藥物對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞毒性的體外研究進(jìn)展

萬(wàn)慧杰，佟繼銘，張樹峰?

（河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

藥物對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞毒性的體外研究進(jìn)展

萬(wàn)慧杰，佟繼銘，張樹峰△?

（河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

卵巢顆粒細(xì)胞；黃體細(xì)胞；生殖毒性；體外培養(yǎng)

1957-1961年的“反應(yīng)停”事件引起全世界對(duì)生殖毒性的關(guān)注，揭開了藥物生殖毒性研究的篇章。2006年11月，我國(guó)《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》出臺(tái)［1］，各界人士越來(lái)越關(guān)注生殖毒性。傳統(tǒng)的動(dòng)物生殖毒性研究需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，周期長(zhǎng)，工作量大，費(fèi)用昂貴，且難以評(píng)價(jià)生殖毒性和闡明毒性機(jī)制。近年來(lái)，細(xì)胞分子生物學(xué)、基因技術(shù)等學(xué)科的飛速發(fā)展，使得體外檢測(cè)技術(shù)和方法開始應(yīng)用于動(dòng)物體外生殖毒性機(jī)制研究，已由器官和細(xì)胞水平向著分子和基因水平方向發(fā)展，并且不斷深入［2］。目前，國(guó)內(nèi)外已創(chuàng)建了多種雌性生殖毒性體外研究方法，包括全胚胎培養(yǎng)技術(shù)和卵巢皮質(zhì)薄片培養(yǎng)方法、顆粒細(xì)胞、黃體細(xì)胞、卵泡體外培養(yǎng)方法。

雌性生殖系統(tǒng)十分復(fù)雜，其內(nèi)生殖器包括生殖腺（卵巢）、輸送管道（子宮、輸卵管和陰道）及附屬腺（前庭大腺），外生殖器即外陰［3］，這些器官的功能受下丘腦、垂體和卵巢之間的精確調(diào)節(jié)控制。卵巢具有生殖和內(nèi)分泌功能，是雌性下丘腦-垂體-性腺軸的中心器官。另外，卵巢激素還調(diào)控著雌性附屬性腺器官的上皮形態(tài)和生殖道體液的化學(xué)組成及黏性等［4］。因此，卵巢毒性是雌性生殖毒理學(xué)研究的重點(diǎn)。卵巢中主要構(gòu)成細(xì)胞有皮質(zhì)細(xì)胞、髓質(zhì)細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞、黃體細(xì)胞、卵泡細(xì)胞、門細(xì)胞等。目前，用于雌性生殖毒性體外研究的主要有卵巢顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞。

1 卵巢顆粒細(xì)胞

1.1 卵巢顆粒細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與作用 顆粒細(xì)胞（GC）是卵泡內(nèi)的最大細(xì)胞群，對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和閉鎖起著重要的作用。伴隨著卵泡的發(fā)育顆粒細(xì)胞也發(fā)生擴(kuò)張與增殖，顆粒細(xì)胞從扁平顆粒細(xì)胞向立方顆粒細(xì)胞變化，增殖力增強(qiáng)，形成多細(xì)胞層［5］。隨著卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞數(shù)目的增多，促性腺激素受體開始大量表達(dá)。在卵泡刺激素（FSH）的刺激下，顆粒細(xì)胞發(fā)生增殖、分化，分泌卵泡液，使卵泡生長(zhǎng)，并且細(xì)胞內(nèi)的芳香化酶被激活，增加雌激素的產(chǎn)生［6］。雌激素和FSH協(xié)同促進(jìn)顆粒細(xì)胞合成雌激素，維持著卵泡正常的生長(zhǎng)發(fā)育。排卵后，卵泡周圍的顆粒細(xì)胞分化成黃體細(xì)胞，黃體細(xì)胞分泌的激素對(duì)孕酮的分泌與妊娠具有重要作用［7］。

1.2 顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立 基于顆粒細(xì)胞重要的生理功能，顆粒細(xì)胞生殖學(xué)和毒理學(xué)研究在雌性生殖毒性研究中占有重要位置。1975年，Channing等［8］第一次發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞可發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的分化。近些年來(lái)，已建立了人、豬和大（?。┦蟮穆殉差w粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。對(duì)于人類來(lái)說(shuō)，體外研究的顆粒細(xì)胞主要來(lái)源于已經(jīng)接受體外受精（試管嬰兒）的患者，這些細(xì)胞的數(shù)量有限，生命有限，故體外培養(yǎng)人類顆粒細(xì)胞一直很困難［9］。實(shí)驗(yàn)室常采用未成年雌性大（?。┦螅は伦⑸湓旭R血清促性腺激素（PMSG）作用48 h，采用機(jī)械分離方法-卵泡穿刺［10-11］釋放卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。目前，不斷優(yōu)化的卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，為生殖毒性體外研究創(chuàng)造了良好的條件。

1.3 藥物對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞體外毒性研究 近年來(lái)，隨著對(duì)生殖毒性研究的深入，已發(fā)現(xiàn)有很多藥物對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞有明顯的毒性，如氯丙嗪、避孕藥及一些中藥等。

1.3.1 氯丙嗪：吩噻嗪類藥物，具有鎮(zhèn)靜、抗精神病、鎮(zhèn)吐、降溫等作用，主要用來(lái)治療人類的精神疾病。有關(guān)報(bào)道稱，氯丙嗪通過(guò)引起動(dòng)物和人類內(nèi)分泌系統(tǒng)的不良反應(yīng)而導(dǎo)致性功能障礙，使得卵巢功能降低。鄔靜等［12］進(jìn)行大鼠顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)，觀察不同劑量的氯丙嗪對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)隨著劑量的升高顯著抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的增殖及雌二醇的分泌。

1.3.2 避孕藥：主要是通過(guò)抑制排卵，改變子宮頸黏液，或是改變子宮及輸卵管的活動(dòng)方式達(dá)到避孕作用。研究表明［13］，抗孕激素米非司酮和18-甲基炔諾酮能明顯抑制大鼠離體培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞分泌孕酮，同時(shí)抑制人絨毛膜促性腺激素（HCG）誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分泌孕酮。

1.3.3 中藥：研究發(fā)現(xiàn)，很多中藥及中藥化學(xué)成分一定程度上會(huì)抑制卵巢顆粒的增殖和激素的分泌。天然多酚類物質(zhì)白藜蘆醇在高劑量下能抑制卵巢顆粒DNA的合成，降低雌激素的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF） mRNA及蛋白的表達(dá)［14］。烏頭類中藥的主要毒性成分烏頭堿，高劑量時(shí)可減少顆粒細(xì)胞數(shù)量，并引起細(xì)胞氧化損傷［15］。在加入莪術(shù)注射液進(jìn)行顆粒細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可觀察到細(xì)胞破碎，核中出現(xiàn)染色質(zhì)塊，細(xì)胞器基本消失［16］。此外，研究發(fā)現(xiàn)［17］，治療免疫性不育的復(fù)方中藥消抗安胎提取液能抑制大鼠離體培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞分泌雌二醇，其作用可能與該藥會(huì)抑制CAMP-PKA信息傳遞系統(tǒng)有關(guān)。

2 黃體細(xì)胞

2.1 黃體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與作用 黃體是排卵后卵巢中短暫存在的一個(gè)內(nèi)分泌組織，其主要功能是分泌孕酮，從而支持卵泡的著床，并維持妊娠。黃體實(shí)質(zhì)的主要部分是合成類固醇激素的黃體細(xì)胞，分為大黃體細(xì)胞（Large luteal cell，LLC）和小黃體細(xì)胞（Small luteal cell，SLC）。大的黃體細(xì)胞從卵泡顆粒細(xì)胞衍生而來(lái)，小的顆粒細(xì)胞由卵泡的膜細(xì)胞分化而來(lái)［18］。大小黃體細(xì)胞都能分泌孕酮，并且大黃體細(xì)胞還可以產(chǎn)生松弛素和催產(chǎn)素。此外，根據(jù)來(lái)源不同，將黃體細(xì)胞分為粒黃體細(xì)胞（Granulosa luteal cell）和膜黃體細(xì)胞（Theca luteal cell），粒黃體細(xì)胞主要分泌孕酮，膜黃體細(xì)胞一般位于黃體周邊，主要合成雌激素［19-21］。

2.2 黃體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立 黃體細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育與凋亡、退化是雌性生殖系統(tǒng)中重要的生殖調(diào)節(jié)過(guò)程。體外培養(yǎng)黃體細(xì)胞進(jìn)一步為研究生殖毒性及毒性機(jī)制提供了又一實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段。有研究者收集當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)處于排卵期?；蜇i的卵巢，經(jīng)過(guò)酶消化得到黃體細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室目前常采用未成年雌性大（小）鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG），促進(jìn)卵泡發(fā)育；48h后，頸部皮下注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），促進(jìn)排卵，使黃體形成；6天后，頸椎脫臼處死，取出卵巢，通過(guò)酶消化法進(jìn)行黃體細(xì)胞原代培養(yǎng)［22-23］。目前，通過(guò)對(duì)大（?。┦簏S體細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化，黃體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系越來(lái)越成熟。

2.3 藥物對(duì)黃體細(xì)胞體外毒性研究 黃體細(xì)胞的實(shí)質(zhì)功能是分泌孕酮等類固醇類激素，參與生殖系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。黃體分泌孕酮不足會(huì)引起諸多異常生殖結(jié)果，如早期流產(chǎn)、不孕等。故藥物對(duì)黃體細(xì)胞產(chǎn)生影響后，必將影響雌性生殖系統(tǒng)的正常功能。體外毒性研究表明，烏頭類中藥的毒性成分烏頭堿達(dá)到一定濃度時(shí)，可能通過(guò)影響黃體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，使得細(xì)胞數(shù)量減少，孕酮分泌量下降［24］。鄭利萍等［25］利用體外培養(yǎng)的黃體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)紫草多糖可直接作用于黃體細(xì)胞，并可能通過(guò)CGMP介導(dǎo)抑制HCG誘導(dǎo)黃體細(xì)胞分泌功能。

3 結(jié)語(yǔ)

目前，在生殖生物學(xué)和生理學(xué)中已建立了卵巢細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，該方法在藥物生殖毒性研究中主要用于較為明確的雌性生殖毒性機(jī)制研究。中藥組成成分復(fù)雜，產(chǎn)生毒性的機(jī)制也相當(dāng)復(fù)雜。中藥對(duì)雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的毒性研究仍主要以整體動(dòng)物研究為主，難以確切評(píng)定中藥的生殖毒性及機(jī)制。因此，卵巢細(xì)胞體外培養(yǎng)用于研究中藥對(duì)雌性生殖毒性是當(dāng)前一個(gè)熱點(diǎn)。

［1］《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.北京：國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局，2006.

［2］孫祖越，閆晗.生殖毒性研究［J］.毒理學(xué)雜志，2007，10，21（5）：

365-368.

［3］喬杰.生育力保護(hù)與生殖儲(chǔ)備［M］.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2013.12.

［4］萬(wàn)旭英.大、小鼠卵泡培養(yǎng)方法及其在雌性生殖毒性研究中的應(yīng)用［D］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2008.

［5］Da Silva-Buttkus P，Jayasooriya GS，Mora JM，et al.Effect of cell shape and packing density on granulosa cell proliferation and formation of multiple layer during early follicle development in the ovary［J］.J Cell Sci，2008，121（Pt23）：3890-3900.

［6］陳悅?cè)?，黃鳳荷.顆粒細(xì)胞增殖分化中卵泡刺激素的cAMP-PKA通路［J］.國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2011，30（1）：65-68.

［7］蔣天暐，竇環(huán)，趙光峰.microRNA調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的作用及機(jī)制研究進(jìn)展［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2012，30（5）：364-366.

［8］Channing CP，Ledwitz-Riqby F.Methods of assessing hormonemediated differentiation of ovarian cells in culture and in shortterm incubations［J］.Methods Enzymol，1975，39：183-230.

［9］Havelock JC，Rainey WE，Cart BR.Ovarian granulosa cell lines［J］. Mol Cell Endocrinol，2004，228 （1-2）：67-78.

［10］肖娟，鄔靜，屠迪.Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定［J］.中國(guó)老年保健醫(yī)學(xué)，2012，10（1）：8-11.

［11］Chowdhury I，Thompson WE，Welch C，et al.Prohibitin（PHB）inhibits apoptosis in rat granulosa cells （GCs） through the extracellular signal-regulated kinase 1/2 （EPK1/2） and the Bcl family of proteins［J］.Apoptosis，2013，18（12）：1513-1525.

［12］鄔靜，袁慧，彭雙清.氯丙嗪對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞分泌功能的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，37（5）：517-520.

［13］朱長(zhǎng)虹，熊忠明，肖惠珠，等.抗生育藥對(duì)大鼠培養(yǎng)顆粒細(xì)胞纖維蛋白溶酶原激活因子和孕酮分泌的影響［J］.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29（5）：400-401.

［14］Ortega I，Wong DH，Villanueva JA，et al.Effects of resve-ratrol on growth and function of rat ovarian granulosa cells［J］.Fertil Steril，201212，98（6）：1563-1573.

［15］劉強(qiáng)強(qiáng)，何曉娟，嚴(yán)光焰，等.烏頭堿對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞毒性研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，37（2）：299-301.

［16］魏美娟，王靜，俞瑾.藥物對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的影響［J］.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，27（6）：511-513.

［17］王春梅，張輝，倪江，等.中藥提取液對(duì)離體大鼠卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇（E-2）分泌的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2000，（2）：62-63.

［18］Yoshioka S，Abe H，Sakumoto R，et al.Proliferation of luteal steroidogenic cells in cattle ［J］.PLoS One，2013，8（12）：e84186.

［19］張華.5-HT對(duì)離體培養(yǎng)的山羊黃體細(xì)胞生長(zhǎng)的影響［D］.陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

［20］景明來(lái)，張曉金.黃體分泌孕酮的分子調(diào)控機(jī)制［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16（7）：1005-1007.

［21］常青，毛文智，王箏昱.哺乳動(dòng)物黃體的研究進(jìn)展［A］.科技創(chuàng)新與節(jié)能減排-吉林省第五屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）［C］.長(zhǎng)春：吉林省第五屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會(huì)，2008.589-591.

［22］張承玉，趙薇，程丹玲，等.離體培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中松弛素樣因子mRNA的表達(dá)及調(diào)節(jié)［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（1）：111-113.

［23］周濤.黃體細(xì)胞培養(yǎng)液和氯前列醇鈉對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響［D］.陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2009.

［24］龐凌煙，申蕃，何曉娟，等.烏頭堿對(duì)大鼠卵巢黃體細(xì)胞的毒性研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2010，25（3）：278-280.

［25］鄭利萍，陳瑩，劉穎，等.紫草多糖對(duì)HCG誘導(dǎo)大鼠黃體細(xì)胞分泌功能的影響［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（1）：86-90.

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1004-6879（2015）03-0247-03

2014-11-28）

（綜述講座欄目編輯：張玉亭）