伯氏疏螺旋體膜蛋白OspC研究進展

汪佳婕 寶福凱，2，3，4，5 柳愛華

1.昆明醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)系 熱帶醫(yī)學(xué)研究所，云南昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)云南省高校熱帶傳染病重點實驗室，云南昆明 650500；3.云南省熱帶病示范型國際科技合作基地，云南昆明 650500；4.云南省公共衛(wèi)生與疾病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，云南昆明 650500；5.昆明醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，云南昆明 650500

萊姆?。↙yme disease）作為一種蜱媒傳播的傳染性疾病， 在一些特殊人群和一些特別地區(qū)有很高的感染率。但到目前為止，缺少比較敏感和準確的診斷方法對萊姆病進行早期診斷。因此，要做到及時預(yù)防和及時治療，在世界范圍內(nèi)還是個難題。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，萊姆病的致病病原體是一種叫做伯氏疏螺旋體（Borrelia Burgdorferi）的螺旋體，其外膜蛋白C（OspC）有非常強的抗原性和較強的免疫原性，機體在感染萊姆病的早期就可以產(chǎn)生特異性的IgM抗體，將這種抗體純化后，對動物模型進行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動物模型在免疫后很短時間內(nèi)就可檢測到高濃度的IgM 抗體，目前，重組OspC 已用于萊姆病的臨床診斷中。

1 OspC的細胞定位與化學(xué)結(jié)構(gòu)

在進行OspC 的抗原性研究之前，首先對其細胞定位與化學(xué)結(jié)構(gòu)做一定的研究，才有可能全面的研究其抗原性機制。

那么，外膜脂蛋白C（OspC）是萊姆病螺旋體的主要外膜蛋白之一，作為一種外膜蛋白，OspC 廣泛存在于螺旋體細胞外膜中。從結(jié)構(gòu)上來看，β-桶狀結(jié)構(gòu)是其共有的結(jié)構(gòu)特征，不同的β-桶狀結(jié)構(gòu)由不同的偶數(shù)個β-折疊片組成，β-折疊的數(shù)量從8 ~ 22 個不等。在美國中西部、東北部等地區(qū)，發(fā)現(xiàn)25 種OspC 基因型的表達[1-2]。Elisabeth Baum 在其研究中指出，OspC 的179 氨基酸殘基至188 個殘基中的第五個C 末端折疊結(jié)構(gòu)是OspC的特異性交互抗體結(jié)合的關(guān)鍵位置[3]。OspC 作為一個表面暴露的脂蛋白，可以引起早起的免疫反應(yīng)[4-7]。在Elisabeth Baum 的研究中，得到了OspC的最大交互反應(yīng)區(qū)域的3D 圖形。如圖1，在圖中，OspC 二聚體的兩條鏈分別被標以亮灰色與暗灰色。同時，在Elisabeth Baum 的研究中將OspC 二聚體中與抗體藥物關(guān)聯(lián)度最高的區(qū)域指出。其中，綠色部分代表與種OspC 有高關(guān)聯(lián)度，黃色部分表示與兩種OspC 蛋白有高關(guān)聯(lián)度，紅色部分表示與五種OspC 蛋白有高關(guān)聯(lián)[8]。

圖1 OspC 的最大交互反應(yīng)區(qū)域的3D 圖形

2 OspC的表達調(diào)控

伯氏疏螺旋體特異性地調(diào)節(jié)其外膜脂蛋白OspC 的合成，以感染宿主細胞。為了適應(yīng)哺乳動物體內(nèi)的免疫環(huán)境，螺旋體首先利用OspC 在哺乳動物體內(nèi)建立起其感染過程。伯氏疏螺旋體大量產(chǎn)生OspA 和OspB，而OspC 在硬蜱體內(nèi)低表達，從蜱媒介傳播到哺乳動物吸血后則出現(xiàn)上調(diào)[9]，以幫助伯氏疏螺旋體轉(zhuǎn)移到唾液腺[10]，進而感染哺乳類動物[11-12]。感染一旦建立起來，OspC 的表達就會被抑制，以避免被宿主的免疫系統(tǒng)清除。同時伯氏疏螺旋體在人體內(nèi)初期呈現(xiàn)一個高表達狀態(tài)[13]，當抗體產(chǎn)生后殺死了OspC 一直出現(xiàn)一個低表達克隆[14]。在表達基因的啟動子中，反向重復(fù)序列的上游部分在調(diào)節(jié)OspC 的表達中起到關(guān)鍵作用。Dan Drecktrah 等[15]通過定點突變技術(shù)在分子水平上切割了OspC 表達基因操作子的末端反向重復(fù)序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，打亂末端反向重復(fù)序列但保留鄰近的反向重復(fù)序列能夠阻止OspC 的合成。同時發(fā)現(xiàn)，溫度，pH 以及DNA 超螺旋對于OspC 的合成也起到重要影響。Schwan 等[16]發(fā)現(xiàn)，在溫度為32 ~ 37℃的條件下， OspC 的表達量大幅度地提高。由此說明，適宜的溫度是OspC 大量表達的重要條件， 在不適宜的溫度下，OspC 不表達或表達量很低。因此，近年來很多國外學(xué)者認為，pH 值、溫度以及其他因素或許會對OspC 的免疫效果起到關(guān)鍵的影響[17-20]。更重要的是，比起核苷酸的序列，末端反向重復(fù)序列的堿基互補配對的存在對于控制OspC 的表達更為重要。Dan Drecktrah 的結(jié)果顯示，順式作用元件在OspC 毒力因子的表達上有關(guān)鍵的作用。

3 OspC致病性的研究

在對伯氏疏螺旋體外表面膜蛋白（OspC）致病性進行研究時發(fā)現(xiàn)，用OspC 與Salp15 結(jié)合，一起感染哺乳類動物，可以幫助伯氏疏螺旋體在局部定居，并抵抗免疫殺傷。2OspC 作為一個有效的免疫靶，表達下調(diào)時幫助伯氏疏螺旋體免疫逃逸，對OspC 在早期的感染中起重要作用[13]。雖然OspC是伯氏疏螺旋體關(guān)鍵的毒力因子之一，但是它在伯氏疏螺旋體的感染中的具體作用目前還不清楚。為了確定在接種了各種不同類型的OspC 菌株后，OspC 是否會引起宿主反應(yīng)， Antonara 等分別接種了野生型OspC 菌株，突變型菌株以及完全突變型菌株后，對巨噬細胞，中性粒細胞以及細胞因子的產(chǎn)生進行了測定。在21 種細胞因子的測定中發(fā)現(xiàn)巨噬細胞趨化蛋白（MCP-1），角質(zhì)細胞起源趨化因子（KC， CXCL1）以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在伯氏疏螺旋體的接種位點有表達量上升的趨勢。并且在接種一周內(nèi)的多個時間點OspC 的表達量有不同的變化[21]。

4 OspC的診斷價值

到目前為止，缺少比較敏感和準確的診斷方法對萊姆病進行早期的診斷。因此，要做到及時診斷和治療，在世界范圍內(nèi)還是個難題。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，萊姆病的致病病原體伯氏疏螺旋體外膜蛋白C（OspC）有較強的免疫原性，機體在感染萊姆病的早期就可以產(chǎn)生特異性的OspC IgM 抗體，將OspC 純化后，對動物模型進行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動物模型在免疫后很短時間內(nèi)就可以檢測到高濃度的IgM 抗體。目前，重組OspC 已用于萊姆病的臨床診斷。

近年的研究表明，OspC 作為伯氏疏螺旋體的主要外膜蛋白之一，具有很強的抗原性。Gilmore等[17]利用OspC 免疫12 只初生小鼠， 然后利用伯氏疏螺旋體菌株感染這12 只獲得免疫的初生小鼠， 由此發(fā)現(xiàn)了OspC 能夠使動物產(chǎn)生高濃度的抗體， 使其具有抵抗伯氏疏螺旋體感染的能力。

目前有不少研究報道指出，OspC 在宿主體內(nèi)可以引起早期免疫反應(yīng)，因此有研究者致力于利用OspC 作為抗原用來診斷早期的萊姆病[22-24]。早年，Hauser 等[25]培養(yǎng)了大量不同萊姆病的菌株，并從中提取了大量的OspC 作為抗原，利用ELASA技術(shù)檢測了222 例萊姆病患者的血清和133 例對照供血者的血清。其結(jié)果顯示，有幾株菌株間的IgG 的檢測靈敏度非常相似。利用Western blot 技術(shù)驗證后發(fā)現(xiàn)，OspC 確實可以作為一種靈敏的萊姆病早期診斷抗原。在此之后，Rousselle 等[6]通過對比772 株狹義氏疏螺旋體的OspC 與14kD 鞭毛蛋白片段等其他細胞抗原平行應(yīng)用于檢測萊姆病病人和無癥狀的對照組的IgG 與IgM， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgM 抗體的差異性最大。另外， Hauser 等[26]又做了進一步的研究，利用WB 技術(shù)檢測了菌株P(guān)Ko、PBi 與Pka2 的 靈 敏 度， 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)OspC 對早期萊姆病感染的檢出靈敏度要遠遠高于其他抗原，并最終推薦了OspC 作為PKo 診斷的最敏感的抗原。

Jobe 等[27]的研究中發(fā)現(xiàn)，在人類萊姆病的早期階段中，ELISA 可以作為一種有效的方式來檢測OspC 抗體，同時也能為成功治療萊姆病作為一個重要的判斷依據(jù)。

目前看來，OspC 作為伯氏疏螺旋體的主要抗原之一， OspC 雖然具有比較大的差異， 但其具有很強的特異性。因此，在診斷學(xué)臨床應(yīng)用中，將OspC作為診斷抗原，具有很大的臨床優(yōu)勢。同時，如果將OspC 與其他的抗原相結(jié)合，進行配伍診斷，那么這種診斷方法不僅能夠提高診斷的靈敏度， 還能減少與其他病原體的交叉反應(yīng)。這將在將來萊姆病的診斷中顯示出很強的優(yōu)勢與潛力。預(yù)計在今后的萊姆病防治中也會發(fā)揮一定的作用。至于在伯氏疏螺旋體的致病性上的研究， 目前的研究主要涉及于T 細胞的免疫反應(yīng)、病原體本身的作用以及不同基因型螺旋體的作用。預(yù)計在以后的研究中，將會把OspC 與其他蛋白的研究相結(jié)合，從而獲取更多的研究結(jié)果，在萊姆病的各方面獲取進一步的進展。

付鈺廣等[28]利用來自SZ 菌株的重組蛋白OspC，進行WB 實驗檢測顯示，重組的OspC 與陽性血清有較強的反應(yīng)，同時SZ 菌株作為我國的流行菌株，若利用SZ 菌株的OspC 建立相對應(yīng)的ELISA方法來檢測伯氏疏螺旋體，這對我國萊姆病的預(yù)防和控制有很大作用，并有助于消除世界范圍內(nèi)萊姆病病患。同時，其研究的重組蛋白OspC（SZ 菌株）為建立羊體內(nèi)的伯氏疏螺旋體抗體的ELISA 檢測方法奠定了重要的基礎(chǔ)。

目前在世界范圍內(nèi)對于OspC 的研究已經(jīng)有了初步結(jié)果，對OspC 的研究有助于對萊姆病的發(fā)病原因，發(fā)病機理和發(fā)病規(guī)律進行了解。并且已經(jīng)初步建立了利用OspC 作為檢測抗原用來檢測早期的萊姆病。但對于OspC 的深入研究還遠遠不夠，還有待更深一步的實驗與臨床研究。

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