葡萄糖對鵝原代肝細(xì)胞增殖的影響

葉鳳江，韓春春，劉丹丹，萬火福，楊文蘭，翁夢珂，茍 丹，龔金祥

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物遺傳育種研究所，四川 成都 611130)

葡萄糖對鵝原代肝細(xì)胞增殖的影響

葉鳳江，韓春春，劉丹丹，萬火福，楊文蘭，翁夢珂，茍 丹，龔金祥

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物遺傳育種研究所，四川 成都 611130)

【目的】 探討葡萄糖對鵝肝細(xì)胞增殖能力的影響?！痉椒ā?以四川白鵝為供試動物，采用半原位二步膠原酶灌注法采集鵝的肝細(xì)胞，之后用含不同濃度(0(對照組，CK)，5，20，35 mmol/L)葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)鵝原代肝細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后用BrdU免疫熒光染色檢測BrdU陽性細(xì)胞率，BrdU-ELISA法檢測肝細(xì)胞DNA含量，ELISA法檢測Cyclin D1蛋白質(zhì)量濃度。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測細(xì)胞增殖相關(guān)基因(CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3)的mRNA表達(dá)水平。【結(jié)果】 與對照組比較，20和35 mmol/L葡萄糖可以顯著增加BrdU陽性細(xì)胞率，并可以明顯提高原代肝細(xì)胞的DNA含量；5和20 mmol/L葡萄糖對Cyclin D1蛋白質(zhì)量濃度影響不顯著，而35 mmol/L葡萄糖對Cyclin D1蛋白質(zhì)量濃度有顯著促進(jìn)作用。CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3的mRNA表達(dá)水平隨著葡萄糖濃度的增加而升高，其中35 mmol/L葡萄糖的促進(jìn)作用明顯大于其他處理。【結(jié)論】 葡萄糖能夠促進(jìn)鵝原代肝細(xì)胞的增殖。

葡萄糖；鵝原代肝細(xì)胞；細(xì)胞增殖

葡萄糖可以調(diào)控多種動物和細(xì)胞模型的細(xì)胞增殖，如大鼠、小鼠和嚙齒動物的β細(xì)胞系、大鼠前體脂肪細(xì)胞、原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞及新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞等[1-6]。在小鼠活體試驗中，葡萄糖可以誘導(dǎo)β細(xì)胞增殖[7-8]，但有試驗證明葡萄糖能夠引起β細(xì)胞增大，但并沒有細(xì)胞增殖[9]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通過對水禽進(jìn)行填飼碳水化合物能夠生產(chǎn)肥肝，這與水禽肝臟具有較強(qiáng)的沉積脂質(zhì)能力及生長增殖能力有關(guān)。然而，對于水禽肝細(xì)胞增殖能力的研究還未見報道。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，通過對鵝填飼碳水化合物生產(chǎn)肥肝時細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin D家族3個基因的表達(dá)水平升高，表明在肥肝生成過程中細(xì)胞增殖被激活。本研究通過檢測葡萄糖對鵝原代肝細(xì)胞DNA合成、BrdU陽性細(xì)胞率、Cyclin D1蛋白質(zhì)量濃度及Cyclin D家族3個基因mRNA表達(dá)量的影響，探討葡萄糖對鵝肝細(xì)胞增殖能力的影響，為探明碳水化合物在水禽肥肝形成過程中的作用機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試動物 試驗用四川白鵝由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)禽場提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑包括Ⅳ型膠原酶、胰酶、青霉素、鏈霉素雙抗(Gibco公司)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS,PAA公司)，PBS(Solarbio公司)，Total RNA Kit Ⅰ試劑盒(Omega公司)，SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(Takara公司)；主要儀器有二氧化碳培養(yǎng)箱、熒光定量PCR儀、熒光顯微鏡、酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.2 方 法

1.2.1 原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采用半原位二步膠原酶灌注法[10]，分離3只四川白鵝的肝細(xì)胞。將肝細(xì)胞接種到35 mL培養(yǎng)皿、24或96孔培養(yǎng)板中，靜置在40 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后用PBS清洗3次后更換為體積分?jǐn)?shù)10%血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后換無血清培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換為添加不同濃度(0(CK)，5，20,35 mmol/L)葡萄糖的無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取樣。每處理重復(fù)3次。

1.2.2 肝細(xì)胞的BrdU 免疫熒光染色 在葡萄糖誘導(dǎo)培養(yǎng)后的肝細(xì)胞中加入BrdU (終質(zhì)量濃度為3 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2～4 h后，用體積分?jǐn)?shù)2%多聚甲醛固定30 min，用2 mol/L HCl處理30 min，0.1 mol/L硼酸鈉中和，體積分?jǐn)?shù)5%血清封閉1 h，加BrdU抗體 (稀釋倍數(shù)1∶100)，室溫下放置1 h；之后加入二抗室溫孵育1 h。每張細(xì)胞爬片滴加DAPI溶液(終質(zhì)量濃度1 μg/mL)孵育3 min，用PBS沖洗3次后晾干。顯微鏡下觀察細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果并記數(shù)。BrdU陽性細(xì)胞率=綠色熒光點數(shù)/藍(lán)色熒光點數(shù)。結(jié)果為3次相互獨立試驗的平均值。

1.2.3 肝細(xì)胞的BrdU-雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測 在96孔板的肝細(xì)胞中加入葡萄糖處理24 h后，每孔加入10 μL BrdU標(biāo)記細(xì)胞。棄去上清液后加入固定液(含體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛 PBS)，于室溫下固定30 min使DNA變性，洗滌3次后加入BrdU一抗，洗滌后加入山羊抗小鼠IgG過氧化物酶共軛結(jié)合物，洗滌后添加3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)過氧化物酶作用底物，之后加入終止反應(yīng)液終止反應(yīng)，將96孔板放酶標(biāo)免疫檢測儀上用450 nm波長檢測各孔吸光度(OD450)。OD450值越高，表示樣品中DNA含量越高。

1.2.4 肝細(xì)胞中Cyclin D1蛋白質(zhì)量濃度的測定 采用ELISA法檢測Cyclin D1蛋白的質(zhì)量濃度，具體按照Cyclin D1蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒的說明書操作。

1.2.5 肝細(xì)胞中Cyclin D家族3個基因mRNA表達(dá)水平的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測 采用Trizol試劑 (Invitrogen,USA )提取肝細(xì)胞RNA，之后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer ScriptTMRT system kit (TaKaRa,Japan)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光定量PCR法對CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。所用引物見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Premix ExTaqTM12.5 μL，上、下游引物(10 mmol/L)分別0.5 μL，模板cDNA 2 μL，余下用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。每個循環(huán)后采集熒光生成擴(kuò)增曲線， 62～92 ℃緩慢升溫，產(chǎn)生熔點曲線,檢測引物特異性。所有樣本設(shè)3個重復(fù)，并在每次試驗時設(shè)陰性對照(不加cDNA模板，用ddH2O補(bǔ)充)。用2-ΔΔCt法[11]計算目標(biāo)基因的mRNA相對表達(dá)水平，以內(nèi)參基因18S和β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度葡萄糖對鵝原代肝細(xì)胞增殖及其DNA含量的影響

BrdU-ELISA免疫熒光染色結(jié)果見圖1，圖1中綠色為BrdU染色細(xì)胞，即為增殖細(xì)胞；藍(lán)色為DAPI細(xì)胞核染色。從圖1可以看出，隨著葡萄糖濃度的增加，染成綠色的BrdU陽性細(xì)胞增多。在35 mmol/L葡萄糖處理組中，染色呈現(xiàn)綠色的細(xì)胞數(shù)量最多，并且綠色細(xì)胞團(tuán)變大，表明肝細(xì)胞增殖較其他3組明顯。

圖1 不同濃度葡萄糖處理后鵝原代肝細(xì)胞BrdU 免疫熒光染色結(jié)果(×200)
A、B、C、D分別表示用0，5，20 和35 mmol/L葡萄糖處理后的肝細(xì)胞
Fig.1 BrdU immunofluorescence cell staining after glucose treatment(×200)
A,B,C,and D indicate glucose treatments with concentrations of 0,5,20 and 35 mmol/L,respectivey

從圖2可以看出，BrdU陽性細(xì)胞率隨葡萄糖濃度的升高而增大，與對照組(0 mmol/L葡萄糖)相比，5 mmol/L葡萄糖的促進(jìn)作用不顯著，20和35 mmol/L葡萄糖顯著促進(jìn)了鵝原代肝細(xì)胞的增殖(P<0.05)，表明葡萄糖能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

從圖3可以看出，與對照組相比，5和20 mmol/L葡萄糖對原代肝細(xì)胞中的DNA含量沒有顯著影響，而35 mmol/L葡萄糖可以顯著促進(jìn)原代肝細(xì)胞中DNA含量的升高(P<0.05)。

2.2 不同濃度葡萄糖對鵝肝細(xì)胞中Cyclin D1蛋白質(zhì)量濃度的影響

圖4顯示，與對照組相比，5和20 mmol/L葡萄糖對Cyclin D1蛋白質(zhì)量濃度影響不顯著(P>0.05)；當(dāng)葡萄糖濃度為35 mmol/L時，Cyclin D1蛋白的質(zhì)量濃度顯著增加(P<0.05)。

2.3 不同濃度葡萄糖對Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3基因表達(dá)的影響

不同濃度葡萄糖對CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3基因表達(dá)的影響見圖5。

圖5顯示，CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3的mRNA表達(dá)水平都隨著葡萄糖濃度的升高而呈上升趨勢。與對照組相比，其中5 mmol/L葡萄糖對CyclinD1、CyclinD2和CyclinD3基因的 mR-NA表達(dá)水平都無顯著影響；與5 mmol/L葡萄糖相比，20 mmol/L葡萄糖對CyclinD1 mRNA表達(dá)水平影響顯著，而對CyclinD2和CyclinD3 mRNA表達(dá)水平無顯著影響(P<0.05)；35 mmol/L葡萄糖能顯著提高Cyclin D家族3個基因的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。

3 討 論

葡萄糖是動物體主要的能源物質(zhì)，對細(xì)胞的生長和增殖有重要影響。研究表明，高濃度葡萄糖能增加G0/G1期細(xì)胞的百分比，降低S期細(xì)胞的百分比[12]。研究顯示，低濃度葡萄糖能促進(jìn)MG63細(xì)胞和大鼠原代培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞的增殖能力，而高濃度葡萄糖能降低MG63細(xì)胞和大鼠原代培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞的增殖能力[4,13]。Gupta等[14]研究結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖對MCF-7細(xì)胞影響不顯著，但能明顯增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞增殖。有研究表明，高濃度葡萄糖能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞及血管系膜細(xì)胞的增殖[14-15]。以上研究表明，不同類型細(xì)胞對葡萄糖的耐受能力存在差異。本試驗結(jié)果表明，葡萄糖能顯著促進(jìn)鵝原代肝細(xì)胞增殖，低濃度(0和5 mmol/L)葡萄糖對肝細(xì)胞增殖影響不顯著，高濃度(20和35 mmol/L)葡萄糖能顯著促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，說明鵝肝細(xì)胞對葡萄糖耐受能力較強(qiáng)。

Cyclin D家族(Cyclin D1、D2、D3)是重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子。研究表明，葡萄糖可以通過影響Cyclin D家族相關(guān)因子來調(diào)控細(xì)胞增殖。在胰腺 β-細(xì)胞中，葡萄糖以時間依賴式促進(jìn)CyclinD1基因的表達(dá)[16]。在MDA-MB-231細(xì)胞中，高濃度葡萄糖可提高Cyclin D1蛋白濃度，但在MCF-7細(xì)胞中高濃度葡萄糖對其沒有影響[14]。對細(xì)胞周期蛋白基因的分析證實，在出生后小鼠和胰島素抗性小鼠中，Cyclin D2對于β-細(xì)胞增殖非常重要[17-20]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核1缺失的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，葡萄糖匱乏可明顯降低CyclinD3 mRNAs的表達(dá)水平[21]。有研究表明，葡萄糖對β-細(xì)胞CyclinD2激活時需要先對鈣離子通道進(jìn)行激活[22]。有研究認(rèn)為，敲除碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)后降低了小鼠、大鼠和人β細(xì)胞CyclinD2的表達(dá)水平[23]。Cyclin D家族通過與周期素依賴性蛋白激酶結(jié)合來實現(xiàn)其對細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化的調(diào)控功能，從而實現(xiàn)對細(xì)胞增殖的調(diào)控[24]。本試驗結(jié)果表明，葡萄糖能夠提高Cyclin D1的質(zhì)量濃度，并促進(jìn)CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3基因的表達(dá)?？芍咸烟悄軌蛲ㄟ^激活細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin D家族來促進(jìn)鵝原代肝細(xì)胞的增殖。

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Effect of glucose on cell proliferation of goose primary hepatocytes

YE Feng-jiang,HAN Chun-chun,LIU Dan-dan,WAN Huo-fu,YANG Wen-lan, WENG Meng-ke,GOU Dan,GONG jin-xiang

(InstituteofAnimalbreeding&Genetic,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

【Objective】 This study aimed to detect the effect of glucose on the proliferation capability of the goose hepatocytes.【Method】 Goose primary hepatocytes were isolated from Sichuan White Goose using semi-in situ two-step collagenase perfusion isolation procedure and treated with different glucose solutions (0 (CK),5,20,and 35 mmol/L).After 48 h,the rate of BrdU positive cells was measured by BrdU immunofluorescence staining method,the DNA was measured by BrdU-ELISA method,and protein contents of genes involved in cell proliferation were measured by ELISA.Relative mRNA levels ofCyclinD1,CyclinD2 andCyclinD3 were also determined by reverse transcription polymerase chain reaction.【Result】 Compared with control group,20 and 35 mmol/L glucose solutions significantly increased the rates of BrdU positive cells and promoted the DNA contents of goose hepatocytes.5 and 20 mmol/L glucose solutions had no evident effect on protein content of Cyclin D1,while 35 mmol/L glucose significantly increased the protein content of Cyclin D1.Relative mRNA levels ofCyclinD1,CyclinD2 andCyclinD3 increased with the rising of glucose concentration, and the promoting effect at 35 mmol/L glucose was bigger than those of other groups. 【Conclusion】 Glucose could promote the cell proliferation of goose primary hepatocytes.

glucose;goose primary hepatocytes;cell proliferation

2013-10-16

國家自然科學(xué)基金項目(31101712)；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(201151103120006)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生科研興趣培養(yǎng)計劃項目(2013015)

葉鳳江(1991-)，女，廣西桂林人，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖研究。E-mail:8744107416@qq.com

韓春春(1980-)，女，山東安丘人，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。 E-mail：chunchunhai_510@163.com

時間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.005

S835；Q78

A

1671-9387(2015)02-0038-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.005.html