的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白表達(dá)影響著Treg細(xì)胞的成熟發(fā)育及其抑制功能的發(fā)揮。Foxp3主要表達(dá)在CD4+T細(xì)胞上，而且?guī)缀跞勘磉_(dá)于CD25高表達(dá)的T細(xì)胞中。故而，目前認(rèn)為具有真正意義上免疫抑制活性的Treg細(xì)胞群為CD4+CD25+Foxp3+Treg。

CD4+CD25+Treg可通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，干擾樹突狀細(xì)胞對抗原的呈遞功能，直接或間接降低抗原特異性T細(xì)胞的增殖，抑制一系列炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因而CD4+CD25+Treg在維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)方面具有非常重要的作用。近年來，人們對于CD4+CD25+Treg細(xì)胞在腫瘤、梅毒、麻風(fēng)等方面的作用均進(jìn)行了大量研究，相關(guān)的研究結(jié)果顯示在梅毒、銀屑病、麻風(fēng)、宮頸癌、乳腺癌等患者的外周血中或腫瘤局部CD4+CD25+Treg細(xì)胞的水平相對升高，提示在這些患者中異常高水平的CD4+CD25+Treg細(xì)胞可能通過抑制機(jī)體的正常免疫應(yīng)答而導(dǎo)致免疫耐受的出現(xiàn)，最終參與疾病的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)[10-15]。

因此，本研究擬通過檢測并比較臨床梅毒血清固定患者及治療后RPR轉(zhuǎn)陰梅毒患者的外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的百分比，初步探討了Treg細(xì)胞與梅毒血清固定之間的免疫相關(guān)性，以期為血清固定的早診斷、早預(yù)防以及早治療提供新的思路和方法。

本實(shí)驗(yàn)以臨床就診的梅毒血清固定患者為研究對象，抽取外周血后采用Ficoll密度梯度離心法分選出PBMCs，提高了Treg在待測單細(xì)胞懸液中的百分比，從而排除了外周血中比例較大的中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞等細(xì)胞成分對淋巴細(xì)胞亞群檢出率的影響。在正常人的外周血中，CD4+CD25+Treg約占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%～10%，其中又以CD4+CD25+Foxp3+Treg占多數(shù)。本研究結(jié)果顯示，梅毒血清固定患者的外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例相較于梅毒治療后RPR轉(zhuǎn)陰者要高，說明梅毒患者血清固定時Treg細(xì)胞是升高的，而其中真正發(fā)揮有效抑制作用的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞也相應(yīng)增多,與國內(nèi)報道的一致[8]。由此可見，CD4+CD25+Treg及CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在梅毒血清固定患者的外周血中是明顯升高的，且升高的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞可能通過分泌抑制性細(xì)胞因子對Tp特異性的T細(xì)胞免疫發(fā)揮了抑制作用，進(jìn)而參與了梅毒血清固定的產(chǎn)生。

綜上所述，梅毒血清固定患者外周血中抑制性CD4+CD25+Treg細(xì)胞，尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞亞群的比例明顯高于RPR轉(zhuǎn)陰梅毒患者，通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的抑制活性，有望提高梅毒患者治療后陰轉(zhuǎn)率，這也許是今后梅毒血清固定免疫學(xué)治療中的一個新手段。

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吳愛武，E-mail:aiwwu66@163.com

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1008-8849(2015)34-3801-03

2015-01-15