烏雞黑色素對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶致亞急性帕金森病模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究

謝微嫣，王藝錚，王曉民，賀 毅

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·論著·

烏雞黑色素對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶致亞急性帕金森病模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究

謝微嫣，王藝錚，王曉民，賀 毅

目的 探討烏雞黑色素對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)致帕金森病(PD)模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 2013年3月—2014年5月，按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只雄性C57/B6小鼠分為對(duì)照組(n=10)、MPTP模型組(n=12)和烏雞黑色素治療組(n=38)；烏雞黑色素治療組又進(jìn)一步分為10 mg/kg治療組(n=13)、30 mg/kg治療組(n=13)和100 mg/kg治療組(n=12)。對(duì)照組小鼠采用0.9%氯化鈉溶液灌胃。MPTP模型組和烏雞黑色素治療組小鼠腹腔注射MPTP(30 mg/kg，1次/d，共7 d)，同時(shí)烏雞黑色素治療組小鼠分別灌胃給予不同劑量的烏雞黑色素(10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg，1次/d，共7 d)。剔除建模不成功小鼠，最后實(shí)際入組小鼠分別為對(duì)照組10只、MPTP模型組10只、10 mg/kg治療組10只、30 mg/kg治療組9只、100 mg/kg治療組9只。比較各組小鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)免疫陽性纖維的表達(dá)變化、黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)及紋狀體TH水平。結(jié)果 對(duì)照組可見大量呈束狀、密集、排列規(guī)則有序TH免疫陽性神經(jīng)纖維；MPTP模型組TH免疫陽性神經(jīng)纖維稀疏、斷裂且排列零散無序；烏雞黑色素治療組與模型組染色結(jié)果相比，仍可見呈束狀、較密集、排列較有序的TH免疫陽性神經(jīng)纖維，尤其以30 mg/kg治療組最為明顯。MPTP模型組、10 mg/kg治療組、30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)低于對(duì)照組(P<0.05)；30 mg/kg治療組黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)高于MPTP模型組(P<0.05)。MPTP模型組、10 mg/kg治療組、30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組紋狀體TH水平低于對(duì)照組(P<0.05)；30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組紋狀體TH水平高于MPTP模型組(P<0.05)。結(jié)論 烏雞黑色素灌胃給藥能減緩MPTP誘導(dǎo)的亞急性PD模型小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡和紋狀體TH免疫陽性神經(jīng)纖維的丟失，提示口服烏雞黑色素對(duì)于PD模型小鼠有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。

帕金森??；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶；烏雞黑色素；小鼠

謝微嫣，王藝錚，王曉民，等.烏雞黑色素對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶致亞急性帕金森病模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(21)：2555-2559.[www.chinagp.net]

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帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的原發(fā)于黑質(zhì)-紋狀體通路的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元漸進(jìn)性變性、死亡，在臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)常已喪失70%～80%，殘余神經(jīng)元仍繼續(xù)發(fā)生變性，導(dǎo)致黑質(zhì)和紋狀體中DA含量明顯減少[1]。PD多發(fā)生于60歲以上老年人，人口老齡化進(jìn)程的加快使其發(fā)病率和患病率逐年升高[2]。PD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究表明，PD與遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激過度等諸多因素有關(guān)，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為在其發(fā)病中起著非常重要的作用[3]。以往文獻(xiàn)證實(shí)，提取自我國(guó)特有藥用禽類烏骨雞的烏雞黑色素具有廣泛的抗氧化[4]、抗衰老[5]和抗紫外輻射[6]的作用。本研究對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導(dǎo)的亞急性PD模型小鼠灌胃給予不同劑量的烏雞黑色素進(jìn)行治療，并比較各組黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)免疫陽性纖維的表達(dá)變化、黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)和紋狀體TH水平的差異，從而探討烏雞黑色素對(duì)PD模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用和初步機(jī)制，為PD的治療提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性C57/B6小鼠60只，體質(zhì)量23～28 g，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 藥物 烏雞黑色素提取自市售泰和烏骨雞[7]，通過紅外光譜法對(duì)提取的烏雞黑色素與人工合成的黑色素進(jìn)行對(duì)比，確定提取的烏雞黑色素主要成分是真黑色素[8]。

1.3 建模與干預(yù)方法 2013年3月—2014年5月，小鼠飼養(yǎng)溫度保持在22～24 ℃，自由進(jìn)食和飲水3 d后進(jìn)入正常實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組(n=10)、

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

本研究闡述了烏雞黑色素對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的亞急性帕金森病模型小鼠的多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用，提示烏骨雞作為中國(guó)傳統(tǒng)保健品具有潛在的應(yīng)用前景。

MPTP模型組(n=12)和烏雞黑色素治療組(n=38)；烏雞黑色素治療組又進(jìn)一步分為10 mg/kg治療組(n=13)、30 mg/kg治療組(n=13)和100 mg/kg治療組(n=12)。對(duì)照組小鼠采用0.9%氯化鈉溶液灌胃。MPTP模型組和烏雞黑色素治療組小鼠腹腔注射MPTP(30 mg/kg，1次/d，共7 d)，同時(shí)烏雞黑色素治療組小鼠分別灌胃給予不同劑量的烏雞黑色素(10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg，1次/d，共7 d)[9-10]。在給予MPTP 7 d后，小鼠出現(xiàn)毛發(fā)倒豎的現(xiàn)象并伴有輕微抽搐，捏住小鼠尾巴掙扎變?nèi)酰崾窘３晒?。剔除建模不成功小鼠，最后?shí)際入組小鼠分別為對(duì)照組10只、MPTP模型組10只、10 mg/kg治療組10只、30 mg/kg治療組9只、100 mg/kg治療組9只。

1.4 觀察指標(biāo)與測(cè)定方法

1.4.1 黑質(zhì)TH免疫陽性纖維的表達(dá)變化 MPTP給藥7 d后，從每組隨機(jī)選3～4只小鼠(對(duì)照組4只、MPTP模型組4只、10 mg/kg治療組3只、30 mg/kg治療組3只、100 mg/kg治療組3只)，用多聚甲醛灌流，取鼠腦，用TH抗體進(jìn)行常規(guī)卵白素一生物化過氧化物酶復(fù)合物法(ABC法)免疫組化染色，采用顯微鏡觀察小鼠黑質(zhì)TH免疫陽性纖維的表達(dá)變化。

1.4.2 黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù) MPTP給藥7 d后，從每組隨機(jī)選取3只小鼠，用多聚甲醛灌流，取鼠腦，用TH抗體對(duì)黑質(zhì)進(jìn)行常規(guī)ABC法免疫組化染色，黑質(zhì)致密部細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞胞體較其他部位小，與處于中間部位的疏松部有較明顯的分界，按照此方法對(duì)黑質(zhì)部位進(jìn)行范圍劃定，計(jì)數(shù)TH免疫陽性神經(jīng)元。

1.4.3 紋狀體TH水平 MPTP給藥7 d后，選取各組剩下的小鼠進(jìn)行紋狀體取材：快速斷頭處死小鼠，在冰上剝離腦組織，取出雙側(cè)紋狀體，放入預(yù)備好的離心管中。每管紋狀體組織加入200 μl蛋白裂解液，在冰上用電動(dòng)研磨器間歇研磨5 min，將黏稠狀組織裂解產(chǎn)物收集于離心管中，用超聲破碎儀中等強(qiáng)度間歇破碎30 s；冰浴中靜置30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min(離心半徑15 cm)，收集上清液。BCA蛋白定量后采用Western blotting法檢測(cè)TH水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠黑質(zhì)TH免疫陽性纖維的表達(dá)變化 黑質(zhì)部位的TH免疫陽性神經(jīng)元排列成特殊的“羊角”狀，細(xì)胞形態(tài)清晰，背景無雜色。對(duì)照組可見大量呈束狀、密集、排列規(guī)則有序的TH免疫陽性神經(jīng)纖維；MPTP模型組TH免疫陽性神經(jīng)纖維稀疏、斷裂且排列零散無序；烏雞黑色素治療組與模型組染色結(jié)果相比，仍可見呈束狀、較密集、排列較有序的TH免疫陽性神經(jīng)纖維，尤其以30 mg/kg治療組最為明顯(見圖1)。

2.2 各組小鼠黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)比較 各組小鼠黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MPTP模型組、10 mg/kg治療組、30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；30 mg/kg治療組黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)高于MPTP模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 各組小鼠紋狀體TH水平比較 各組小鼠紋狀體TH水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MPTP模型組、10 mg/kg治療組、30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組紋狀體TH水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組紋狀體TH水平高于MPTP模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

3 討論

烏骨雞作為我國(guó)特有的藥用雞，具有增強(qiáng)免疫力、改善造血功能、抗疲勞、抗衰老等保健作用[11-12]，其最早記載見于《本草綱目》，書中明確指出，其入藥效果與皮肉骨中黑色素的深淺有關(guān)，“色愈黑者，入藥愈佳”[13]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為，烏骨雞特殊的藥用價(jià)值與其體內(nèi)大量沉著的黑色素有直接關(guān)系[14-15]。烏骨雞黑色素對(duì)金屬離子有很強(qiáng)的親和力；分子內(nèi)含有大量的自由基，對(duì)于氧自由基具有很好的清除作用[16-17]。

PD是一種多發(fā)于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，PD可能與遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激過度等諸多因素有關(guān)[3]。我國(guó)的PD發(fā)病人數(shù)占世界總發(fā)病人數(shù)的40%以上，75歲以上老年人的發(fā)病率高于3%[1]。治療費(fèi)用高、治療手段有限使得PD患者的生存質(zhì)量大受影響；氧化應(yīng)激被認(rèn)為在PD的發(fā)病中起著非常重要的作用[2]。

Table 1 Comparison of the number of TH-immunoreactive neurons in the compact part of SN among the five groups

組別只數(shù)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)對(duì)照組3192.7±18.8MPTP模型組3104.7±9.1a10mg/kg治療組3138.7±13.6a30mg/kg治療組3154.7±20.1ab100mg/kg治療組3135.7±18.0aF值11.48P值<0.001

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與MPTP模型組比較，bP<0.05；MPTP=1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶，TH=酪氨酸羥化酶

Table 2 Comparison of the protein level of TH corpus striatum among the five groups

組別只數(shù)TH水平對(duì)照組31.09±0.03MPTP模型組30.54±0.04a10mg/kg治療組40.61±0.08a30mg/kg治療組30.74±0.04ab100mg/kg治療組30.71±0.11abF值29.39P值<0.001

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與MPTP模型組比較，bP<0.05

對(duì)于烏雞黑色素在PD病理過程中的作用迄今為止尚無研究。在實(shí)驗(yàn)過程中，本研究選用了最常用的PD模型——MPTP模型。MPTP可以穿越血-腦脊液屏障，并在星形膠質(zhì)細(xì)胞和5-羥色胺能神經(jīng)元內(nèi)的單胺氧化酶B作用后變?yōu)橛卸拘缘腗PP+，然后釋放到細(xì)胞外，經(jīng)由多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)進(jìn)入DA能神經(jīng)元末梢和胞體，選擇性破壞黑質(zhì)DA能神經(jīng)元，導(dǎo)致黑質(zhì)細(xì)胞體、紋狀體神經(jīng)末梢、DA遞質(zhì)大量減少，從而導(dǎo)致了在生化、病理和臨床特征上酷似PD的表現(xiàn)，是一類經(jīng)典的PD模型[9]。TH能將酪氨酸催化成DA，在DA能神經(jīng)元合成DA的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。也就是說，TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)與DA能神經(jīng)元數(shù)呈正比，通過測(cè)定TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)可知DA能神經(jīng)元數(shù)[9]。本研究采用灌胃法給予MPTP致亞急性PD模型小鼠不同劑量的烏雞黑色素，結(jié)果顯示，烏雞黑色素治療組與模型組染色結(jié)果相比，仍可見呈束狀、較密集、排列較有序的TH免疫陽性神經(jīng)纖維，尤其以30 mg/kg治療組最為明顯；MPTP模型組、10 mg/kg治療組、30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)低于對(duì)照組，30 mg/kg治療組黑質(zhì)致密部TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)高于MPTP模型組。提示烏雞黑色素對(duì)于黑質(zhì)紋狀體部位的DA能神經(jīng)元有一定保護(hù)作用。

本研究組推測(cè)，烏雞黑色素對(duì)于MPTP致亞急性PD模型小鼠的保護(hù)作用很可能是通過其強(qiáng)烈的抗氧化應(yīng)激的特性介導(dǎo)的。PD最基本的病理特征之一是黑質(zhì)神經(jīng)元的丟失。黑質(zhì)神經(jīng)元含有豐富的神經(jīng)黑色素。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤與PD患者有很大的相關(guān)性[18]。有報(bào)道稱，相同年齡下白人患PD的概率是黑人的3倍[19]。所以，近期有許多研究者開始關(guān)注神經(jīng)黑色素和PD之間的關(guān)系。黑色素是一類廣泛分布于動(dòng)物、植物、微生物中的構(gòu)造不規(guī)則的高分子化合物[20]。動(dòng)物源黑色素多屬吲哚型[21]，而植物源黑色素多屬鄰苯二酚型。依據(jù)其結(jié)構(gòu)單元是以吲哚還是鄰苯二酚為骨架，可進(jìn)一步將動(dòng)物源黑色素分為真黑色素和棕黑色素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，提取自烏骨雞的烏雞黑色素是以吲哚環(huán)為主體的含硫異聚物，屬于脊椎動(dòng)物源真黑色素，具有很強(qiáng)的抗氧化、抗紫外線、螯合重金屬的特點(diǎn)[16]。這些證據(jù)提示，提取自我國(guó)特有的烏骨雞內(nèi)的烏雞黑色素可以通過其強(qiáng)大的抗氧化等作用來拮抗PD過程中的氧化應(yīng)激，從而緩解黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷。但其中的具體分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。而且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPTP模型組、10 mg/kg治療組、30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組紋狀體TH水平低于對(duì)照組，30 mg/kg治療組、100 mg/kg治療組紋狀體TH水平高于MPTP模型組，說明烏雞黑色素能提高M(jìn)PTP致亞急性PD模型小鼠紋狀體TH水平，顯著減輕MPTP造成的黑質(zhì)紋狀體TH免疫陽性神經(jīng)纖維的損傷。

本研究雖然在在體實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了口服烏雞黑色素對(duì)于PD模型小鼠的DA能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，但是對(duì)于烏雞黑色素的最佳給藥劑量、給藥時(shí)間窗等因素尚需細(xì)化研究，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中也要考慮是否過大劑量的烏雞黑色素會(huì)導(dǎo)致一些不良反應(yīng)。另外，由于在建模過程中，有少部分小鼠會(huì)建模失敗，所以各組入組小鼠數(shù)不完全均一，分別為3～4只，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可增加實(shí)驗(yàn)例數(shù)以排除統(tǒng)計(jì)誤差。同時(shí)，烏雞黑色素對(duì)于PD病程中TH免疫陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維保護(hù)作用的具體機(jī)制也需要進(jìn)一步深入研究，除了烏雞黑色素本身的抗氧化應(yīng)激機(jī)制外，還要探討其是否與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)因素有關(guān)。

綜上所述，烏雞黑色素灌胃給藥能減緩MPTP誘導(dǎo)的亞急性PD模型小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的死亡和紋狀體TH免疫陽性神經(jīng)纖維的丟失，提示口服烏雞黑色素對(duì)于PD模型小鼠有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)和研究烏骨雞的藥用價(jià)值和食用價(jià)值有一定推動(dòng)作用，同時(shí)對(duì)于PD的預(yù)防與治療提供了新的思路。

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(本文編輯：崔麗紅)

Neuroprotective Effects of Melanine Derived From Black-bone Silky Fowl on Model Mouse With MPTP-induced Subacute Parkinson′s Disease

XIEWei-yan,WANGYi-zheng,WANGXiao-min,etal.

BeijingNeurosurgicalInstitute；BeijingTiantanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China

Objective To investigate the neuroprotective effects of melanine derived from black-bone silky fowl(BSF) on model mouse with MPTP-induced Parkinson′s disease(PD) and the mechanism.Methods From March 2013 to May 2014,60 C57/B6 rats were divided into control group(n=10),MPTP group(n=12) and melanine group(n=38) by using random number table;the melanine group was further divided into 10 mg/kg group(n=13),30 mg/kg group(n=13) and 100 mg/kg group(n=12).Rats in the control group were administrated with 0.9% sodium chloride solution by gavage;rats in the MPTP group and melanine group were treated with intraperitoneal injection of MPTP(30 mg/kg;one time per day for 7 days);rats in the melanine group were given BSF melanine of different doses(10 mg/kg,30 mg/kg and 100 mg/kg;one time per day for 7 days) by gavage.Rats with unsuccessful model building were excluded,and at last 10 rats in the control group,10 in the MPTP group,10 in the 10 mg/kg group,9 in the 30 mg/kg group and 9 in the 100 mg/kg group were included in the study.Comparison was made among these groups in the expression changes of tyrosine hydroxylase(TH)-immunoreactive fiber in substantia nigra(SN),the number of TH-immunoreactive neurons in the compact part of SN and the protein level of TH corpus striatum.Results In the control group,plenty of TH-immunoreactive fiber was in fasciculation and in a dense and orderly form;in the MPTP model group,TH-immunoreactive nerve fiber was in a sparse,broken and disordered form;in the melanine group,TH-immunoreactive nerve fiber was in fasciculation and in a dense and orderly form,especially in the 30 mg/kg group.The MPTP group,10 mg/kg group,30 mg/kg group and 100 mg/kg group were lower(P<0.05) than the control group in the number of TH-immunoreactive neurons in the compact part of SN;the 30 mg/kg group was higher(P<0.05) than the MPTP group in the number of TH-immunoreactive neurons in the compact part of SN.The MPTP group,10 mg/kg group,30 mg/kg group and 100 mg/kg group were lower(P<0.05) than the control group in the protein level of TH corpus striatum;the 30 mg/kg group and 100 mg/kg group were higher(P<0.05) than the MPTP group in the protein level of TH corpus striatum.Conclusion The intragastric administration of BSF melanine can reduce the death of substantia nigra DA neurons and the loss of corpus striatum TH-immunoreactive nerve fiber in model rats with MPTP-induced subacute PD.The oral administration of BFS melanine has potential neuroprotective effects on PD model rats.

Parkinson disease;1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;BSF melanine;Mice

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100951)

100050 北京市神經(jīng)外科研究所，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院(謝微嫣)；中國(guó)康復(fù)研究中心，北京博愛醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王藝錚)；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系(王曉民，賀毅)

賀毅，100069 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系；E-mail：heyibie@163.com

R 74

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.013

2015-04-17；

2015-05-20)