不同地理種群麥長管蚜3種次級共生菌檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析

羅 晨， 胡祖慶，于永昂，楊 杰，張改生，趙惠燕

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 植物保護(hù)學(xué)院，b 國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心,國家小麥改良中心楊凌分中心,小麥育種教育部工程研究中心,陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

不同地理種群麥長管蚜3種次級共生菌檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析

羅 晨a， 胡祖慶a，于永昂b，楊 杰a，張改生b，趙惠燕a

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 植物保護(hù)學(xué)院，b 國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心,國家小麥改良中心楊凌分中心,小麥育種教育部工程研究中心,陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

【目的】 次級共生菌Serraticsymbiotica(PASS)、Hamiltonelladefensa(PABS)、Regiellainsecticola(PAUS)廣泛存在于蚜蟲體內(nèi)。研究其在我國麥長管蚜(Sitobionavenae(Fabricius))體內(nèi)的感染情況及遺傳多樣性，為進(jìn)一步研究感染次級共生菌對麥長管蚜的生態(tài)學(xué)和生物學(xué)影響奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?利用16S rDNA特異引物，對陜西楊凌、安徽滁州、陜西五丁關(guān)、河南鄭州、山西太谷和新疆石河子6個(gè)地理種群麥長管蚜體內(nèi)PASS、PABS和PAUS共生菌進(jìn)行了Long-PCR檢測、測序和系統(tǒng)發(fā)育分析?！窘Y(jié)果】 (1)所有6個(gè)地理種群均感染PASS和PAUS(感染率均為100%)，而陜西楊凌、安徽滁州、新疆石河子3個(gè)地理種群感染PABS(感染率15%～70%)，其余3個(gè)地理種群均未感染PABS。(2)16S rDNA序列的比對分析表明，感染PASS、PABS和PAUS的6個(gè)地理種群的株系均具有高度一致的序列。(3)基于16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，我國麥長管蚜體內(nèi)感染的這3種次級共生菌中，PASS和PABS共生菌的親緣關(guān)系較近?！窘Y(jié)論】 PASS和PAUS廣泛存在于中國不同地理種群麥長管蚜體內(nèi)，且具有較低的遺傳多樣性。

麥長管蚜；地理種群；次級共生菌；系統(tǒng)發(fā)育分析；16S rDNA

昆蟲體內(nèi)次級共生菌Serratiasymbiotica(PASS)、Regiellainsecticola(PAUS)和Hamiltonelladefensa(PABS)均屬于γ-變形門菌[1-4]。它們對宿主昆蟲的生長和生活雖不是必需的，但在宿主抵御逆境脅迫時(shí)具有重要的作用。PASS可以幫助寄主抵抗高溫[5-6]；PAUS可以幫助寄主抵抗真菌和影響寄主的取食行為[7-8]；PABS能保護(hù)宿主昆蟲抵抗天敵[9-12]。次級共生菌在自然種群中既可以垂直傳播，也可以水平傳播[13-16]。昆蟲體內(nèi)可以含有一種或多種次級共生菌[17-18]。美國加利福尼亞當(dāng)?shù)爻^80%的昆蟲體內(nèi)都可以檢測到PASS；日本超過35%的昆蟲體內(nèi)含有PASS[19-20]。在中國，對昆蟲體內(nèi)次級共生菌Rickettsia和Wolbachia的檢測已經(jīng)開始[21-22]，但有關(guān)上述3種(PASS、PAUS和PABS)次級共生菌的檢測還未見報(bào)道，而次級共生菌的檢測是研究其對宿主昆蟲生態(tài)學(xué)和生物學(xué)影響的基礎(chǔ)。目前,16S rDNA被普遍用于次級共生菌的檢測和序列分析[23]。

麥長管蚜(Sitobionavenae(Fabricius))屬半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，是小麥生育期最重要的世界性害蟲類群之一。麥長管蚜為害對小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)影響顯著[24-25]。麥長管蚜除直接吸食植物的汁液、分泌蜜露影響植物光合作用外，還能傳播多種植物病毒病。國外研究表明，麥長管蚜體內(nèi)存在次級共生菌[26]，并且麥長管蚜與其體內(nèi)共生菌已建立了互利共生的關(guān)系[27]，但目前我國有關(guān)麥長管蚜體內(nèi)次級共生菌種類、分布及功能研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

次級共生菌對宿主蚜蟲的生物學(xué)與生態(tài)學(xué)具有重要影響，是研究共生關(guān)系的模型，已成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)。為了揭示我國不同地理種群麥長管蚜體內(nèi)次級共生菌的感染情況，本研究利用次級共生菌PASS、PAUS和PABS的16S rDNA基因特異引物，對我國6個(gè)地理種群麥長管蚜進(jìn)行Long-PCR檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較；對感染個(gè)體體內(nèi)次級共生菌的16S rDNA基因片段進(jìn)行了測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，為進(jìn)一步研究感染次級共生菌對麥長管蚜的生態(tài)學(xué)和生物學(xué)影響奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

試驗(yàn)所用的麥長管蚜分別采自我國陜西楊凌(34.36°N,108.72°E)、安徽滁州(32.33°N,118.31°E)、陜西五丁關(guān)(32.83°N,106.25°E)、河南鄭州(34.46°N,113.40°E)、山西太谷(34.36°N,110.15°E)和新疆石河子(44.18°N,86.00°E)6個(gè)地理種群，每個(gè)地理種群采集3個(gè)樣點(diǎn)。由于蚜蟲具有孤雌生殖的特征，為了避免采集到同一母蚜所產(chǎn)的后代，采集時(shí)盡量使樣點(diǎn)之間相隔至少10 m。用無水乙醇浸泡采集到的成蟲，保存在-20 ℃條件下備用。

1.2 麥長管蚜總DNA 的提取

取麥長管蚜,用無菌水清冼2次，每次2 min。本試驗(yàn)采取單頭單提，每個(gè)地理種群提取20頭。使用DNA提取試劑盒提取DNA(莊盟生物，北京)。對提取的DNA進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PASS、PAUS和PABS共生菌檢測

分別利用PASS、PAUS和PABS共生菌的16S rDNA基因的特異引物(根據(jù)已知豌豆蚜體內(nèi)共生菌的保守序列設(shè)計(jì),引物序列見表1),對6個(gè)不同地理種群麥長管蚜體內(nèi)共生菌進(jìn)行Long-PCR檢測。Long-PCR的擴(kuò)增體系為20 μL：上、下游引物各1.5 μL(10 μmol/L),DNA模板3 μL，GoldstarTaqMan Mixture(CWBIO) 10 μL,RNase-Free Water 4 μL。Long-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s(循環(huán)10次，每個(gè)循環(huán)溫度降低0.5 ℃),72 ℃延伸1 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s(循環(huán)30次)(PASS、PAUS的退火溫度增加至67 ℃),72 ℃延伸1 min；最后，72 ℃延長10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物全部用于瓊脂糖凝膠電泳(PASS、PAUS用2.0%的瓊脂糖凝膠；PABS用1.0%瓊脂糖凝膠)檢測，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，然后用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收(莊盟生物，北京)，測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

感染次級共生菌的所有蚜蟲個(gè)體的DNA均進(jìn)行PCR擴(kuò)增和膠回收產(chǎn)物測序，得到16S rDNA 序列。將測序結(jié)果拼接后在NCBI上進(jìn)行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索，以確保獲得的序列片段為16S rDNA 基因的序列片段。用DNAman 軟件對6種不同地理種群同源基因進(jìn)行比對分析，并從GenBank 基因數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)蚜蟲體內(nèi)相同共生菌序列相似性較高的16S rDNA 序列并下載。同時(shí)，使用MEGA5.0基于Maximum Composite Likelihood 模型計(jì)算序列間的遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度( bootstrap) 均進(jìn)行1 000 次重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥長管蚜不同地理種群體內(nèi)共生菌的感染情況

利用16S rDNA基因?qū)ξ覈?個(gè)地理種群麥長管蚜共計(jì)120頭個(gè)體感染情況的檢測結(jié)果見表2。由表2可以看出，麥長管蚜體內(nèi)PASS、PAUS共生菌的感染率均為100%。PABS共生菌在安徽滁州、陜西楊凌和新疆石河子的感染率分別為70%，30%和15%，但在陜西五丁關(guān)、河南鄭州和山西太谷3個(gè)地理種群均沒有檢測到PABS共生菌。

2.2 地理種群間PASS、PAUS和PABS共生菌序列差異

安徽滁州、陜西五丁關(guān)、河南鄭州、新疆石河子、陜西楊凌和山西太谷的PASS、PAUS共生菌16S rDNA序列已上傳至GenBank，其中PASS的序列號分別為KM035988、KM035989、KM035990、KM035991、KM035992、KM035993，PAUS的序列號分別為KM035994、KM035995、KM035996、KM035997、KM035998、KM035999。陜西楊凌、安徽滁州和新疆石河子的PABS共生菌16S rDNA序列也已上傳至GenBank，序列號分別為KM036000、KM036001、KM036002。

測序結(jié)果表明，PASS共生菌16S rDNA片段在安徽滁州、陜西五丁關(guān)、河南鄭州、山西太谷和陜西楊凌5個(gè)地理種群的堿基序列完全一致；而與其他5個(gè)地理種群的堿基序列相比，新疆石河子的堿基序列在第5，68位上的堿基存在差異(新疆石河子的堿基均為G,其他地理種群的均為A)，在第21、43位上，新疆石河子的序列分別多出了1個(gè)C和G堿基。 通過DNAman對其不同基因序列進(jìn)行相似性分析認(rèn)為，安徽滁州、陜西五丁關(guān)、河南鄭州、山西太谷和陜西楊凌這5個(gè)地理種群的堿基序列與新疆石河子的堿基序列的相似度為98.28%。

測序結(jié)果表明，PAUS共生菌 16S rDNA片段在陜西五丁關(guān)和陜西楊凌的堿基序列完全一致；河南鄭州和新疆石河子的堿基序列完全一致。6個(gè)地理種群間的堿基序列差異主要發(fā)生在49，122，133和140位點(diǎn)上。通過DNAman對其不同基因序列進(jìn)行相似性分析認(rèn)為，不同地理種群麥長管蚜基因間最大相似度為99.50%，最小相似度為97.99%。

PABS共生菌16S rDNA片段的測序結(jié)果表明：陜西楊凌和安徽滁州476，704位點(diǎn)上的堿基有差異(陜西楊凌的分別是G、T， 安徽滁州的分別是C、C)；陜西楊凌和新疆石河子相比，只在1 037位點(diǎn)上有差異(分別是G、T)；安徽滁州和新疆石河子相比，在476，704和1 037位點(diǎn)上有差異(安徽滁州的分別是C、C、G， 新疆石河子的分別是G、T、T)。通過DNAman對其不同基因序列進(jìn)行相似性分析認(rèn)為：不同地理種群麥長管蚜基因間最大相似度為99.92%，最小相似度為99.77%；新疆石河子與煙粉虱體內(nèi)相同共生菌的相似度為89.07%，與豌豆蚜體內(nèi)相同共生菌的相似度為94.84%，與黑豆蚜體內(nèi)相同共生菌的相似度為95.66%。

通過以上分析認(rèn)為，6個(gè)地理種群的PASS、PAUS和3個(gè)地理種群的PABS共生菌基因序列相似性極高，相似性最小的為97.99%。共生菌研究中若相似性大于97.5%的株系即可歸為一類。因此，認(rèn)為不同地理種群體內(nèi)的PASS、 PAUS 和 PABS共生菌均為單菌系。

將測序所得序列導(dǎo)入NCBI BLAST，結(jié)果證實(shí)為PASS、PAUS和PABS共生菌的16S rDNA基因序列。通過MEGA5.0 軟件采用NJ鄰接法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，發(fā)現(xiàn)各地理種群的PASS、PAUS和PABS共生菌分別與其自己本身相似的共生菌聚集在一起。從圖1可以看出，PASS和PABS共生菌的親緣關(guān)系較近。本試驗(yàn)使用最大相似度法(ML)和最小進(jìn)化法(ME)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果相似。

由圖1還可以看出，6個(gè)地理種群的PASS共生菌的親緣關(guān)系較近，特別是安徽滁州、陜西五丁關(guān)、河南鄭州、山西太谷、陜西楊凌的PASS共生菌的堿基序列都完全一樣。6個(gè)地理種群的PAUS共生菌的親緣關(guān)系較近，其中新疆石河子、河南鄭州和山西太谷的PAUS共生菌的親緣關(guān)系更為接近，安徽滁州、陜西五丁關(guān)和陜西楊凌的PAUS共生菌的親緣關(guān)系更為接近；本研究中新疆石河子和河南鄭州麥長管蚜的PAUS共生菌與來自德國的麥長管蚜的PAUS共生菌的16S rDNA序列完全一樣,而與來自英國的麥長管蚜的PAUS共生菌的16S rDNA序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。陜西楊凌、安徽滁州和新疆石河子3個(gè)地理種群麥長管蚜的PABS共生菌親緣關(guān)系較近；所有蚜科的PABS共生菌與煙粉虱(Bemisiatabaci)PABS共生菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討 論

PASS、PAUS和PABS共生菌在豌豆蚜中的研究技術(shù)已經(jīng)成熟[1-12]，而我國麥長管蚜次級共生菌分布狀態(tài)尚未見報(bào)道。本研究對中國不同地理種群麥長管蚜體內(nèi)3種次級共生菌PASS、PAUS和PABS進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國不同地理種群麥長管蚜體內(nèi)的次級共生菌均存在多重感染，這與國外報(bào)道的麥長管蚜體內(nèi)同時(shí)含有7種常見次級共生菌的至少3種的結(jié)果是一致的[28]。PASS和PAUS共生菌在中國的6個(gè)地理種群的感染率均為100%，而日本種群的感染率分別為38.7%和16.0%[20]，說明PASS和PAUS共生菌在中國的麥長管蚜體內(nèi)的感染率高于日本，這可能是由于日本和中國的地理位置不同所致，也可能是PASS和PAUS共生菌在自然界中存在水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象所致。PABS 共生菌只在安徽滁州、陜西楊凌和新疆石河子3個(gè)地理種群中被發(fā)現(xiàn)，而在陜西五丁關(guān)、河南鄭州和山西太谷這3個(gè)地理種群中沒有檢測到，且3個(gè)感染PABS 共生菌的地理種群的感染率均較低。推測其原因可能是：(1)蚜蟲體內(nèi)所感染次級共生菌的種類和感染率與地理位置有關(guān)；(2)PABS共生菌在我國麥長管蚜體內(nèi)的感染率普遍較低。豌豆蚜體內(nèi)最常見的次級共生菌是PABS 共生菌[28]，而在本研究的結(jié)果是PASS 和 PAUS共生菌的感染率高，而PABS的感染率相對很低，可能是因?yàn)椴煌N間蚜蟲的感染情況是不同的，其具體原因還有待進(jìn)一步研究。

本研究中PABS共生菌在安徽滁州、陜西楊凌和新疆石河子的感染率分別為70%，30%和15%，而安徽滁州、陜西楊凌和新疆石河子分別位于中國的西部、中部和東部。不難發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)中，PABS共生菌在中國麥長管蚜體內(nèi)的感染率由西部向東部依次降低，推測PABS共生菌的感染率與地理位置和自然環(huán)境有著密切關(guān)系，特別是與海拔有關(guān)，因此在研究麥長管蚜遺傳分化的過程中，選擇樣本時(shí)應(yīng)考慮地理位置、自然環(huán)境等因素。由于本試驗(yàn)地理種群較少，還不能完全得出上述結(jié)論，需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究在麥長管蚜的有翅型和無翅型個(gè)體中都檢測到PASS、PAUS和PABS共生菌的存在，說明這3種共生菌普遍存在于不同地理種群的有翅型和無翅型麥長管蚜個(gè)體中，但有翅型和無翅型麥長管蚜個(gè)體間的PASS、PAUS和PABS共生菌的基因差異是否大于有翅型麥長管蚜個(gè)體間或無翅型麥長管蚜個(gè)體間，這3種共生菌在有翅型和無翅型麥長管蚜體內(nèi)存在的部位是否相同，還有待進(jìn)一步深入研究。

本研究的這3種次級共生菌中，PASS與PABS共生菌的親緣關(guān)系明顯較近，根據(jù)DNAman基因序列相似度也證明了這一點(diǎn)；對PABS來說，本試驗(yàn)所采用的麥長管蚜體內(nèi)共生菌的親緣關(guān)系要高于其他種，通過DNAman對其不同基因序列進(jìn)行相似性分析認(rèn)為：不同地理種群麥長管蚜基因間最大相似度為99.92%，最小相似度為99.77%，而新疆石河子與煙粉虱體內(nèi)相同共生菌的相似度為89.07%，與豌豆蚜體內(nèi)相同共生菌的相似度為94.84%，與黑豆蚜體內(nèi)相同共生菌的相似度為95.66%，說明不同種間蚜蟲體內(nèi)次級共生菌基因存在差異。

本試驗(yàn)每個(gè)地理種群的20個(gè)個(gè)體采取的試驗(yàn)方法、條件和手段完全相同，但Long-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后條帶的亮度差異明顯，通過核酸濃度測定儀所得結(jié)果也是差距較大，推測即使同一地理種群麥長管蚜不同個(gè)體間所含的同一種共生菌的數(shù)量是不同的。

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此類方法的應(yīng)用目的是能夠提升學(xué)生良好語感，并可以在聽的過程中吸收不同文化內(nèi)涵。且可以掌握單詞的發(fā)音與韻律。英語啟蒙學(xué)習(xí)的過程中需要能夠幫助學(xué)生掌握足有的語音信號，只有這樣才能夠有助于幫助他們分辨不同信號。

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Detection and phylogenetic analysis of three facultative endosymbionts in grain aphid,Sitobionavenaefrom different geographical regions

LUO Chena,HU Zu-qinga,YU Yong-angb,YANG Jiea, ZHANG Gai-shengb,ZHAO Hui-yana

(aStateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,CollegeofPlantProtection,bNationalYanglingAgriculturalBiotechnology&BreedingCenter,YanglingBranchofStateWheatImprovementCenter,WheatBreedingEngineeringResearchCenterMinistryofEducation,KeyLaboratoryofCropHeterosisofShaanxiProvince,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 Secondary symbionts,Serraticsymbiotica(PASS),Hamiltonelladefensa(PABS) andRegiellainsecticola(PAUS),exist widely in grain aphid,which induce changes in biological and ecological characteristics of aphids.This paper researched the genetic diversity and phylogeny of PASS,PABS and PAUS in 6 geographical populations ofSitobionavenaein wheat in China.【Method】 Special primers of 16S rDNA were used to conduct Long-PCR detection,sequence analysis,and phylogenetic analysis for PASS,PABS and PAUS in 6 geographical regions including Yangling Shaanxi,Chuzhou Anhui,Wudingguan Shaanxi,Zhengzhou Henan,Taigu Shanxi,and Shihezi Xinjiang.【Result】 (1) All 6 geographical populations ofS.avenaewere infected by PASS and PAUS with the infection rate of 100%,andS.avenaepopulations from Yangling Shaanxi,Chuzhou Anhui,and Shihezi Xinjiang were also infected by PABS with the infection rate of 15%-70%.(2) The comparison of 16S rDNA gene sequences showed that the gene sequences of PASS,PABS,and PAUS from all 6 geographical populations were highly identical.(3) The phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene showed that PASS and PABS had close genetic relationship.【Conclusion】 PASS and PAUS existed diffusely inS.avenaepopulations from different geographical regions of China, and they had poor genetic diversity.

Sitobionavenae;geographical populations;facultative endosymbionts;phylogenetic analysis;16S rDNA

2014-07-24

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013K02-12)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(QN2013011)；西北農(nóng)林科技大學(xué)博士后科研啟動基金項(xiàng)目(2013BSJJ114)

羅 晨(1989-)，男，陜西咸陽人，碩士，主要從事昆蟲體內(nèi)微生物研究。E-mail：lczhibao@163.com

趙惠燕(1955-)，女，陜西銅川人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事昆蟲生態(tài)學(xué)研究。E-mail：zhaohy@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.013

Q965.8

A

1671-9387(2015)01-0141-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.013.html