CAG-PLGC實驗動物模型的回顧和評價

林鐘宇，趙金媛，潘華峰，李海文，葉曉憲

(廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006)

綜 述

CAG-PLGC實驗動物模型的回顧和評價

林鐘宇，趙金媛，潘華峰，李海文，葉曉憲

(廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006)

胃癌前病變；慢性萎縮性胃炎；動物模型

胃癌前病變(PLGC)是一個病理性概念，是指更容易發(fā)生癌變的組織病理變化，包括胃黏膜中、重度不完全性結(jié)腸型腸上皮化生(IM)和異型增生(Dys)，是從正常胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)化過程中的一個重要階段[1]。慢性萎縮性胃炎(CAG)，是以胃黏膜上皮和腺體萎縮，數(shù)目減少，胃黏膜變薄，黏膜基層增厚，或伴幽門腺化生和腸腺化生，或有不典型增生為特征的慢性消化系統(tǒng)疾病[2]，屬于祖國醫(yī)學中“痞滿”“胃脘痛”“心下痞”“胃痞”范疇，就目前而言，出現(xiàn)胃癌前病變的絕大多數(shù)誘因是慢性萎縮性胃炎的進一步癌變發(fā)展，因此，世界衛(wèi)生組織將其列為胃癌前狀態(tài)。目前，醫(yī)學界廣泛認可這種由慢性淺表性胃炎→胃黏膜萎縮→腸上皮化生→異型增生→胃癌的發(fā)病模式[3]。而目前對該疾病研究主要是以建立各種CAG-PLGC動物模型為切入點和人為快速有效制作因素為主要介入手段，復制出CAG以及病理上腸腺化生、不典型增生等胃癌前病變的動物模型，對CAG的發(fā)病機制、預防胃癌的發(fā)生及阻斷或逆轉(zhuǎn)具有惡變潛能的胃癌前病變均具有重要的意義。但是，目前CAG-PLGC動物模型仍存在耗時長，耗資源多，技術(shù)參數(shù)較高等缺點，因此，尋找并建立更符合人類發(fā)病機制的動物模型是具有重要意義。本文就近年通過幽門螺桿菌(H.pylori)感染法、MNNG等化學致癌法、手術(shù)法、熱鹽水等物理損傷方法建立的CAG-PLGC動物模型研究進展進行回顧概述及評價反思，旨在為今后進一步完善CAG-PLGC動物模型及開展相關(guān)研究提供幫助。

1 各個實驗動物造模方法介紹

1.1H.pylori感染引起的CAG-PLGC動物模型H.pylori是慢性胃炎、消化性潰瘍等的重要病因，目前全球約有一半人數(shù)以上感染，它主要通過寄居在胃部感染引起胃黏膜炎癥，并通過上述的慢性淺表性胃炎→胃黏膜萎縮→腸上皮化生→異型增生的發(fā)生機制使胃黏膜癌變最終導致胃癌[3]。此外，WHO也宣布H.pylori為微生物型的致癌物質(zhì)，所以，建立由H.pylori感染引起的CAG-PLGC的動物模型更準備模擬人類感染H.pylori的機制是有必要的。

張榮光等[4]使用的是H.pylori菌株(NCTC11637)感染昆明小鼠(KM小鼠)模型。實驗組每只小鼠灌喂H.pylori菌液200μL(含菌5×108CFU)，間隔2d，共感染3次。距末次灌喂菌液8周后, 處死所有小鼠后均發(fā)現(xiàn)實驗組在胃部的H.pylori全部定植，且在病理學檢查發(fā)現(xiàn)實驗組胃黏膜有組織炎癥反應并出現(xiàn)不同程度的萎縮。

曾志榮等[5]使用的是H.pylori菌株(Syndeystrain1,SS1)感染W(wǎng)istar大鼠腺胃，使用布氏肉湯洗脫H.pylori菌落對實驗組20只Wistar大鼠進行灌胃，1.5mL/只，連續(xù)5次，1周完成,而對照組動物則不作相應處理。4周時所有實驗組動物胃竇、胃體產(chǎn)助檢查均陽性,SS1主要定值于胃竇的胃小凹及腺腔,胃體較少且其定植量隨感染時間的延長有增加的趨勢,至24周時仍有明顯定植；對照組動物未有H.pylori定植。病理組織學檢查,4周時動物未見炎癥反應,至8周、12周和24周胃竇及胃體出現(xiàn)輕至中度慢性活動性胃炎,在本實驗周期內(nèi)未見萎縮性炎癥改變,對照組動物無炎癥反應。

唐旭東等[6]根據(jù)上述造模方法進行改良，在模型實驗組中每只灌胃抗生素混合溶液3d，第4天起給予吲哚美辛預處理，隔日大鼠灌胃50g/L碳酸氫鈉溶液后灌胃H.pylori菌懸液6次。灌胃前后分別禁食12h及4h。間隔4周后大鼠灌胃水楊酸鈉和乙醇混合溶液，灌胃前后1h禁食、禁水，共給藥8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型實驗組胃竇黏膜變薄，固有層腺體中度減少伴有中度慢性活動性炎癥。這可證明采用H.pylori感染大鼠加上水楊酸鈉與乙醇混合溶液灌胃的方法建立H.pylori感染CAG-PLGC大鼠模型。

1.2 以氨水為基礎(chǔ)的綜合性動物造模法 以氨水為主的CAG-PLGC動物模型造模法是指采取讓SD或是Wistar大鼠自由飲用氨水，其目的是讓動物在不同濃度氨水長期刺激下，可使胃黏膜的屏障破壞及腺體萎縮，且胃幽門竇萎縮得更明顯，并伴有胃黏膜上皮細胞脫落和細胞增殖亢進，這就等同模擬在具有較強的尿素酶活性H.pylori的感染下，通過尿素酶水解尿素大量產(chǎn)生氨，在持續(xù)高氨狀態(tài)下破壞胃部環(huán)境，造成胃部各部分組織不同程度的萎縮，同時也是對胃癌發(fā)生起助催化的作用。李秋娟等[7]用0.2mL/L的氨水作為日常飲用液體給予大鼠自由飲用16周,經(jīng)病理證實胃竇組織部分有萎縮并有炎癥反應，成功復制CAG-PLGC模型。

朱曉玲等[8]以自由飲用0.01%和0.025%氨水分別長期刺激大鼠胃部24周，成功造出CAG-PLGC模型并發(fā)現(xiàn)大鼠胃黏膜屏障的破壞、PAS陽性物質(zhì)的減少及腺體的萎縮和部分上皮的腸上皮化生。

但是以單純氨水刺激的動物造模已經(jīng)不足以模擬人類多因素所致的CAG-PLGC，因此，在近十年來，許多學者在以自由飲用氨水的基礎(chǔ)上再加上其因素成功制作模擬多因素致病的CAG-PLGC動物模型，蘇劍東等[9]利用0.05%氨水自由飲用以及50 ℃脫氧膽酸鈉(20mmol/L)，60%乙醇空腹灌胃刺激雄性Wistar大鼠胃黏膜24周經(jīng)病理發(fā)現(xiàn)胃部腺體萎縮并有部分出現(xiàn)癌前病變，成功建立CAG-PLGC模型。劉希等[10]以0.1%氨水自由飲用再加上每周2次空腹60～70 ℃熱鹽糊、4 ℃冰鹽水冷熱交替灌胃和每周60%乙醇、常溫20mmol/L脫氧酸鈉和2%水楊酸鈉混合溶液灌胃3次,三因素聯(lián)合作用刺激SD大鼠胃黏膜24周并間斷喂食,經(jīng)過病理監(jiān)測成功建立典型大鼠CAG-PLGC模型，有癌前病變傾向，但是癌變?nèi)孕枰嗟臅r間繼續(xù)造模。

1.3 以N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)法基礎(chǔ)的綜合性動物造模法MNNG是一種強力的化學致癌試劑，不依賴于酶的代謝作用，直接作用于胃腸道黏膜，其中致癌機制是直接靶定DNA而誘發(fā)細胞產(chǎn)生遺傳毒性。以MNNG法為主的動物模型主要是模擬人類不當攝入硝酸鹽在胃內(nèi)轉(zhuǎn)化為亞硝酸胺等致癌物質(zhì)，作用于胃黏膜，從而引起胃黏膜萎縮，腸上皮化生甚至發(fā)生癌變，且經(jīng)過反復國內(nèi)外實驗后，MNNG法是大家公認確切可致CAG、PLGC及胃癌的造模方法，所以單純MNNG造成大鼠CAG-PLGC模型屬于化學因素造模，在飲水中加入MNNG化學致癌劑給大鼠長時間自由飲用可誘發(fā)CAG和胃癌。通常單純以MNNG法造模是以100～200μg/mLMNNG溶液讓SD或是Wistar大鼠(以4～8周齡多見)進行自由飲用8～24周，病理上均可發(fā)現(xiàn)胃部(特別是胃竇區(qū))黏膜腺體有不同程度的萎縮或消失并伴有明顯炎性反應，局灶上有脫落、糜爛等，部分出現(xiàn)腸化生或不典型增生，在長時間刺激下，部分大鼠出現(xiàn)胃癌[11-13]。由這些指標可以得出成功復制出CAG-PLGC動物模型。

但是，使用MNNG單一因素制出動物模型的方法缺點較多：耗時長，造模使用的劑量、濃度和灌胃時間不一，自由飲用情況下也未實施排出動物是否存在自愈的傾向，單一因素對人類多因素所致CAG的模擬遠遠不夠等。

因此，后人在尋求省時省力的造模方法上不斷努力,希望從復合模型上尋求突破,結(jié)合多種手段彌補造模缺點。袁孝兵[14]認為MNNG應新鮮配制，避光保存，且濃度應控制在50～100μg/mL較為合理，濃度過低則模型復制時間過長，成功率低；濃度過高易出現(xiàn)結(jié)腸癌等其他腫瘤，魏玥等[15]建議使用120μg/mLMNNG溶液以5mL/(kg·d)灌胃代替自由飲用方式，以彌補動物飲水方面的隨機性以防可能飲入的MNNG達不到預期效果。為了促進PLGC，在MNNG單藥法基礎(chǔ)上輔以理化藥物損傷法，如無水乙醇、雷尼替丁、熱糊及局部X射線照射等。謝晶日等[16]通過3組實驗證明自由飲用MNNG和50%乙醇混合液并以熱鹽水和雷尼替丁混合灌胃同時配合饑飽失常(2d飽食，1d禁食)，在第11周就可以明顯看腸上皮化生或異型增生，成功造出CAG-PLGC模型，誘變率72.23%，明顯高于其他2組。

而在目前，國內(nèi)大多研究主要是中醫(yī)藥對CAG-PLGC的作用機制及療效等。因此，建立符合臨床中醫(yī)證型的動物模型是必不可少，同時也是讓理論來指導實踐。病證結(jié)合模型(兼有西醫(yī)的病名，又符合中醫(yī)的證型)是目前中醫(yī)藥在研究CAG-PLGC的特色。祖國醫(yī)學中本病大多屬于脾虛血瘀夾毒，曾進浩等[17]采用200μg/mLMNNG飲用液避光處理予以大鼠自用飲用，聯(lián)合饑飽失常、耗氣瀉下法(小承氣湯)連續(xù)造模18周，病理證明胃黏膜腺體有不同程度萎縮，成功復制脾虛證型CAG-PLGC動物模型。

徐珊等[18]在以MNNG單藥法7周時間建立大鼠CAG的基礎(chǔ)上分成3組，以苦寒瀉下法(大黃煎劑)加饑飽失常法建立脾虛證候模型組，以鉗子激怒法并每7d注射0.1%腎上腺素建立肝郁證候模型組，以濕熱溫度(33±2) ℃,相對濕度(95±3)%和喂養(yǎng)高糖高脂飼料的方法建立濕熱證候模型組，均為4周，結(jié)果顯示各模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)慢性炎癥,各證候模型組中以脾虛CAG組大鼠胃黏膜炎癥最重,各模型組大鼠胃黏膜厚度較正常對照組均有明顯變薄,以脾虛CAG組大鼠胃黏膜厚度最薄,各個病證結(jié)合模型復制成功。

1.4 以手術(shù)法動物造模法 主要是利用手術(shù)方法使含有膽汁、腸液和胰液的十二指腸反流入胃，使其堿性物質(zhì)長期直接損傷胃黏膜，引起胃黏膜炎癥并伴有固有腺體萎縮，從而造成CAG。目前已有學者利用此原理成功施行大鼠胃空腸吻合術(shù)加十二指腸橫斷建立膽汁反流性大鼠CAG模型和通過開腹將金屬彈簧植入胃幽門環(huán)誘發(fā)大鼠CAG模型等[19]。

2 各個實驗動物造模評價

2.1以H.pylori為主的造模法 目前大多數(shù)建立H.pylori感染的CAG-PLGC的動物模型所使用的動物多為小鼠，采用國際公認的H.pylori致病性菌株是NCTC11637，對小鼠具有較強的感染性，并能引起與人體H.pylori感染類似的病理改變，且小鼠價格相對其他動物便宜，個人差異小，體內(nèi)微生物易于控制，遺傳背景明確，自發(fā)腫瘤低，具有一定的經(jīng)濟實用價值。 此外，也有少數(shù)學者采用大鼠的動物模型。雖然在實驗周期內(nèi)未見萎縮性炎癥改變，但是研究表明Wistar大鼠對SS1H.pylori易感染且有大量定植，這為闡明H.pylori對大鼠也有一定致病性，打破之前大鼠不易定植的說法，長期維持該實驗將有可能闡明H.pylori與胃癌的關(guān)系[19]。目前為了縮短造模時間，更多學者對該模型進行改良，加上乙醇或是非甾體類藥物模擬人類生活中不良習慣所致疾病，符合該病變不僅僅是H.pylori感染，而是多病因致病的特點，同時，損傷胃黏膜也能夠使H.pylori更快定植和入侵?？勺鳛檠芯縃.pylori感染CAG發(fā)病機制及藥物干預治療較合適的CAG-PLGC動物模型。該造模方法的缺點：造模時間長，模型存在一定不穩(wěn)定性，需要新鮮的H.pylori菌株，必須反復篩選合適菌株，才可提高感染成功率，灌胃的菌量需經(jīng)嚴格控制，灌喂菌量過低會降低細菌在小鼠胃黏膜定植的密度, 易致感染失敗。若攻擊菌量過高, 過量的細菌沒能定植到胃黏膜上,在消化道內(nèi)死亡、崩解,釋放大量菌體成分,可能會引起消化道的病變。實驗環(huán)境要求高，飼養(yǎng)條件苛刻，防止交叉感染，且新型改良模型報道較少，對其不足和缺點有待進一步了解。

2.2 以氨水為主的造模法 從以單一因素的造模到以氨水為主的復合多因素致CAG-PLGC動物模型造模方法是對傳統(tǒng)氨水CAG-PLGC模型的創(chuàng)新，從氨水模型中加入模擬人類日常生活中飲食不當(饑飽失常、飲食冷熱不均、高鹽)、嗜酒、膽汁反流、濫用非甾體類藥物、H.pylori感染等導致CAG的發(fā)病原因，從而建立大鼠CAG-PLGC模型。在相同的時間內(nèi)，能夠使大鼠胃部腺體大面積萎縮并且有部分出現(xiàn)腸化生現(xiàn)象，且該實驗造模成功率高，穩(wěn)定，成本低，不需要特殊設備和條件。該方法缺點：時間仍長，達到癌變時間仍長，胃黏膜萎縮程度比起同期使用致癌化學劑MNNG的作用要輕。本實驗仍可作為CAG研究和藥物研究篩選提供理論支持。

2.3 以MNNG為主的造模法 從單藥MNNG法到MNNG結(jié)合多因素的造模法，大大縮短了大鼠CAG模型的造模時間,模型復制成功穩(wěn)定,不易逆轉(zhuǎn)，結(jié)合其他因素同時也注意了動態(tài)觀察了各個階段的病變情況，為成功造模與研究提供基礎(chǔ)和實驗數(shù)據(jù)，使動物病態(tài)模型愈加接近人類臨床癥狀。在西醫(yī)對CAG方面無特效藥情況，中醫(yī)藥在防治癌變方面起重要作用，因此新藥不斷開發(fā)更需要建立這種創(chuàng)新型證候結(jié)合動物模型，以脾虛的造模方法為基礎(chǔ)，根據(jù)研究需要添加不同的誘導因素，應該有較好的前景。該造模方法的缺點：雖然MNNG是公認的CAG造模試劑，但是MNNG試劑是一種有毒的強力致癌物質(zhì)，對實驗人員的健康和對實驗環(huán)境有一定威脅，操作需謹慎。造模的成功與否大多都以病理學指標觀察為依據(jù)，缺乏可定量實驗性指標的檢測，國際上也無公認標準。目前很多相關(guān)文獻僅報道了造模成功案例，而在實驗造模中動物的死亡僅是輕描淡寫，未盡其詳。因此，有魏玥[11]認為乙醇不宜與MNNG同用，在于乙醇產(chǎn)氣較多，MNNG可致大鼠全消化道脹氣，兩者同用可加大大鼠在造模過程死亡率，建議饑飽失常法不宜與MNNG同用，在于空腹飲水會使MNNG加重對腸道黏膜刺激而減少胃黏膜刺激，從而增加MNNG致腸道腫瘤的幾率。目前以MNNG為主結(jié)合多因素的方法較多，但沒有統(tǒng)一，對其中的不足仍待進一步報道。

2.4 以手術(shù)直接操作為主造模法 此方法優(yōu)點在于具有立竿見影的效果，適合研究膽汁反流在CAG發(fā)病的作用和機制。該造模方法的缺點：為防止組內(nèi)有人為造成的差異性及獲得較高成功率，其手術(shù)本身操作復雜，需要有較好的操作技術(shù)的工作人員參加，模型存在一定的不穩(wěn)定性，需要時刻進行動態(tài)觀察，相關(guān)文獻報道較少，仍待進一步研究。

3 展 望

近幾十年來，從最初單一的耗時、人力、物力等動物模型建立之時，許多學者都致力于尋找省時省力的造模方法，再研究人類CAG同時也模仿其病因來結(jié)合多種手段建立復合型動物模型。目前它的發(fā)展具有突出前景，能將中醫(yī)基礎(chǔ)理論和現(xiàn)代醫(yī)學理論相結(jié)合，這為中藥治療CAG-PLGC疾病奠定了扎實基礎(chǔ)，但研究病證結(jié)合的動物模型研究較少，缺乏更加科學和客觀的觀察指標，如何利用好名老中醫(yī)及民間臨床的經(jīng)驗，如何將臨床路徑和證候療效評定形成統(tǒng)一量化標準等，都是在建立證候結(jié)合動物模型時時所必須探索的。

雖然CAG-PLGC動物模型復制新方法多樣，但仍有不盡如人意之處，除了手術(shù)造模外，其他類型造模方法操作性相對而言較簡易，但是成功造模實驗周期都較長，消耗大量人力和物力，存在一定不穩(wěn)定性，且造模試劑存在一定致癌性，這對工作人員和環(huán)境都有一定威脅。此外，筆者發(fā)現(xiàn)造模時間不應過長，特別在常溫實驗室而不是恒溫實驗室情況下，如采用氨水或是MNNG自由飲用的情況下，造模時間應該控制在夏秋期間讓動物自由飲用，在實驗過程中，若將自由飲用藥物時間安排在冬春之間，溫度較低，動物自身代謝低，飲水量會比夏秋的次數(shù)少，從而會造成造模時間過長或是造模失敗。所以，實驗者應根據(jù)自己的試驗條件及對試驗的要求來選擇不同的造模方法,并研究出高成功率、穩(wěn)定、經(jīng)濟理想、省時、簡便易行等復制CAG-PLGC模型的方法,以促進對其的研究，切不可生搬硬套。

此外，任何動物模型實驗只是一種間接研究,只可能在一個或幾個方面與人類疾病相似。事實上,沒有一種動物模型能完全復制出人類疾病的所有臨床表現(xiàn)。因此,動物實驗的結(jié)論正確與否,最終還必須在臨床上人體實驗得到直接實踐，這樣才具有現(xiàn)實意義。

[1] 陳偉,劉華一.中醫(yī)藥防治胃癌前病變機制的實驗研究進展[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2007，26(1)：54-56

[2] 魏瑋等.中醫(yī)對慢性萎縮性胃炎及胃癌癌前病變的研究概況[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,2(23):151-152

[3]CorreaP1,PiazueloMB.Thegastricprecancerouscascade[J].DigDis，2012,13(1):2-9

[4] 張榮光，段廣才，范清堂，等.幽門螺桿菌感染的昆明小鼠模型的建立[J].中華醫(yī)學雜志,2006,86(12):857-859

[5] 曾志榮，胡品津，陳旻湖，等.幽門螺桿菌長期感染大鼠腺胃模型的建立[J].中國人獸共患病雜志,1998,14(5):20-23

[6] 唐旭東，張翠萍，張琪，等.改良式Hp感染萎縮性胃炎大鼠模型的建立[J].青島大學醫(yī)學院學報,2012,48(3):247-249

[7] 李秋娟,仲來福,葉建新，等.大鼠實驗性慢性萎縮性胃炎與胃黏膜生長抑素、胃泌素關(guān)系的研究[J].大連醫(yī)科大學學報,1999,21(2):89-91

[8] 朱曉玲，多田正弘. 氨水對大白鼠胃黏膜長期作用的影響:胃黏膜屏障功能的變化[J].臨床消化病雜志,1993,5(1):16-18

[9] 蘇劍東,吳靈飛,蒲澤錦.慢性萎縮性胃炎動物模型的實驗研究[J].汕頭大學醫(yī)學院學報,2007,20(2):88-90

[10] 劉希,王晶,王堃.氨水復合多因素建立萎縮性胃炎大鼠模型[C].第九次全國中藥實驗藥理學術(shù)會議論文摘要匯編，2011：11-13；37-38

[11] 王茵萍,孫茂峰,范剛啟，等.穴注黃茂、當歸注射液對實驗性慢性萎縮性胃炎胃黏膜血流的影響[J].針刺研究,2003,28(1):33-37

[12] 鄭世華,林壽寧,羅和生，等.安胃湯對大鼠慢性萎縮性胃炎胃腸激素的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2005,13(1):33-35

[13] 潘華峰,趙霞，鞠曉云，等.胃痞消對實驗性大鼠慢性萎縮性胃炎的作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2005,13(5):287-289

[14] 袁孝兵.大鼠胃癌前病變模型的研究進展[J].安徽中醫(yī)學院學報,2004,23(5):62-64

[15] 魏玥,楊晉翔,李志鋼，等.MNNG胃癌前病變大鼠造模聯(lián)合因素的探討[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2011,19(2):111-112

[16] 謝晶日,王業(yè)莉, 張揚，等.復合造模法建立大鼠胃癌前病變模型的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學刊,2013,31(11):2341-2342

[17] 曾進浩,潘華峰，胡霞，等.胃痞消對胃癌前病變大鼠胃黏膜上皮細胞NF-κBp65信號表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(9):145-149

[18] 徐珊,周嘉鶴,王常松，等.慢性萎縮性胃炎證病結(jié)合模型的復制[J].中國中醫(yī)藥科技,2008,15(1):6-8

[19] 張國梁,李艷.慢性萎縮性胃炎動物模型研究進展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2012,20(12):567-569

潘華峰，E-mail：gzphf@126.com

國家自然基金資助項目(81473620)；廣東省聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地人才培養(yǎng)項目(AIAFD004132A15)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.15.040

R-332

A

1008-8849(2015)15-1699-04

2014-09-01