硫化氫與缺血性卒中關(guān)系的研究進(jìn)展

陳秋霞 綜述，晏 勇審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 400016）

硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是近年來發(fā)現(xiàn)的第3種新型內(nèi)源性氣體信號分子，與一氧化氮和一氧化碳一樣，可參與血管張力的調(diào)節(jié)。目前很多研究提示H2S 可通過抗氧化應(yīng)激、抗炎及抗細(xì)胞凋亡等作用，減少卒中對腦組織的損傷?，F(xiàn)就H2S的生理功能，以及H2S與缺血性卒中關(guān)系的研究進(jìn)展綜述如下。

1 H2S的生理功能

生物體內(nèi)H2S主要由3種酶合成：胱硫醚β合成酶（cystathionineβ-synthase，CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγlyase，CSE）和巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶（mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST）。H2S的生理功能主要是通過興奮血管平滑肌、神經(jīng)細(xì)胞、心肌及胰腺細(xì)胞的ATP敏感性鉀離子通道參與血管緊張度、心肌收縮力、神經(jīng)傳遞、胰島素分泌的調(diào)節(jié)［1］。以下主要介紹H2S的舒張血管、抗氧化應(yīng)激、減輕炎性反應(yīng)及抗細(xì)胞凋亡等生理功能。

1.1 H2S對血管緊張度的影響 內(nèi)源性H2S在腦組織中主要經(jīng)CBS催化形成，MPST 主要分布于腦和紅細(xì)胞中，而CSE主要分布在心肌組織和血管組織中。Al-Magableh 等［2］實(shí)驗(yàn)證實(shí)L-半胱氨酸-CSE-H2S通路有助于血管舒張和調(diào)節(jié)基底血管張力。另外，H2S還可以通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮源性舒張因子，從而產(chǎn)生舒血管效應(yīng)［3］。Chitnis等［4］通過比較在氟比洛芬（環(huán)氧合酶抑制劑）缺乏和存在情況下，新型H2S供體GYY4137對苯腎上腺素預(yù)收縮血管的藥理作用，發(fā)現(xiàn)GYY4137在100nmol至100μmol的濃度范圍對苯腎上腺素誘導(dǎo)的血管緊張度的舒張作用呈濃度依賴性，IC50值為（13.4±1.9）μmol／L（n＝6）。此外格列本脲（KATP通道阻斷劑）能顯著衰減GYY4137 對牛睫狀動(dòng)脈的舒張作用（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)所觀察到的GYY4137的血管平滑肌舒張作用，至少部分間接地由KATP通道介導(dǎo)。推測H2S可通過KATP通道介導(dǎo)舒張血管作用。Ellis等［5］發(fā)現(xiàn)基因KCNJ8和ABCC9分別通過編碼Kir6.1 和SUR2B 亞單位調(diào)節(jié)收縮壓與舒張壓，從而調(diào)控血壓，而H2S可刺激Kir6.1 和SUR1 表達(dá)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，因此推測H2S發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)可能與SUR 亞基有關(guān)［6］。在血管外周脂肪組織（perivascular adipose tissue，PVAT）中H2S由CSE 催化合成，并負(fù)責(zé)PVAT 對鄰近血管的舒張作用［7］。這些結(jié)果表明，H2S可通過作用于內(nèi)皮細(xì)胞、KATP通道、PVAT 等達(dá)到舒張血管的生物效應(yīng)。

1.2 H2S抗氧化應(yīng)激作用 神經(jīng)細(xì)胞缺血、缺氧時(shí)，通常伴隨著氧化應(yīng)激，其中產(chǎn)生的活性氧自由基（ROS）會降低谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLT-1）的表達(dá)。Meng等［8］用氯化鈷誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞，建立化學(xué)性缺氧模型，探討在組織缺氧時(shí)熱休克蛋白90（HSP90）在H2S 介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)中的作用。該研究發(fā)現(xiàn)，H2S可上調(diào)HSP90，減少PC12細(xì)胞的凋亡，而HSP90的抑制劑可逆轉(zhuǎn)該作用，增加PC12細(xì)胞的凋亡和ROS的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)表明：H2S可通過HSP90介導(dǎo)的抗氧化和抗細(xì)胞凋亡對抗缺氧對組織的損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用。Lan等［9］用氯化鈷處理誘導(dǎo)化學(xué)缺氧損傷的PC12細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)H2S可逆轉(zhuǎn)GLT-1的減少，并通過活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)kinasel1／2和興奮p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）阻斷ROS。在此基礎(chǔ)上，Xiao等［10］用ROS清除劑和MEK1／2抑制劑預(yù)處理氯化鈷誘導(dǎo)化學(xué)缺氧損傷的PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者與H2S具有相同的治療效果，均可逆轉(zhuǎn)GLT-1的減少。因此，推測H2S在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷中通過抗氧化應(yīng)激作用起到保護(hù)效果。

1.3 H2S減輕炎性反應(yīng)及抗細(xì)胞凋亡 近年體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)H2S或其供體硫氫化鈉（NaHS）可作為促炎因子加重全身炎性反應(yīng)，但隨著對H2S的不斷關(guān)注，其在各系統(tǒng)的抗炎及抗細(xì)胞凋亡作用研究也相繼報(bào)道。在炎性反應(yīng)及組織損傷中，機(jī)體可通過調(diào)整H2S的合成和降解，從而促進(jìn)修復(fù)和重建內(nèi)環(huán)境。新型H2S釋放藥物顯示出增強(qiáng)的抗炎和促恢復(fù)作用，同時(shí)具有降低藥物在許多組織中產(chǎn)生的不利影響［11］。H2S可通過抑制H2S促炎因子釋放，使IL-1β、ICAM-1基因和NFkBp65蛋白表達(dá)下降，IL-10 mRNA 基因表達(dá)增高，減輕炎性反應(yīng)。同時(shí)H2S可以抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。Sivarajah 等［12］為了研究NaHS對缺血面積及細(xì)胞凋亡的影響，造模心肌缺血-再灌注（I／R）小鼠模型。該實(shí)驗(yàn)提出NaHS可通過抗炎及抗凋亡作用，在心肌I／R 中保護(hù)心肌組織。H2S抗炎作用是通過以下調(diào)節(jié)完成的：促進(jìn)p38 和Jun 磷酸化、NFκBp65的核轉(zhuǎn)位、PMN募集、ICAM-1表達(dá)。而NaHS的 心 肌保護(hù)作用可被5-羥葵酸（線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道阻滯劑、ATP阻滯劑）阻斷。推測其抗凋亡作用可能部分是由于線粒體KATP通道的開放。

2 H2S與卒中的關(guān)系

H2S是一種新型的神經(jīng)遞質(zhì)，其可通過作用各種不利因素調(diào)節(jié)神經(jīng)、心臟、免疫系統(tǒng)，從而降低腦血管或腦實(shí)質(zhì)損傷。在缺血性刺激中，海馬結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元損傷比較敏感，輕微損傷就會導(dǎo)致嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶障礙。Wen等［13］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在人為誘發(fā)的缺血性卒中鼠里，H2S可通過增加蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的磷酸化、抑制凋亡信號調(diào)節(jié)蛋白1（Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）和c-Jun氨基末端激酶3（c-Jun N-terminal kinase 3，JNK3）的磷酸化，提高海馬神經(jīng)元的存活率、減輕學(xué)習(xí)和記憶障礙。

以探討外源性H2S對全腦I／R 的影響為目的，Yin等［14］造模24hI／R 小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與I／R 組比較，給予0.2、0.4μmol／kg NaHS預(yù)處理組的卒中指數(shù)、神經(jīng)癥狀評分、腦梗死面積均顯著下降，且呈劑量依賴性。高濃度組（0.4μmol／kg）的缺血面積明顯小于低濃度組（0.2μmol／Kg），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)提示外源性H2S在I／R 中對腦組織有保護(hù)作用。Li等［15］完成了H2S與缺血性卒中相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究。將實(shí)驗(yàn)小鼠組分為6組，給予不同濃度NaHS干預(yù)，再將其中3組小鼠造模急性腦梗死，測定其梗死面積。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果 顯 示：空 白 組、空 白＋低 濃 度NaHS （2.8 mg／kg NaHS）、空白＋高濃度NaHS（11.2mg／kg NaHS）這3組的梗死面積沒有明顯差別。而與空白組相比較，實(shí)驗(yàn)組梗死面積與NaHS濃度明顯相關(guān)，其梗死面積依次為：梗死組＋高濃度NaHS＞梗死組＞梗死組＋低濃度NaHS。通過該實(shí)驗(yàn)可推測低濃度（2.8mg／kg）外源性H2S可減小缺血性卒中的缺血面積，相反高濃度（11.2mg／kg）會增加其缺血面積，說明外源性H2S在缺血性卒中治療中有一定的潛在價(jià)值。Pan等［16］試圖探討在小鼠心搏驟停-復(fù)蘇24h后外源性H2S供體NaHS對腦線粒體的影響。實(shí)驗(yàn)組在做心肺復(fù)蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）之前的1min注射NaHS（0.5mg／kg），并持續(xù)靜脈注入NaHS（1.5mg·kg-1·h-1）3h，在CPR 24h后測定神經(jīng)功能缺損狀態(tài)。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂明顯得到改善。實(shí)驗(yàn)還觀察到NaHS治療能減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成和鈣超載，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，保持線粒體膜電位升高ATP 的水平，改善了細(xì)胞色素C 的異常分布。這提示外源性H2S在心臟驟停-再灌注中可通過保護(hù)線粒體功能減少缺血對腦組織的損傷。

為了探討內(nèi)源性H2S及外源性H2S與大腦缺血-全腦再灌注的關(guān)系，Ren等［17］通過實(shí)驗(yàn)了解大鼠全腦I／R 中不同時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)源性H2S濃度變化，以及了解給予不同濃度外源性H2S預(yù)處理后全腦I／R 腦密度的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在全腦I／R 后12h測得內(nèi)源性H2S較對照組明顯增加，而24h明顯降低。給予高濃度外源性H2S（180μmol／kg NaHS）預(yù)處理，并不能減少全腦I／R 的損傷，反而低濃度（25μmol／kg NaHS）的外源性H2S在全腦I／R 中能保護(hù)腦組織。

以上實(shí)驗(yàn)說明內(nèi)源性H2S在卒中后12h內(nèi)濃度明顯增加，而在24h后逐漸降低。在卒中小鼠模型中，低濃度外源性H2S可減輕腦I／R 對腦組織的損傷，而高濃度H2S使其惡化。因此猜想，在卒中后12h內(nèi)減少內(nèi)源性H2S生成、或給予低濃度外源性H2S可能會更有效的減輕卒中后腦組織的損傷，這為缺血性卒中的預(yù)防、治療提供了一新思路。

3 H2S減輕缺血性卒中對腦組織損傷的相關(guān)機(jī)制探討

3.1 H2S減弱氧化應(yīng)激 Sahach等［18］在離體心臟I／R 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與I／R 組比較，L-半胱氨酸（內(nèi)源性H2S的前體）預(yù)處理組，可對抗DL-炔丙基甘氨酸（CSE 抑制劑）的阻滯作用，顯著的恢復(fù)心臟功能和改善氧代謝效率，并伴隨著很少的線粒體釋放因子。通過該實(shí)驗(yàn)可推測CSE／H2S系統(tǒng)參與心肌I／R 的內(nèi)源性防御系統(tǒng)，且DL-炔丙基甘氨酸與L-半胱氨酸聯(lián)合運(yùn)用可阻礙線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放。Yin等［14］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在I／R 組中丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度明顯高于正常組，而給予不同劑量H2S治療后，可呈劑量依賴性降低MDA 水平。相反的，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性在I／R 組明顯降低，而這種活性降低程度可被H2S減弱。在I／R 組腦組織中，還原型輔酶Ⅱ氧化酶亞單位（p47phox和gp91phox）的mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，而H2S可呈劑量依賴性的抑制這種基因表達(dá)上調(diào)。表明H2S可通過減輕I／R 引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而保護(hù)腦組織。Li等［15］在急性腦梗死小鼠模型中發(fā)現(xiàn)：與空白組比較，梗死組中線粒體SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性均降低，而MDA 水平增加；而與梗死組比較，梗死＋低濃度NaHS 組中SOD、GSH-PX活性明顯提高，MDA 水平明顯下降。梗死＋低濃度NaHS組的梗死面積明顯小于梗死組。通過以上實(shí)驗(yàn)，可推測H2S可通過增強(qiáng)SOD 和GSH-PX活性，降低MDA 水平，增強(qiáng)線粒體活力，降低線粒體膜腫脹度，明顯改善缺血腦組織損傷。

3.2 H2S減輕炎性反應(yīng) H2S 是半胱氨酸（Hcy）的代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)效的抗氧化和抗炎活性，在探索H2S對Hcy誘發(fā)的小鼠神經(jīng)變性及神經(jīng)血管功能障礙影響中。Kamat等［19］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hcy誘導(dǎo)小鼠組與對照組相比較，腦組織中MDA、乙酰膽堿酯酶的水平明顯增加，而還原型谷胱甘肽（GSH）水平明顯減少，但在給予NaHS組，MDA 的增加及GSH 的減少均可被抑制，然而乙酰膽堿酯酶的增加不能被抑制，這提示H2S可通過降低氧化還原反應(yīng)，特異性抑制Hcy的作用，從而保護(hù)腦組織。Yin等［14］證實(shí)在大腦I／R 腦組織中腫瘤壞死因子-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1水平比空白組明顯增加，而IL-10水平降低，但這種增加或降低在H2S治療組可被逆轉(zhuǎn)。提示H2S可通過抑制腦組織I／R 引起的炎性反應(yīng)，減少腦組織損傷。

3.3 H2S抗細(xì)胞凋亡 最近的研究表明，H2S可以通過抑制ROS的產(chǎn)生拮抗細(xì)胞凋亡，從而提高細(xì)胞的存活率［20-21］。為了探討H2S對氧糖剝奪／復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation／reoxygenation，OGD／R）誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的潛在影響及其可能的影響機(jī)制，Luo等［22］對離體的小鼠神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（1）在培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中，NaHS可以阻止OGD／R 誘導(dǎo)ROS的升高及Caspase-3的活化。（2）ROS清除劑N-乙?；?L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）可以防止OGD／R 誘導(dǎo)Caspase-3的活化。（3）NaHS和NAC 都能對抗OGD／R 誘導(dǎo)的線粒體膜電位的下降（mitochondria membrane potential，MMP）。（4）NaHS、NAC 或Cospase-3抑制劑C20H30N4O11（N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-CHO，DEVD-CHO）能顯著抑制OGD／R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。這些數(shù)據(jù)表明，H2S可以通過改善線粒體功能障礙和抑制ROS-活化的Caspase-3信號通路來阻止OGD／R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。Yin等［14］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在I／R 組中抑制凋亡作用的蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下降，H2S治療組Bcl-2合成顯著增加。相反I／R 腦組織中促進(jìn)凋亡作用的蛋白Bax水平明顯增加，而這種增加可以被H2S減弱。通過以上實(shí)驗(yàn)表明H2S可通過改善線粒體功能障礙、抑制ROS-活化的Caspase-3信號通路、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)及下調(diào)Bax起到抗細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而在發(fā)生缺血性卒中時(shí)保護(hù)腦組織。

4 展 望

4.1 H2S誘導(dǎo)的低溫環(huán)境對卒中后腦組織的保護(hù)作用 近年，有報(bào)道將小鼠暴露于室溫為13℃充滿H2S的密室里，H2S可通過將小鼠體溫降至15 ℃，而保持假死狀態(tài)。通過改良該試驗(yàn)方法，F(xiàn)lorian 等［23］將卒中后成年鼠暴露于H2S誘導(dǎo)的低溫環(huán)境里，48h后發(fā)現(xiàn)梗死面積減少50%，并且未發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)學(xué)和生理學(xué)的不良反應(yīng)。Florlan等［24］在此基礎(chǔ)上確定膜聯(lián)蛋白A1（annexin A1，ANXA1）為卒中后促炎性蛋白的主要上調(diào)因子之一，通過RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)與在H2S誘導(dǎo)低溫下治療的動(dòng)物相比，未經(jīng)治療的中風(fēng)動(dòng)物ANXA1的mRNA 表達(dá)上調(diào)了三倍。推測在中風(fēng)后的成年大鼠大腦中，長時(shí)間暴露于低溫狀態(tài)下，可降低卒中后ANXA1的表達(dá)，從而減少吞噬作用，進(jìn)而在卒中后有保護(hù)腦組織的作用。該實(shí)驗(yàn)顯示將卒中后成年鼠暴露于H2S誘導(dǎo)的低溫環(huán)境里，其體溫逐漸下降，約8 h后穩(wěn)定在（31.0±0.5）℃。48h 后將該鼠放回正常大氣壓下，其可在數(shù)分鐘內(nèi)恢復(fù)，且沒有任何神經(jīng)或生理缺失。在成年鼠卒中后暴露于H2S下，可有效降低整個(gè)體溫，并給予神經(jīng)保護(hù)。Florian 等［23］研究顯示在大鼠中延長H2S介導(dǎo)的低體溫狀態(tài)是一個(gè)有效減少卒中對大腦損傷的方法。故推測長期低溫治療可能是保護(hù)老年人大腦免受卒中后腦損傷的一個(gè)可行的臨床方法。

4.2 卒中新治療方法——增加外源性H2S生成，減少內(nèi)源性H2S生成 為了研究高半胱氨酸可能會增加卒中后腦缺血性損傷這一假說，Wong等［25］在卒中發(fā)生后的24h內(nèi)測定卒中患者的血漿胱氨酸水平，3月后根據(jù)預(yù)后結(jié)果，將其分為3組，預(yù)后好組（11例）、預(yù)后差組（20例）、死亡組（5例），其濃度分別為（61±12）mmol／L，（67±9）mmol／L，（82±14）mmol／L（P＜0.01）。該實(shí)驗(yàn)提示在卒中患者中，高半胱氨酸可能反射性引起H2S的生成增加，導(dǎo)致卒中者預(yù)后不良，因此，推測抑制內(nèi)源性H2S的形成可能是急性卒中的一種新的治療方法。在卒中鼠模型中，半胱氨酸呈劑量依賴性增加梗死面積，這個(gè)效應(yīng)可被CBS抑制劑解除，而CBS是將半胱氨酸轉(zhuǎn)換成H2S的酶，由此推測H2S可能參與缺血性腦損傷的調(diào)節(jié)。H2S過度生成可導(dǎo)致炎性疾病、感染性休克、腦卒中及Down綜合征患者的精神發(fā)育遲緩，故減少H2S的過度生成可能是治療這些疾病的潛在靶點(diǎn)［1］。

另一方面，H2S在線粒體中通過硫醌氧化還原酶（sulfide：quinone oxidoreductase，SQR）生成過硫化物。Be?towski等［7］研究發(fā)現(xiàn)親脂性他汀類藥物阿托伐他汀可通過損耗泛醌類物質(zhì)，抑制H2S 在線粒體的氧化結(jié)果，從而增加PVAT 源性H2S［7］，這提示親脂性他汀類藥物可通過增加內(nèi)源性H2S產(chǎn)生一定的治療價(jià)值。

綜上所述，目前研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S對缺血性卒中有一定的保護(hù)性，其機(jī)制與降低MDA、增加SOD 活性、特異性抑制Hcy的作用、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax等有關(guān)。隨著對其研究范圍的進(jìn)一步深入和擴(kuò)大，運(yùn)用其減輕缺血性卒中腦組織損傷從而防治缺血性卒中的前景將會非常廣闊。但由于高濃度的外源性H2S會惡化卒中后腦組織的損傷，臨床應(yīng)用外源性H2S治療缺血性卒中值得進(jìn)一步研究。而在卒中發(fā)生后，機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的機(jī)制目前尚未明確，抑制卒中后內(nèi)源性H2S的生成在卒中治療中存在潛在價(jià)值。

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