Rho激酶抑制劑在視神經(jīng)損傷后修復(fù)再生的研究進(jìn)展＊

于江龍 綜述，欒新平 審校

（新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，烏魯木齊830063）

在視神經(jīng)的損傷過(guò)程中，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞因其自身逆行退化產(chǎn)生凋亡，同時(shí)其軸突在損傷后缺乏再生能力。既往研究認(rèn)為：視神經(jīng)無(wú)法在損傷之后再生，進(jìn)而因視神經(jīng)損傷后導(dǎo)致的視力損害也無(wú)法得到恢復(fù)［1］。已知視神經(jīng)纖維表面由少突膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成髓鞘細(xì)胞，故而視神經(jīng)與其他周圍神經(jīng)不同，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其組織學(xué)結(jié)構(gòu)類似于腦實(shí)質(zhì)和脊髓組織中白質(zhì)部分［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，RhoA／ROCK通路在中樞神經(jīng)軸突再生過(guò)程中，可以被少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白、Nogo－A和髓鞘相關(guān)糖蛋白等激活，從而抑制軸突再生［3］。作為目前唯一獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的Rho激酶抑制劑，法舒地爾對(duì)于RhoA／ROCK通路具有較強(qiáng)的抑制作用，進(jìn)而對(duì)于受損的神經(jīng)起到保護(hù)。目前，研究已證實(shí)，法舒地爾通過(guò)抑制Rho激酶，在心血管疾病、腦卒中和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均具有一定的作用［4］。本文主要針對(duì)以法舒地爾為代表的Rho激酶抑制劑在視神經(jīng)損傷后修復(fù)再生的機(jī)制和臨床應(yīng)用進(jìn)行探討，報(bào)道如下。

1 視神經(jīng)損傷后的修復(fù)再生機(jī)制

在外傷型中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，視神經(jīng)損傷屬于常見的損傷類型。在視神經(jīng)受損中，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞本身和軸突受損，其中，軸突受損包括軸突丟失和髓鞘丟失2個(gè)方面。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷以細(xì)胞器減少、消失，細(xì)胞質(zhì)萎縮，細(xì)胞核中染色質(zhì)濃集，保留細(xì)胞膜的表現(xiàn)為主［5］。上述表現(xiàn)主要存在于損傷后14d內(nèi)，特別是第3～14天，這是由于軸突因外力的直接壓迫產(chǎn)生迅速損傷，同時(shí)在節(jié)細(xì)胞周邊發(fā)生理化因子作用，產(chǎn)生生化反應(yīng)，導(dǎo)致節(jié)細(xì)胞短時(shí)間之內(nèi)大量壞死。近年來(lái)，關(guān)于影響視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究較多。主要影響因子包括，（1）Bax／Bcl－2基因：前者促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，而后者可以抑制凋亡信號(hào)傳遞，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，二者形成的異源二聚體在Bcl－2基因高表達(dá)時(shí)，可以有效抑制凋亡；反之則促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。（2）微管相關(guān)蛋白：該類蛋白主要作用于微管系統(tǒng)，在軸漿傳輸中具有重要作用，當(dāng)視神經(jīng)損傷之后，微管相關(guān)蛋白水平明顯下降，無(wú)法有效營(yíng)養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，導(dǎo)致該細(xì)胞凋亡［7］。（3）鈣離子和線粒體：當(dāng)線粒體膜表面的鈣離子通道失調(diào)之后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度顯著上升，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而在細(xì)胞凋亡中具有重要作用的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，線粒體膜通透性增加之后，釋放細(xì)胞色素C，上述級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，進(jìn)而促進(jìn)DNA酶解和細(xì)胞凋亡［8］。

視神經(jīng)損傷后能否有效再生，主要取決于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突能否再生。軸突再生受到多種因素影響，包括：（1）視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞自身的再生能力和拮抗損傷的能力。（2）再生環(huán)境中有無(wú)形成合適的細(xì)胞骨架，適合軸突修復(fù)。（3）再生環(huán)境中是否存在足夠的細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，常見的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等，上述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子用于引導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞再生，進(jìn)而促進(jìn)軸突再生［9］。（4）微絲蛋白和微管蛋白充分活化，利于細(xì)胞骨架形成［10］。（5）缺乏再生抑制因子的抑制作用，同時(shí)損傷的RGCs軸突未受外側(cè)膝狀體和上丘視頂蓋神經(jīng)元誘導(dǎo)［11］。其中，勿動(dòng)蛋白Nogo作為抑制中樞神經(jīng)髓鞘的重要因子，包括Nogo－A、Nogo－B和 Nogo－C，其中，主要的抑制因子為 Nogo－A，表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之內(nèi)，通過(guò)Nogo 66NgR信號(hào)通路發(fā)揮抑制軸突再生作用［12］。（6）減少膠質(zhì)瘢痕生成。目前，研究普遍認(rèn)為，由星形膠質(zhì)細(xì)胞在視神經(jīng)損傷之后形成的膠質(zhì)瘢痕可通過(guò)抑制軸突穿越而抑制視神經(jīng)再生；但另有研究認(rèn)為，抑制作用僅由成年反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，幼稚星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)軸突再生［13］。

2 RhoA／ROCK通路在視神經(jīng)損傷過(guò)程中的作用

RhoA／ROCK通路包括Rho激酶、Rho蛋白（即RhoA）和Rho激酶的效應(yīng)分子3部分。Rho蛋白屬于分子量較小的G蛋白，被稱為小G蛋白，包括RhoA、RhoB、RhoC 3種形式。Rho蛋白通過(guò)Rho－GTP活化形式和Rho－GDP非活化形式2種方式存在。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括腦梗死、蛛網(wǎng)膜下腔出血，心血管系統(tǒng)疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌梗死和肺動(dòng)脈高壓等疾病的發(fā)病機(jī)制中均具有重要作用。Rho激酶包括ROCKα和ROCKβ2種異構(gòu)體，屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族成員。Rho激酶通過(guò)其螺旋區(qū)C端和Rho蛋白結(jié)合，在RhoA／ROCK通路中，主要的效應(yīng)分子為Rho激酶，可以通過(guò)細(xì)胞黏附和整合素，或異源三聚體G蛋白耦聯(lián)受體（G protein coupled receprot，GPCR）2種途徑進(jìn)行激活。當(dāng)Rho蛋白處于激活狀態(tài)時(shí)，和螺旋區(qū)C端互相作用，激活Rho激酶。之后激活的Rho／Rac蛋白作用于下游效應(yīng)分子，主要為球蛋白輕鏈磷酸化酶（myosinlight chairiphosphase，MLCP），其肌球蛋白結(jié)合亞基在Rho激酶激活后被磷酸化，抑制球蛋白輕鏈磷酸化酶活性，產(chǎn)生平滑肌收縮和血管痙攣［14］。

神經(jīng)元突起生長(zhǎng)和分化是軸突在視神經(jīng)損傷后再生的基礎(chǔ)。在這一過(guò)程中，細(xì)胞骨架系統(tǒng)，包括微絲、微管、中間絲的生長(zhǎng)具有重要作用。RhoA在Rho－GTP活化形式形成之后，可以抑制神經(jīng)元突起形成，同時(shí)抑制絲狀偽足和板狀偽足形成，進(jìn)而達(dá)到抑制突起定向生長(zhǎng)和側(cè)枝形成的目的［15］。與此同時(shí)，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷之后，包括Nogo－A、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白和髓鞘相關(guān)糖蛋白等神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子激活RhoA／ROCK通路，進(jìn)而激活RhoA，RhoA通過(guò)取代Rho激酶螺旋區(qū)C端的自我抑制區(qū)，磷酸化肌球蛋白，同時(shí)抑制肌球蛋白磷酸酶激活，影響肌動(dòng)蛋白－肌球蛋白Ⅱ系統(tǒng)，形成應(yīng)力纖維，抑制軸突再生，進(jìn)而令神經(jīng)進(jìn)一步生長(zhǎng)［16］。另有研究顯示：激活RhoA／ROCK通路可通過(guò)啟動(dòng)磷酸化／去磷酸化效應(yīng)，重新分配細(xì)胞骨架，增大細(xì)胞間隙和收縮內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。

3 Rho激酶抑制劑（法舒地爾）在視神經(jīng)損傷中的作用機(jī)制

目前，研究的小分子Rho激酶抑制劑主要包括Y－27632和法舒地爾。其中，針對(duì)Y－27632的研究發(fā)現(xiàn)，在皮質(zhì)脊髓束損傷的大鼠模型中，Y－27632可通過(guò)抑制髓鞘相關(guān)抑制因子的底物作用，促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束再生。Y23672對(duì)于RhoA／ROCK通路的抑制作用主要在神經(jīng)元缺氧及再灌注的過(guò)程中抑制ROCKⅡ，令其在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)水平下降，避免其被激活后產(chǎn)生軸突回縮和細(xì)胞骨架重構(gòu)，提高神經(jīng)元活力，促進(jìn)軸突產(chǎn)生偽足，進(jìn)而促進(jìn)軸突生長(zhǎng)；同時(shí)Y23672還以和對(duì)ROCKⅡ相似的作用，作用于蛋白激酶C相關(guān)蛋白激酶PRK2，避免因PRK2表達(dá)令纖維組織母細(xì)胞肌動(dòng)蛋白壓力纖維發(fā)生斷裂，起到保護(hù)視神經(jīng)損傷后再生的作用［17］。

法舒地爾最初由日本學(xué)者在1995年用于緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血后產(chǎn)生的腦血管痙攣，在應(yīng)用14d后，實(shí)驗(yàn)組較安慰劑組血管痙攣發(fā)生率明顯降低，同時(shí)避免了鈣離子拮抗劑常見的低血壓不良事件的發(fā)生［18］。法舒地爾作為一種連接于磺酰基團(tuán)上，含有高哌嗪環(huán)和異喹啉生物堿的中性抑制劑，進(jìn)入體內(nèi)后，代謝產(chǎn)物為羥基法舒地爾，生成經(jīng)異喹啉生物堿－磺酰胺作用后的二甲基法舒地爾，較法舒地爾作用大大提高。

法舒地爾對(duì)于RhoA／ROCK通路的抑制作用主要通過(guò)和Rho激酶中ATP結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，起到對(duì)Rho激酶的抑制作用。在心血管疾病中，上述作用可通過(guò)增強(qiáng)肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性，起到舒張平滑肌細(xì)胞的效果；同時(shí)還可以激活內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS），增加體內(nèi)一氧化氮（NO）水平，有效舒張血管，增加器官供血，具有抗炎作用，避免梗死面積進(jìn)一步擴(kuò)大，同時(shí)增加已梗死區(qū)域的血流量，起到保護(hù)心肌的作用［19］。臨床研究顯示：相對(duì)于傳統(tǒng)鈣離子拮抗劑和硝酸酯類血管擴(kuò)張藥物，法舒地爾除了擴(kuò)張血管效果更佳之外，不易產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)可減少發(fā)作頻率，不影響患者血壓、心率等指標(biāo)，改善患者的生活質(zhì)量和運(yùn)動(dòng)耐量。在心力衰竭患者中，RhoA／ROCK通路被激活后，心房肥厚，心室擴(kuò)張，造成心功能下降；法舒地爾通過(guò)和Rho激酶中ATP結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制Rho激酶和Rho蛋白的過(guò)度表達(dá)，起到促進(jìn)心肌細(xì)胞收縮，同時(shí)擴(kuò)張血管，改善患者心功能的同時(shí)，避免改變心肌細(xì)胞中鈣離子濃度而產(chǎn)生不良反應(yīng)，臨床療效較好［20］。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，有關(guān)法舒地爾的作用研究目前主要集中于腦缺血后再灌注方面。腦缺血再灌注發(fā)生之后，由于腦白質(zhì)供血?jiǎng)用}具有細(xì)長(zhǎng)、缺少分支血管的特點(diǎn)，容易在缺血、缺氧的情況下產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。腦白質(zhì)的主要損傷部分為軸突和少突膠質(zhì)細(xì)胞，后者在軸突周圍包繞形成髓鞘，在腦部缺血過(guò)程中，受到活化增生的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞影響，大量損傷死亡，損害髓鞘結(jié)構(gòu)，令其致密性和穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致髓鞘脫失，軸突在缺乏保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)的情況下，發(fā)生變性；與此同時(shí)，少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突受到缺血缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的大量由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子和氧自由基損傷，進(jìn)一步損害腦白質(zhì)［21］。在腦缺血的發(fā)生過(guò)程中，Rho激酶抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性，持續(xù)收縮平滑肌細(xì)胞，導(dǎo)致腦血管處于持續(xù)痙攣狀態(tài)，同時(shí)損傷神經(jīng)元細(xì)胞，導(dǎo)致腦組織受到不可逆損害。法舒地爾通過(guò)抑制Rho激酶，增加eNOS活性，促進(jìn)NO合成，舒張平滑肌細(xì)胞，抑制炎癥細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，對(duì)于軸突再生和神經(jīng)元起到保護(hù)作用［22］。在蛛網(wǎng)膜下腔出血和椎基底動(dòng)脈供血不足等常見腦血管疾病中，法舒地爾同樣起到抑制Rho激酶的作用，進(jìn)而舒張平滑肌細(xì)胞，擴(kuò)張腦血管，促進(jìn)軸突再生，起到保護(hù)腦組織的作用［23］。研究顯示，對(duì)于發(fā)病48h內(nèi)的腦卒中患者采用法舒地爾進(jìn)行治療，可以改善患者的預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組患者治療后的運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能顯著優(yōu)于對(duì)照組，提示法舒地爾可以和傳統(tǒng)抗血小板藥物如氯吡格雷、他汀類藥物和依達(dá)拉奉等改善腦神經(jīng)藥物共同使用，可能在保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)軸突再生中起到一定療效［24］。

多項(xiàng)針對(duì)大鼠脊髓損傷模型的研究顯示，在脊髓損傷之后，體內(nèi)RhoA／ROCK通路被軸突生長(zhǎng)抑制物如少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白、髓鞘相關(guān)糖蛋白和Nogo－A激活，進(jìn)而ROCKⅠ和ROCKⅡ大量表達(dá)，抑制軸突在損傷后再生；而由于軸突生長(zhǎng)抑制物表達(dá)存在時(shí)間較長(zhǎng)，故而RhoA／ROCK通路激活可長(zhǎng)期維持，導(dǎo)致急性脊髓損傷轉(zhuǎn)為慢性脊髓損傷［25］。在上述損傷機(jī)制中，軸突生長(zhǎng)抑制物促進(jìn)RhoA／ROCK通路激活之后，影響肌動(dòng)蛋白－肌球蛋白系統(tǒng)，抑制軸突再生，法舒地爾可以通過(guò)抑制Rho激酶，起到抑制RhoA的作用，進(jìn)而抑制通路中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，抑制RhoA／ROCK通路激活對(duì)于神經(jīng)再生的阻斷作用。與此同時(shí)，Rho激酶抑制劑，包括Y－27632和法舒地爾，均可以在急性期擴(kuò)張局部損傷區(qū)域血管，起到保護(hù)神經(jīng)組織的作用，促進(jìn)局部脊髓損傷區(qū)域血流恢復(fù)和軸突生長(zhǎng)，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)纖維恢復(fù)生長(zhǎng)和功能［26］。相對(duì)于RNA干預(yù)沉默RhoA基因這一技術(shù)要求高、價(jià)格昂貴的治療方式，法舒地爾治療效果更佳，給藥方便，更適合臨床推廣。在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的過(guò)程中，法舒地爾可通過(guò)抑制Rho激酶，促進(jìn)重建細(xì)胞骨架和細(xì)胞分化啟動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)軸突形成，利于干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化［27］。另有研究顯示，在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過(guò)程中，法舒地爾對(duì)于神經(jīng)元軸突、樹突的形成和神經(jīng)元分化效率的提高具有促進(jìn)作用，認(rèn)為這和法舒地爾抑制了RhoA／ROCK通路激活之后造成的細(xì)胞骨架重排和神經(jīng)突起的回縮，避免軸突生長(zhǎng)錐產(chǎn)生塌陷，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元分化和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有關(guān)［28］。

4 總結(jié)與展望

以法舒地爾為主的Rho激酶抑制劑通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Rho激酶中ATP結(jié)合位點(diǎn)，抑制RhoA／ROCK通路，避免RhoA／ROCK通路激活后產(chǎn)生對(duì)軸突再生的抑制作用。在視神經(jīng)損傷后再生的過(guò)程中，和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)微絲等軸突再生的促進(jìn)因素共同作用，抑制包括Nogo蛋白、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白等啟動(dòng)RhoA／ROCK通路，進(jìn)而促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生和視神經(jīng)損傷后的早期、快速修復(fù)作用［29］。

目前，多項(xiàng)研究證實(shí)，Rho激酶抑制劑對(duì)于視神經(jīng)損傷后修復(fù)作用具有一定的應(yīng)用價(jià)值，但由于Rho激酶在多種組織和器官中廣泛分布，而目前的Rho激酶抑制劑對(duì)于Rho激酶的抑制作用缺乏特異性，故而在今后的Rho激酶抑制劑研究中，藥物選擇性應(yīng)成為研究的重點(diǎn)［30］。

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