調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞與移植免疫耐受的研究進(jìn)展

葉鵬程，向琴，肖江衛(wèi)

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充 637000)

自1973年斯坦曼和科恩發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)以來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到DCs在調(diào)控先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色，能夠恰到好處地將外源性病原信號(hào)傳遞給淋巴細(xì)胞并啟動(dòng)與之相適應(yīng)的免疫反應(yīng)。近年來的研究表明DCs是一群具有明顯異質(zhì)性的細(xì)胞群體，不同成熟狀態(tài)、不同組織來源及不同的細(xì)胞亞群的DCs表現(xiàn)出不同的表型及產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子并誘導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)。其中，調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞(regulatory dendritic cells，DCreg)則是一群具有負(fù)向免疫調(diào)控功能亞群，其功能特點(diǎn)與作用機(jī)制的研究是該領(lǐng)域近年來的重要進(jìn)展之一。器官移植是治療終末期細(xì)胞或器官功能衰竭首選的、有效的治療手段。迄今已有許多成功的先例，然而免疫排斥反應(yīng)嚴(yán)重地制約著該項(xiàng)治療措施的廣泛開展，雖然抑制免疫排斥反應(yīng)的新藥不斷問世，但除了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)外，藥物本身的副作用也給患者帶來了十分不利的影響。因此，人們致力于尋找一種在不使用免疫抑制劑的情況下保證移植物的長期有功能地存活的有效方法，利用DCreg介導(dǎo)負(fù)向免疫調(diào)節(jié)的特性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生移植免疫耐受便是其中一種。隨著對(duì)其功能及作用機(jī)制的不斷認(rèn)識(shí)，DCreg在誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)中已取得一定成功，這為解決移植排斥反應(yīng)打開了另一扇新的大門。

1 DC與DCreg的生物學(xué)特性

DC是一群復(fù)雜的血源性細(xì)胞，多起源于骨髓，其前體細(xì)胞為CD34+造血干細(xì)胞，經(jīng)骨髓進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。人體中DC數(shù)量極少，其含量不足外周血中單核細(xì)胞的1%。之前的觀點(diǎn)認(rèn)為DCs分布于除腦以外的全身組織器官中，后來研究顯示在胸腺、次級(jí)淋巴組織以及外周組織，如皮膚、黏膜表面、小腸、肺及母體子宮蛻膜中都發(fā)現(xiàn)了 DCs［1］。Li等［2］還在小鼠模型的大腦中分離出大量的CD11b+CD11c+DCs，這種DCs能促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)的增殖，從而抑制免疫應(yīng)答，此發(fā)現(xiàn)刷新了人們對(duì)DCs組織分布的認(rèn)識(shí)。

DCs根據(jù)分化來源不同主要分為兩種，即“經(jīng)典”髓系 DCs(“conventional”myeloid DC，cDC)和漿細(xì)胞DCs(plasmacytoid DC，pDC)，研究發(fā)現(xiàn)cDC與pDC無論在表面標(biāo)志還是功能上均存在著一定的差異［3-4］。pDC僅為DCs中一個(gè)小的亞群，主要聚積于血液和淋巴組織中，通過血液循環(huán)進(jìn)入淋巴結(jié)。pDC的表型為CD4+CD112+CD132+CD332+CD45RA+IL23Rα(CD123+)，低水平表達(dá) MHC-Ⅱ分子及共刺激分子，同時(shí)他們也表達(dá)窄范圍的識(shí)別模式受體(PRRS)，包括TCR7和TCR9。在負(fù)載外源性核酸時(shí)他們還能產(chǎn)生大量的I型IFN，同時(shí)獲得抵抗外源性抗原的能力［5］。cDC是除pDC之外的DC，填充于大多數(shù)淋巴組織和非淋巴組織中，cDC前體細(xì)胞在GM-CSF、TNF-a和IL-4作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槲闯墒?DC(immature DC，imDC)，再經(jīng) CD40L或內(nèi)毒素刺激而成熟，其表型為 CD11c+CD13+CD33+GM-CSF2Rα+CD42+。cDC具有強(qiáng)大的監(jiān)視組織損傷，捕獲環(huán)境中的抗原，處理并提呈致病性抗原的能力。此外cDC還能產(chǎn)生強(qiáng)大的抗外源性抗原的免疫力，也能通過多種機(jī)制對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫耐受［6-7］。

DCs是一群異質(zhì)性細(xì)胞，不同的發(fā)育階段及不同來源的DCs在表面特異性標(biāo)志及功能上均存在著差異。成熟的DC(mature DC，mDC)表達(dá)高水平的MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成為具有獨(dú)特細(xì)胞因子分泌性的效應(yīng)T細(xì)胞。然而體內(nèi)大部分的DCs都處于未成熟狀態(tài)，與mDC相比imDC低水平表達(dá)MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子，也表達(dá)趨化因子受體(CCR7)，具有極強(qiáng)的抗原吞噬力［8］。imDC雖然僅有較弱的活化T細(xì)胞的能力，但能抑制細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)免疫耐受［9］。

O’Connell等［10］通過靜脈輸注 imDC 觀察它對(duì)同種異體小鼠心臟移植物存活時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)imDC能夠明顯延長移植物存活時(shí)間。此外Fu等［11］和 Lu 等［12］通過研究 imDC(CD205+，MHC-Ⅱ，CD40dimCD80dimCD86dim)與大鼠同種異體心臟移植物存活時(shí)間的關(guān)系，提出imDC具有強(qiáng)大的免疫耐受性，能夠誘導(dǎo)移植免疫耐受。鑒于imDC具有較弱的活化T細(xì)胞的能力，并能誘導(dǎo)Treg的增殖以誘導(dǎo)免疫耐受，早期部分學(xué)者便認(rèn)為imDC就是DCreg的原型。

DCreg被認(rèn)為是一群具有強(qiáng)大的免疫抑制功能的DCs已不再是一件新奇的事情，然而迄今為止人們對(duì)DCreg的生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)仍存在一定的爭議。之前認(rèn)為DCreg表達(dá)高水平的MHC分子及極低水平表達(dá)共刺激分子，誘導(dǎo)CD4+和CD8+的Treg細(xì)胞的產(chǎn)生與增殖，進(jìn)而預(yù)防移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)或誘導(dǎo)同種異體腎移植免疫耐受［13-14］，然而后來的研究發(fā)現(xiàn)其高水平表達(dá)CD80、CD86等共刺激分子，具有IL-10分泌性的DCreg依然能誘導(dǎo)CD4+Treg的產(chǎn)生［15］。Isomura等［16］研究發(fā)現(xiàn)DCreg不但高水平表達(dá)MHC分子及共刺激分子，同時(shí)還表達(dá)B7-H1、B7-DC和B7-H3分子，能夠阻斷DTH的誘導(dǎo)通路。此外還有報(bào)道稱DCreg表達(dá)低水平的MHC-Ⅱ、CD86和 CD11c，高水平表達(dá)CD80、CD40和CD11b，能分泌IL-10和NO，且能活化幼稚T細(xì)胞，但不能產(chǎn)生IL-12和TGF-β，也不能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞。因此對(duì)于DCreg特異性表面標(biāo)志物仍還存在很大爭議，但DCreg的免疫耐受性或免疫調(diào)節(jié)功能在移植免疫耐受、過敏反應(yīng)、自身免疫性疾病中起重要的作用這一結(jié)論已被反復(fù)驗(yàn)證［17］。

2 DCreg與移植免疫耐受

細(xì)胞或器官移植是治療終末期細(xì)胞或器官功能衰竭的有效的、首選的治療手段。迄今已有很多成功的先例，然而細(xì)胞或器官移植仍嚴(yán)重受限于供體短缺及免疫排斥反應(yīng)。雖然抑制免疫排斥反應(yīng)的新藥不斷問世，但仍存在較多的毒副作用［18］。

DCreg具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能，能夠通過多種機(jī)制誘導(dǎo)免疫耐受，因此DCreg可以為器官移植免疫排斥反應(yīng)的治療提供新的思路，而這一思路在動(dòng)物移植模型中已得到較為成熟的應(yīng)用。朱杰昌等［19］等給心臟移植術(shù)后的小鼠輸注以針對(duì)小鼠CIM0基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)慢病毒載體在體外感染供者骨髓來源的DC制備的低表達(dá)CD40的耐受性DCreg，可以誘導(dǎo)移植免疫耐受從而延長小鼠移植心臟的存活時(shí)間。Ezzelarab等在一個(gè)恒河猴同種異體腎移植模型中發(fā)現(xiàn)，供體血液來源的單核細(xì)胞經(jīng) VD3，IL-10，GM-CSF及 IL-4刺激后分化為低水平表達(dá)MHC-Ⅱ分子及共刺激分子，較高水平表達(dá)B7-H1的DCreg。于腎移植前7 d連同B7-CD28阻斷劑CTLA-4Ig一起將DCreg經(jīng)靜脈輸入受體后能明顯延長移植物的存活時(shí)間(對(duì)照組平均存活時(shí)間39.5 d，實(shí)驗(yàn)組平均存活時(shí)間113.5 d)。通過免疫監(jiān)視發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DCreg治療的受體內(nèi)出現(xiàn)了與供體相關(guān)的記憶T細(xì)胞，且Treg/記憶T細(xì)胞的比率呈逐漸下降的趨勢，這與DCreg具有較高的促進(jìn)CD95記憶T細(xì)胞凋亡以及較弱活化同種異體T細(xì)胞能力相關(guān)。此外該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了DCreg與共刺激分子阻斷劑聯(lián)合使用能夠誘導(dǎo)移植免疫耐受，且能提高腎移植存活率［20］。Huang 等［21］在MHC分子不完全匹配的造血干細(xì)胞移植模型中發(fā)現(xiàn)，表型為CD8α+Jagged2highCD11bhigh的DCreg能降低GVHD的癥狀，延緩GVHD模型的死亡，這主要與DCreg上調(diào)Jagged1、Jagged2表達(dá)以及激活T細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)，但延長的時(shí)間不是太長，且需要反復(fù)多次的注射。

3 DCreg誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制

3.1 DCreg本身不能有效地活化效應(yīng)T細(xì)胞

一般而言，T細(xì)胞在介導(dǎo)移植細(xì)胞、組織或器官破壞的免疫反應(yīng)中起著最為核心的作用，同時(shí)在控制這些對(duì)機(jī)體或移植物有害的反應(yīng)也起著至關(guān)重要的作用［22］。然而T細(xì)胞在接受抗原刺激后完全活化依賴于雙信號(hào)的刺激及相應(yīng)的細(xì)胞因子，DCreg通常極低水平表達(dá)共刺激分子，而CD40、B7等共刺激分子又是T細(xì)胞活化所必須的第二信號(hào)，因此DCreg無法活化T細(xì)胞而導(dǎo)致T細(xì)胞“無能”或低反應(yīng)性，從而誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受［23］。

3.2 DCreg能夠誘導(dǎo)Th1型或Th2型應(yīng)答的偏移

在移植免疫中，Th1反應(yīng)常介導(dǎo)明顯的急性排斥反應(yīng)從而使移植物喪失功能，而Th2反應(yīng)則常參與免疫耐受。被活化的Th0分化為Th1或Th2細(xì)胞，分別介導(dǎo)Thl或Th2反應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，DCs是控制Th0細(xì)胞分化成Th1或Th2細(xì)胞的關(guān)鍵因素。DCreg能夠通過誘導(dǎo)Th2反應(yīng)使得機(jī)體對(duì)移植物或外來抗原發(fā)生免疫耐受［24］。Gorczynski等［25］發(fā)現(xiàn)經(jīng)門靜脈注射DCreg可以延長同種異體皮膚移植物的存活時(shí)間，這可能與分泌 IL-4和 IL-10的Th2細(xì)胞分化相關(guān)。

3.3 DCreg能有效地誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生

DCreg除了能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞“無能”或促進(jìn)T細(xì)胞清除外，還能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，這是DCreg誘導(dǎo)免疫耐受最為重要的機(jī)制。Jonuleit等［26］在研究不同成熟狀態(tài)的DCs對(duì)T細(xì)胞的分化發(fā)育的作用的實(shí)驗(yàn)中，將人CD83-DC與CD83+DC分別與幼稚的同源異體T細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將mDC反復(fù)刺激CD4+幼稚T細(xì)胞，能明顯地促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，然而將imDC反復(fù)刺激T細(xì)胞卻表現(xiàn)出不可逆的抑制T細(xì)胞增殖的特性，這種抑制在經(jīng)mDC、外周單核細(xì)胞及IL-2的作用下均無法恢復(fù)。在后來的研究中證實(shí)imDC能夠促幼稚T淋巴細(xì)胞分化為具有IL-10分泌性的T細(xì)胞，同時(shí)高水平表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(英文名稱，CTLA-4)和CD25，體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)該群T細(xì)胞能夠抑制T淋巴細(xì)胞增殖，具有 Treg 細(xì)胞的特性［27］。Fallarino 等［28］發(fā)現(xiàn)經(jīng)CD3抗體活化的CD4+CD25+Treg過度表達(dá)CTLA4，同時(shí)調(diào)控DC表達(dá)吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine-2，3-dioxyge-nase，IDO)，而這種結(jié)果需要DC表達(dá)B7及IFN-γ。此外在這同一研究中CD4+CD25+Treg經(jīng)LPS活化后通過CTLA-4誘導(dǎo)DC細(xì)胞內(nèi)色氨酸的分解代謝，從而引起T細(xì)胞增殖必需的色氨酸缺乏而抑制T細(xì)胞應(yīng)答。Martín-Gayo等［29］發(fā)現(xiàn)人類胸腺中的pDC經(jīng)CD40L及IL-3激活后能夠有效地促進(jìn)歷經(jīng)胸腺陽性選擇表型為CD69highTCRhigh的CD4+CD8+胸腺細(xì)胞分化為具有免疫抑制功能的CD4+CD25+Foxp3+Treg。與mDC相比，成熟的pDC增加了ICOS-L的表達(dá)，這與誘導(dǎo)具有IL-10分泌的Treg相關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)在大鼠體內(nèi)，pDC能夠通過上調(diào)IDO的表達(dá)來下調(diào)T細(xì)胞的反應(yīng)性［30］。Chu等［31］在皮膚的真皮層中發(fā)現(xiàn)一種具有免疫調(diào)節(jié)功能及IL-10分泌性的CD141(BDCA3)+DC，能夠交叉遞呈自身抗原給自身反應(yīng)性T細(xì)胞。此外還發(fā)現(xiàn)CD141(BDCA3)+DC具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)Treg的發(fā)生能力，從而抑制皮膚炎癥反應(yīng)。

Fehervari等［32］發(fā)現(xiàn)當(dāng) DCs暴露于抗炎細(xì)胞因子或免疫抑制分子中會(huì)促使DC表現(xiàn)出免疫抑制的特性［33］，例如體外培養(yǎng)的DCs中加入抗炎因子如維生素 A、維生素 D3、PGE2、IDO、IL-10、TGF-β、HGF后能夠表現(xiàn)出免疫耐受性［34-36］，這些具有免疫耐受性的DCs能夠誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，并能抑制動(dòng)物模型建立的自身免疫性疾病，如1型糖尿病和多發(fā)性硬化癥。此外，這些DCs通過基因操縱過度表達(dá)免疫調(diào)節(jié)分子或免疫抑制因子，沉默免疫活化因子促進(jìn)免疫耐受［37］。

體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DCreg具有調(diào)控免疫抑制反應(yīng)和促進(jìn) Treg分化與增殖的能力，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在DCreg與Treg之間存在一個(gè)“反饋調(diào)節(jié)”環(huán)，兩者之間通過反饋調(diào)節(jié)環(huán)相互作用，在機(jī)體免疫平衡的狀態(tài)下減少Treg，DCreg細(xì)胞內(nèi)Flt3活性則會(huì)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)Treg穩(wěn)定增殖;相反，當(dāng)增加DCs時(shí)會(huì)通過DC細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子的積累來促進(jìn)Treg細(xì)胞的分裂。

Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能，專職對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)控的異質(zhì)性T淋巴細(xì)胞亞群，它與自身耐受、移植物耐受和腫瘤的逃逸等有密切關(guān)系［38］。Sakaguchi等證實(shí)，體內(nèi)剔除受體小鼠CD4+CD25+Treg會(huì)增強(qiáng)移植免疫排斥反應(yīng)，明顯降低移植物的存活時(shí)間。然而給免疫力重建的小鼠回輸同系CD4+CD25+Treg則能顯著地延長移植物的存活時(shí)間，這表明CD4+CD25+Treg細(xì)胞參與了移植免疫耐受的誘導(dǎo)。Dong等［39］為了明確CD4+Treg的異質(zhì)性，利用多參數(shù)單細(xì)胞分析技術(shù)分析 CD4+Treg，分析發(fā)現(xiàn)與普通患者相比嚴(yán)重缺乏幼稚表型的Treg的患者在行同種異體造血干細(xì)胞移植后短期內(nèi)會(huì)表現(xiàn)出急性GVHD。Li等［40］通過心臟移植動(dòng)物模型研究CD8+Treg對(duì)經(jīng)CD40Ig處理過后的小鼠心臟移植物的影響，發(fā)現(xiàn)CD8+Treg能明顯延長移植物的存活時(shí)間。此外還發(fā)現(xiàn)CD8+的Treg細(xì)胞及pDCs聚集于同種異體移植物及受體的脾臟，但不聚集于淋巴結(jié)內(nèi)，這可能與血管移植受體所誘導(dǎo)的免疫耐受相關(guān)。

3.4 促使抗原特異性的T細(xì)胞的凋亡

Fas穩(wěn)定表達(dá)于胸腺細(xì)胞及成熟的T細(xì)胞，參與胸腺的陰性選擇及識(shí)別自身抗原的T細(xì)胞的克隆清除。表達(dá)FasL的DCreg通過Fas-FasL作用誘導(dǎo)活化了的抗原特異性的T細(xì)胞的凋亡。小鼠骨髓來源的DC經(jīng)GM-CSF及IL-4共同孵育可表達(dá)FasL，以計(jì)量依賴方式誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞的凋亡［41］。

3.5 參與DCreg誘導(dǎo)免疫耐受的重要的細(xì)胞因子

(1)IL-10:IL-10主要通過減少M(fèi)HC-Ⅱ類分子、共刺激分子及細(xì)胞黏附分子等抑制DC的成熟，還能減少炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-12等的合成，進(jìn)而抑制T細(xì)胞活化及增殖。(2)轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β):Ramalingam 等［42］發(fā)現(xiàn)經(jīng) TGF-β 誘導(dǎo)后，DC表面共刺激分子、MHC類分子表達(dá)下降，并明顯抑制了混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中同種異體T細(xì)胞增殖，說明TGF-β可以降低DCs的成熟狀態(tài)，從而抑制T細(xì)胞活化、增殖。(3)一氧化氮(NO):DCreg在暴露于血清蛋白、自身循環(huán)蛋白時(shí)，可表達(dá)高水平的誘導(dǎo)性的一氧化氮合酶，促進(jìn)NO的生成。NO作為一類重要的細(xì)胞信號(hào)分子，既能激活初始T細(xì)胞，也能抑制T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)免疫耐受。(4)IDO:吲哚胺2，3-雙加氧酶是色氨酸分解的限速酶，而色氨酸是T淋巴細(xì)胞尤其是抗原活化了的T細(xì)胞增殖所必需的氨基酸。因此，DCreg細(xì)胞高水平表達(dá)吲哚胺2，3一雙加氧酶將促進(jìn)色氨酸分解代謝，加快色氨酸的耗竭，能很大程度上抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，從而誘導(dǎo)免疫耐［43-44］。

雖然DCreg能夠通過上述多種機(jī)制誘導(dǎo)免疫耐受，并在一定程度上延長移植物的存活時(shí)間，但其誘導(dǎo)的移植免疫耐受常不穩(wěn)定，容易被逆轉(zhuǎn)。因此，怎樣才能誘導(dǎo)出持續(xù)恒定的免疫耐受仍是亟待解決的問題。就目前的研究現(xiàn)狀而言，多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用單一方式即僅通過靜脈輸注體外培養(yǎng)的DCreg以誘導(dǎo)免疫耐受，在強(qiáng)度以及持續(xù)時(shí)間上都存在一定的不足。能否通過聯(lián)合使用免疫抑制劑或共刺激分子阻滯劑或其他方式來誘導(dǎo)、維持更長效更強(qiáng)的免疫耐受?這值得我們進(jìn)一步深入研究探討。

4 小結(jié)

綜上所述，DCreg是一群具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)的DC，能夠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型免疫耐受，延長移植物的存活時(shí)間，改善GVHD的癥狀。DCreg誘導(dǎo)免疫耐受主要通過以下方式:(1)減少效應(yīng)T細(xì)胞的活化;(2)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生;(3)促使抗原特異性T細(xì)胞的凋亡，其中誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生是DCreg誘導(dǎo)免疫耐受最為重要的機(jī)制。隨著對(duì)DCreg研究的不斷深入，其在移植免疫耐受、自身免疫性疾病、慢性感染性疾病及腫瘤等疾病的發(fā)病和治療的研究中可作為新的靶點(diǎn)發(fā)揮重要作用。因此，如何利用DCreg誘導(dǎo)強(qiáng)效、持續(xù)、穩(wěn)定的免疫耐受將是我們亟需解決的問題。

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