腺病毒介導的p53基因治療肝癌的基礎與臨床研究進展

汪 猛，王麗娜，凌昌全

(1. 上海中醫(yī)藥大學岳陽臨床醫(yī)學院，上海 200437；2. 第二軍醫(yī)大學,上海 200433)

綜 述

腺病毒介導的p53基因治療肝癌的基礎與臨床研究進展

汪 猛1，王麗娜2，凌昌全2

(1. 上海中醫(yī)藥大學岳陽臨床醫(yī)學院，上海 200437；2. 第二軍醫(yī)大學,上海 200433)

腺病毒；p53；基因治療；肝癌；研究進展

p53蛋白基因的失活在腫瘤形成過程中起著重要作用，是具有明確抑癌作用的基因，目前對其結構和功能的研究較為透徹。研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白不僅在細胞核內(nèi)能抑制腫瘤細胞，在細胞質(zhì)中也能誘導癌細胞凋亡[1]。有60%以上的腫瘤存在p53基因的異常(包括點突變、等位基因缺失、重排、插入、基因融合等)[2]。而在肝癌發(fā)病過程中，p53基因的異常更是普遍存在的，Kondo等[3]用復色熒光原位雜交法發(fā)現(xiàn)：58.8%的肝癌p53基因是缺失的。

目前，通過腺病毒介導將人正常p53基因?qū)肴梭w，去糾正p53基因的缺陷以發(fā)揮多種抗腫瘤治療作用，已作為一種治療方法開始應用于臨床。進入人體之后，腺病毒會感染腫瘤靶細胞并把攜p53治療基因的腺病毒基因傳遞給細胞質(zhì)和細胞核，進行p53基因的表達和翻譯，從而發(fā)揮其抑癌基因的功能[4]。2004年，腫瘤基因治療藥物“今又生”已作為世界第一個重組人p53腺病毒在中國上市，它由正常人腫瘤抑制基因p53和改構5型腺病毒基因重組而成。多年來，國內(nèi)外對Ad-p53治療方法已開展了大量基礎與臨床研究，也包括對肝癌治療的研究。Ad-p53作為一種有效的基因治療制品，正逐漸發(fā)揮出重要的應用價值，現(xiàn)對Ad-p53治療肝癌的研究作一綜述。

1 基礎研究

1.1腺病毒介導的p53基因?qū)Ω伟┑囊种谱饔?/p>

1.1.1 Ad-p53能夠明顯抑制肝癌細胞的增殖 張沁宏等[5]研究發(fā)現(xiàn)Ad-p53對SMMC-7721細胞的抑制作用呈濃度依賴性。當Ad-p53在100MOI效靶比時，基本能完全抑制SMCC-7721細胞。感染2 d后P53蛋白表達達到高峰，SMCC-7721生長受到明顯抑制。瘤內(nèi)注射Ad-p53后，荷瘤裸鼠的腫瘤體積明顯減小。Jong等[6]構建rAd-p53來治療荷HuH7種植瘤裸鼠，結果表明，rAd-p53可以有效地治療p53突變的肝細胞癌。

1.1.2 多種Ad-p53給藥方式均具有明顯療效 動物實驗研究的復雜性還體現(xiàn)在Ad-p53給藥方式的多樣性。除以上提及的瘤內(nèi)注射給藥方式外，在進行肝癌治療時，已有學者報道了經(jīng)動物模型肝動脈、門靜脈以及全身靜脈給藥的治療效果。有研究指出肝動脈給藥效果優(yōu)于全身靜脈給藥，如Anderson等[7]設計了經(jīng)肝動脈注射rAd-p53治療肝臟腫瘤的方案，用攜突變型p53基因的肝癌細胞株MCA-RH7777構建同系鼠肝癌模型，肝動脈給予制品，結果腫瘤的生長受到明顯抑制，與全身靜脈給藥相比，提高了腫瘤組織轉(zhuǎn)基因表達，減少了全身暴露，顯示出肝動脈途徑傳遞rAd-p53的可行性。Okimoto等[8]的研究采用肝動脈、門靜脈注射AdCMV-p53治療RCN-9結腸癌肝轉(zhuǎn)移荷瘤鼠，結果顯示，經(jīng)門靜脈組腫瘤大小為(43.7±6.9)mm，大于經(jīng)肝動脈組(16.0±4.9)mm，但小于陰性對照組(88.2±6.7)mm，也說明經(jīng)肝動脈途徑給藥治療效果優(yōu)于門靜脈途徑，但門靜脈途徑也對腫瘤有部分抑制效應，并且實驗中同時應用順鉑(CDDP，3 mg/kg)行腹腔注射，也未導致肝功能受損，進一步表明門脈途徑的安全性。

1.1.3 Ad-p53可以提高放療、化療的敏感性，協(xié)同治療肝癌 放療、化療是肝癌的重要治療方法，研究發(fā)現(xiàn)Ad-p53還可通過提高肝癌細胞對放療、化療的敏感性增強抑癌作用。

1.1.3.1 Ad-p53可以提高肝癌細胞對放療敏感性 張沁宏等[9]以rAd-p53分別感染突變型p53肝癌細胞PLC/PRF/5和野生型p53肝癌細胞SMMC-7721，發(fā)現(xiàn)rAd-p53能顯著抑制人肝癌細胞生長、誘導細胞凋亡并提高細胞的放射敏感性，其對PLC/PRF/5細胞作用顯著強于SMMC-7721細胞；表明不同內(nèi)源性p53狀態(tài)的肝癌細胞對rAd-p53治療及其協(xié)同的放療敏感性可能不同。

1.1.3.2 Ad-p53能夠提高肝癌細胞對化療的敏感性 梁云等[10]采用p53基因型不同的三種人肝癌細胞株HepG2(部分wt-p53)、Hep3B(p53-/+)和PLC/PRF/5(mt-p53)，觀察攜帶wt-p53基因的重組腺病毒聯(lián)合化療藥物爭光霉素、絲裂霉素或甲氨蝶呤對肝細胞的殺傷效應，結果顯示wt-p53基因能提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性。王征旭等[11]也通過構建含人野生型p53抑癌基因的重組腺病毒載體，導入肝癌細胞系HepG2后，分別用光鏡、電鏡、Tunel法檢測細胞凋亡的發(fā)生和在裸鼠體內(nèi)的成瘤性改變。發(fā)現(xiàn)肝癌細胞HepG2導入野生型p53抑癌基因后，出現(xiàn)細胞凋亡，并對化療藥物順鉑的敏感性明顯增加，且其生長受到一定程度的抑制，在裸鼠體內(nèi)的成瘤性也降低。

1.1.4 Ad-p53可以聯(lián)合中醫(yī)藥治療肝癌 得力生注射液臨床用于中晚期原發(fā)性肝癌氣虛瘀滯證，消癌平臨床用于食管癌、胃癌、肺癌，對大腸癌、宮頸癌、白血病等多種惡性腫瘤亦有一定療效，亦可配合放療、化療及手術后治療。張開通等[12]通過腹腔注射建立昆明小鼠H22肝癌腹水瘤模型，發(fā)現(xiàn)Ad-p53、得力生和消癌平均抑制H22細胞生長并減少腹水形成，Ad-p53與中藥得力生、消癌平聯(lián)合腹腔內(nèi)給藥對治療腹水瘤有協(xié)同作用。

1.2 腺病毒介導的p53基因?qū)Ω伟┮种谱饔玫臋C制 現(xiàn)已有多篇文獻報道了Ad-p53可通過多種生物學途徑抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞的凋亡。其中針對肝癌，也有一些學者對其作用機制進行了探索。

Ad-p53主要通過誘導肝癌細胞的凋亡和周期阻滯從而起到抑制肝癌生長的作用。研究發(fā)現(xiàn)其機制與多種細胞因子的蛋白和基因的表達有關。Reister等[13]報道肝癌細胞感染Ad-p53后，P53蛋白在細胞核內(nèi)表達，并伴有p21基因和Bax基因表達增強，CD95基因表達上調(diào)，可能是Ad-p53感染使細胞周期阻滯和誘導凋亡的機制。郭英等[14]報道通過表達wt-p53的重組腺病毒載體，將p53基因?qū)敫伟┘毎曛?，可導致肝癌細胞生長的明顯抑制，促使細胞凋亡，并使細胞周期阻滯于G0/G1期。瘤內(nèi)注射Ad-p53后移植瘤生長明顯受抑制，并出現(xiàn)瘤組織中P53和P21蛋白表達的上調(diào)。張沁宏等[5]也通過免疫組織化學檢測證實Ad-p53感染SMCC-7721細胞后48 h可高表達P53蛋白，到第5天尚可檢測到弱表達的p53，Western blot法檢測到經(jīng)注射Ad-p53的腫瘤組織中可見P53蛋白的高表達。曲波等[15]通過在昆明鼠后肢股部皮下接種Hep-A-22肝癌細胞懸液建立動物模型，其中治療組實驗動物于荷瘤局部皮下注射介導野生型p53基因的復制缺陷型重組腺病毒液，后采用PCR-ELISA法定量檢測昆明鼠肝癌組織端粒酶活性及免疫組化法觀察肝癌細胞中Bcl-2蛋白的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)腺病毒介導的wt-p53基因能夠顯著抑制肝癌的生長，明顯降低端酶的活性表達，下調(diào)Bcl-2基因蛋白的生成。

2 臨床研究

臨床應用過程中藥物的安全性和有效性是學界關注的焦點，腫瘤基因治療的研究種目繁多，目前僅我國的腺病毒介導的p53基因治療制品“今又生”已經(jīng)正式上市。

2.1 Ad-p53治療肝癌的臨床用藥途徑多樣 有學者認為首選途徑為瘤內(nèi)注射，其他給藥途徑也有經(jīng)動脈、靜脈、膽管、腔內(nèi)等[16]。因Ad-p53采用無復制能力的腺病毒作為載體，體液具有對腺病毒的中和作用、存在p53抗體與P53蛋白的反應等，靜脈給藥途徑會影響其療效。具代表性的是在超聲引導下行瘤內(nèi)注射，如貢雪灝等[17]為評價超聲引導下瘤體內(nèi)注射重組人p53腺病毒治療晚期難治性肝癌的臨床療效及超聲導入基因治療的臨床應用價值，對57例晚期肝癌患者行超聲引導下瘤體內(nèi)注射重組人p53腺病毒(rAd-p53)。結果顯示，超聲引導瘤內(nèi)注射既能控制肝癌基因治療的靶向性，又能對基因藥物療效進行影像學評估，具有較高的臨床應用價值。除瘤內(nèi)注射，也有運用其他途徑給藥的，如Habib等[18]用wt-p53-CMV-Ad制品治療319例無法手術切除的、攜突變型p53基因的肝癌患者采用肝動脈灌注給藥。結果表明：腺病毒可成功介導p53基因在腫瘤細胞中持續(xù)表達，并誘導腫瘤細胞凋亡。

2.2 Ad-p53可結合放療、化療等協(xié)同治療肝癌 Ad-p53單獨運用療效有限，臨床上主要是用于結合放療、化療、熱療，提高傳統(tǒng)治療的療效。

2.2.1 Ad-p53可與放療的聯(lián)合運用 Yang等[19]通過研究評價rAd-p53與立體定向放療聯(lián)合運用治療原發(fā)性肝癌的可行性和療效，發(fā)現(xiàn)立體定向放療組和聯(lián)合治療組的1年生存率分別為70.0%和90.0%，1年無病生存率分別為65%和85%，結果提示rAd-p53與立體定向放療聯(lián)合運用比僅行立體定向放療更為安全、有效，這為無法手術或不愿手術的原發(fā)性肝癌患者提供了一個較好的局部療法選擇。

2.2.2 Ad-p53可與化療聯(lián)合運用 Chen等[20]將48例晚期肝癌患者隨機分為2組，治療組30例、對照組18例，所有病例均經(jīng)右髂外動脈入路皮下埋植藥盒系統(tǒng)，并根據(jù)造影表現(xiàn)決定灌注藥物的靶動脈。治療組在靶動脈灌注p53基因制品(今又生)加羥基喜樹堿，每周1次，連續(xù)3周為1個療程，30例患者分別接受1～8個療程的治療；對照組僅行肝動脈灌注羥基喜樹堿。結果顯示，p53基因制品經(jīng)肝動脈序貫輸注是安全的，能夠延長患者的生存時間，聯(lián)合用藥能提高患者存活率。金豐等[21]通過回顧性分析358例肝癌患者，發(fā)現(xiàn)重組人Ad-p53注射液聯(lián)合放化療患者的中位生存時間為22個月，明顯優(yōu)于單獨立體定向放療患者的11個月。也有將其聯(lián)合TACE治療肝癌的，Guan等[22]采用 TACE、經(jīng)皮肝瘤體內(nèi)注入rAd-p53兩種方法治療150例中晚期肝細胞癌患者，其中采用經(jīng)皮肝瘤體內(nèi)注入rAd-p53后聯(lián)合TACE治療中晚期肝細胞癌，并與同期病情相當?shù)闹型砥诟渭毎﹥H行TACE治療相比較，有效率分別為67.6%和51.2%，白細胞下降例數(shù)少，程度輕(P=0.003)；癌性疼痛減輕程度明顯(P=0.017)；治療后Karuafsky評分有顯著性差異(P=0.029)?？梢姡?jīng)皮肝瘤體內(nèi)注入rAd-p53后聯(lián)合 TACE治療肝細胞癌，增強了抗癌效果，改善了患者的生存質(zhì)量。

2.3 Ad-p53聯(lián)合中醫(yī)藥治療肝癌的臨床應用 中醫(yī)藥在肝癌的防治中有著重要的作用，吳孟超院士指出，在放、化療時，服用中藥可減輕毒副反應，提高臨床療效；對不能耐受放、化療的患者，服用中藥在起到一定抑癌作用的同時，對一些并發(fā)癥如黃疸、腹水、疼痛等也有一定的療效，尤其在改善患者生存質(zhì)量、延長生存期方面具有獨到之處[23]。

有學者嘗試將Ad-p53與中藥制劑聯(lián)合運用，取得較好效果。史守良等[24]將40例原發(fā)性肝癌患者隨機分為聯(lián)合組20例和對照組20例，觀察了p53基因治療制品聯(lián)合中藥治療原發(fā)性肝癌的臨床療效，其中對照組給予速溶表柔比星聯(lián)合“今又生”處理，聯(lián)合組在對照組的基礎上加用中藥艾迪注射液治療。聯(lián)合組治療6個月和1年的甲胎蛋白、癌胚抗原含量均低于對照組，肝功能好于對照組；治療后1年的肝內(nèi)腫瘤個數(shù)和大小均好于對照組；治療后1年聯(lián)合組Child-Pugh評分明顯低于對照組?？梢姲献⑸湟郝?lián)合今又生治療原發(fā)性肝癌效果好，可增強p53基因治療的效果。梁杰安[25]臨床治療與觀察研究了重組人p53腺病毒注射液肝動脈灌注療法介入對伴門脈癌栓肝癌的影響，研究組采用p53肝動脈灌注、TACE、中醫(yī)藥配合的綜合治療方法，對照組僅采用TACE與中醫(yī)藥結合的治療方法，2組均于術后根據(jù)其肝癌類型(肝郁脾虛型、氣滯血瘀型、濕熱蘊結型、濕瘀搏結型、肝腎陰虧型)辨證使用中藥。結果發(fā)現(xiàn)2組術后隨訪生存率差異無統(tǒng)計學意義，而術后的并發(fā)癥發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義。提示使用中藥介入對伴門脈癌栓患者實施p53灌注治療有利于降低患者并發(fā)癥發(fā)生率，減輕患者痛苦，此方法有利于提高TACE治療伴PVTT的原發(fā)性肝癌患者的遠期療效。

3 展 望

肝癌的發(fā)病機制非常復雜，p53基因的突變或缺失在肝癌的發(fā)病過程中起著非常重要的作用?；蛑委煹陌l(fā)展開拓了肝癌治療研究的途徑。

國內(nèi)外通過導入外源性p53治療肝癌的基礎研究、臨床研究都取得了很多進展，且研究形式多樣、切合臨床實際。雖然目前該治療方式依然處于早期臨床試驗階段，“今又生”也仍未有足夠的臨床試驗數(shù)據(jù)來確證其抗癌效果，但諸多研究已經(jīng)顯示出這種療法的運用潛力。

Roth[26]認為，在臨床上，作為單一療法，瘤內(nèi)注射Ad-p53有很好的安全性，可使腫瘤縮小、生長受抑；還可用于治療有耐藥性的腫瘤，或提高放療和化療的療效。p53轉(zhuǎn)基因的表達位于高水平，同時能激活p53途徑的其他基因。但是，其臨床運用的不良反應仍值得關注，Gerolami等[27]指出，腺病毒的注射能導致病毒顆粒及轉(zhuǎn)導細胞強烈的免疫反應，釋放IL-6、IL-8、TNF-α等，產(chǎn)生急性炎癥反應，從而在殺死癌細胞的過程中損傷正常的肝細胞，勢必導致患有肝炎、肝硬化患者的肝功能惡化，但在瘤內(nèi)、肝動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)低劑量給藥似乎有很好的耐受性。因此，Ad-p53還需更多的研究來降低其臨床運用的不良反應。

將Ad-p53與介入治療、放療、化療及手術等傳統(tǒng)治療方式綜合運用于臨床，逐漸成為研究的熱點，但其提高肝癌臨床療效的作用仍缺少更高級別的循證醫(yī)學依據(jù)。特別值得一提的是，將基因治療與中醫(yī)藥聯(lián)合運用，無疑是中西醫(yī)結合治療肝癌的一種新模式，但聯(lián)合應用的劑量、時間、給藥途徑等問題都有待更多的探索和研究。

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凌昌全，E-mail:lingchangquan@hotmail.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.041

R735.7

A

1008-8849(2015)21-2388-04

國家自然科學基金資助項目(81303112)；國家基礎科學人才培養(yǎng)基金項目(J1103607)

2014-10-15