堇葉碎米薺硒蛋白的體內(nèi)抗氧化作用研究

雷紅靈,方響亮，周大寨

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

堇葉碎米薺硒蛋白的體內(nèi)抗氧化作用研究

雷紅靈,方響亮，周大寨

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000)

【目的】 探討富硒植物堇葉碎米薺硒蛋白的生理活性，為富硒植物的深度開發(fā)利用提供依據(jù)?！痉椒ā?以從湖北恩施富硒植物堇葉碎米薺葉片中提取的硒蛋白作為硒來源，設(shè)置硒質(zhì)量濃度分別為2.25，4.45，8.90，17.79 μg/mL的硒蛋白液灌胃飼喂小鼠4周，研究不同的硒蛋白溶液對小鼠體質(zhì)量、血硒水平、血液和肝組織總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量的影響?！窘Y(jié)果】 硒蛋白液的硒質(zhì)量濃度為8.90 μg/mL時，小鼠體質(zhì)量增加最多；在本試驗條件下，小鼠血硒水平隨硒質(zhì)量濃度的增加而升高；硒質(zhì)量濃度為4.45～17.79 μg/mL的硒蛋白液可明顯提高小鼠血液及肝組織的T-AOC、SOD活性和GSH-Px活力，抑制MDA的生成，但硒質(zhì)量濃度為8.90～17.79 μg/mL時，促進效應(yīng)減緩?！窘Y(jié)論】 堇葉碎米薺硒蛋白可以促進小鼠的生長及抗氧化能力，最適硒質(zhì)量濃度為8.90 μg/mL。

堇葉碎米薺；硒蛋白；血硒；抗氧化作用

硒是人和動物必需的微量元素，它具有抗氧化、抗腫瘤、解毒重金屬以及增強機體對病毒感染的免疫力等功能[1-2]，但是硒在有益和致毒之間的劑量差異很小。甘璐等[3]研究表明，補硒量為20 μg/kg 的大鼠，其機體內(nèi)的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量降低，同時超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH- Px)活性升高，而補硒量為40，80 μg/kg 的大鼠，其體內(nèi)MDA 含量增加，CAT、GSH-Px 和硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase，TR)活性降低，同時伴隨著TR mRNA 表達水平降低，表明體內(nèi)的氧化系統(tǒng)被激活，抗氧化系統(tǒng)受抑制，發(fā)生了一定程度的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，說明硒只能在一定的劑量范圍內(nèi)有效抑制脂質(zhì)過氧化。相比無機硒，天然有機硒的毒性更低、更安全，營養(yǎng)更全面，生物利用度高[4-5]，因此抗氧化能力更優(yōu)。羅培林等[6]研究顯示，酵母有機硒比亞硒酸鈉具有更高的生物學(xué)效價；李改平等[7]比較了有機硒和無機硒對小鼠全血GSH-Px 活性、肝SOD活性的影響，結(jié)果顯示，有機硒能顯著增強小鼠GSH-Px活性，提高SOD 活性，且硒蛋白的生物效應(yīng)比硒多糖的更為明顯；張勁松等[8]研究表明，煙葉硒蛋白制劑能顯著提高大鼠血清GSH-Px活性，降低大鼠血清中MDA含量；煙葉的含硒Rubisco蛋白對清除自由基、防護紅細胞溶血、保護化學(xué)性肝損傷的效果優(yōu)于不含硒蛋白質(zhì)[9]。

植物通過根部和葉片吸收的無機硒，可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成硒氨基酸、硒蛋白、硒多糖等有機形式，其中硒蛋白是最主要的存在形式。植物硒蛋白是一種高效、優(yōu)良的補硒源，尤其是純化的硒蛋白，可以作為保健品的添加劑和原料藥加以利用。湖北恩施的魚塘壩，是世界上惟一的獨立硒礦床所在地，生長著一種富硒能力極強的植物——堇葉碎米薺，其苗期葉片硒含量超過1 000 mg/kg，這是在我國首次發(fā)現(xiàn)的超富硒植物。為了了解該植物硒蛋白的生物活性，本試驗以昆明小鼠為對象，研究堇葉碎米薺葉片硒蛋白在小鼠體內(nèi)的抗氧化活性，以期為該植物的深層次開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試硒蛋白從成熟野生堇葉碎米薺葉片(含硒量627.59 mg/kg，可溶性蛋白含量86.35 g/kg)中分離純化而得，硒蛋白的含硒量為177.93 μg/g。

試驗動物為SPF級昆明種小白鼠(25 g/只左右，購于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，飼料由湖北省實驗動物研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計 以我國推薦的人體硒最高攝入量[10]為依據(jù)，按照人與試驗小鼠的換算系數(shù)(1∶9.01)及小鼠體質(zhì)量，計算確定試驗小鼠飼喂硒量最高為1.80 μg/(d·只)。采用隨機分組法將小白鼠分為6組，每組12只，雌雄各半。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，其中1組不做任何操作(空白對照，ck1)，1組灌胃純水(陽性對照，ck2)，另4組分別飼喂硒質(zhì)量濃度為2.25，4.45，8.90，17.79 μg/mL的硒蛋白溶液，每天1次，每次0.2 mL/只。常規(guī)喂養(yǎng)飼料，試驗期間每周稱體質(zhì)量1次，連續(xù)4周。

1.2.2 小鼠血清、溶血液和肝組織勻漿的制備 小鼠喂養(yǎng)第4周末，空腹斷頭處死，采血，取臟器。血液分成2份：一份不加防凝劑，靜置10 min，2 000 r/min 低溫離心10 min，取血清，4 ℃保存；另一份加肝素抗凝， 4 ℃冷藏備用，測試時用蒸餾水稀釋50倍，制備溶血液。肝臟用預(yù)冷生理鹽水漂洗，吸干水分，制備成質(zhì)量分數(shù)10%的肝組織勻漿，4 ℃、2 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.2.3 小鼠肝組織勻漿和血液抗氧化指標的測定 分別取質(zhì)量分數(shù)10%的肝組織勻漿和血清 0.10～0.20 mL，參照南京建成生物制品公司試劑盒說明書測定以下指標。

(1)MDA含量。以四氧甲基丙烷為標準，在532 nm波長處比色，計算肝組織勻漿的MDA含量(nmol/mg)和血清的MDA濃度(nmol/mL)。

(2)總抗氧化能力(T-AOC)。37 ℃時，以每分鐘每毫升血清或每毫克組織蛋白使反應(yīng)體系的吸光度值增加0.01為1個總抗氧化能力單位(U)。

(3)GSH-Px活力。肝組織GSH-Px活力以催化GSH的反應(yīng)速度表示，組織中每毫克蛋白質(zhì)、每分鐘除非酶促反應(yīng)外，反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個酶活力單位；全血GSH-Px活力單位為，每4 μL全血在37 ℃反應(yīng)5 min后，除非酶促反應(yīng)外，反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個酶活力單位。

(4)SOD活性。以每毫升反應(yīng)液中(或每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中)SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個酶活力單位(U)，即U/mg或U/mL。

1.2.4 硒和蛋白質(zhì)含量的測定 硒含量的測定采用氫化物發(fā)生-原子熒光分光光度法(采用北京吉天儀器有限公司AFS-930 氫化物發(fā)生雙道原子熒光光度計，硒標準液(GSB07-1253-2000)為國家環(huán)?？偩謽藴蕵悠费芯克峁?，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G250(進口分裝)法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 硒蛋白對小鼠體質(zhì)量的影響

按不同處理飼喂小鼠4周后，各處理組小鼠生長發(fā)育正常，外觀、行為活動、精神狀態(tài)、食欲、大小便及皮毛、膚色等均未見異常。試驗期間小鼠體質(zhì)量變化見表1。

由表1可見，灌胃1周后，ck2及硒處理組小鼠的體質(zhì)量均出現(xiàn)了不同程度下降，這可能是因為灌胃操作對小鼠產(chǎn)生了影響。飼喂2周后，各組小鼠體質(zhì)量開始增加，4周后灌胃硒蛋白液各組的小鼠體質(zhì)量增加率都高于對照，增加最多的是8.90 μg/mL 試驗組，增加率為30.36%；17.79 μg/mL組的增加率低于另外2個低硒(2.25和4.45 μg/mL)處理組，說明硒質(zhì)量濃度為17.79 μg/mL的硒蛋白液對小鼠生長的促進作用已明顯減弱。

2.2 硒蛋白對小鼠血液中硒水平的影響

硒蛋白對小鼠血液中硒水平的影響見圖1。

由圖1可見，2個對照組小鼠血液中硒質(zhì)量濃度為0.12～0.14 μg/mL，二者沒有顯著差異；飼喂不同硒質(zhì)量濃度的硒蛋白液可以明顯提高小鼠血液中的硒水平，且血液中硒水平隨著飼喂硒質(zhì)量濃度的增加而升高，均顯著高于2個對照組，各硒處理組間也都有顯著性差異，小鼠血液中硒質(zhì)量濃度最高達 0.35 μg/mL。

2.3 硒蛋白對小鼠抗氧化指標的影響

2.3.1 對MDA含量的影響 不同硒質(zhì)量濃度的硒蛋白液對小鼠肝組織勻漿和血清中MDA含量的影響見圖2。由圖2可見，小鼠肝組織勻漿和血清中MDA的含量在硒蛋白處理組與2個對照組間有顯著性差異，硒蛋白處理可以降低MDA含量，并在硒質(zhì)量濃度為8.90 μg/mL時抑制作用達到最大；而在硒質(zhì)量濃度17.79 μg/mL時抑制作用減小，MDA含量又開始增加。

2.3.2 對T-AOC的影響 不同硒質(zhì)量濃度的硒蛋白液對小鼠肝組織勻漿和血清T-AOC的影響見圖3。由圖3可以看出，硒蛋白處理組小鼠的肝組織勻漿和血清的T-AOC持續(xù)增加，與2個對照組有顯著性差異，但硒質(zhì)量濃度8.90與17.79 μg/mL 2個處理組間沒有顯著差異，且隨著硒質(zhì)量濃度的增大，小鼠肝組織勻漿和血清T-AOC的增加趨勢都在減緩。血清和肝組織勻漿T-AOC(y)與血液中硒質(zhì)量濃度(x)的回歸方程分別為：y=83.60x-8.04,R2=0.98,P=0.006 7<0.01;y=10.37x+1.68,R2=0.98,P=0.000 1<0.01，可見，T-AOC與血液中的硒水平具有極顯著相關(guān)性。

2.3.3 對GSH-Px活力的影響 由圖4可以看出，硒蛋白處理組小鼠GSH-Px與2個對照組小鼠有顯著性差異，且隨著硒質(zhì)量濃度的增加，肝組織勻漿和血液中的GSH-Px活力增強。血液和肝組織勻漿中GSH-Px活力(y)與血液中硒質(zhì)量濃度(x)的回歸方程分別為：y=349.77x+182.88,R2=0.98,P=0.000 1<0.01;y=159.42x+106.22,R2=0.94,P=0.000 1<0.01，可見GSH-Px活力與血液中的硒水平具有極顯著相關(guān)性。

2.3.4 對SOD活性的影響 由圖5可以看出，與2個對照組相比，硒蛋白處理組小鼠的肝組織勻漿和血清中SOD活性均有顯著增加，但在硒質(zhì)量濃度為17.79 μg/mL時，增幅下降。這與MDA含量的變化趨勢一致，說明硒質(zhì)量濃度17.79 μg/mL時已超過了小鼠的最適硒攝入量，所以SOD活性增幅下降，而MDA抑制作用減小，含量開始增加，但此硒攝入量仍可以提高小鼠的抗氧化能力。

3 結(jié)論與討論

GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)中重要的含硒酶，硒參與組成其活性中心；MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，SOD則是體內(nèi)重要的抗氧化酶，它們在清除活性氧自由基、抵抗氧化損傷、調(diào)節(jié)機體氧化還原狀態(tài)等方面起著重要作用，因此可以利用生物體內(nèi)這些指標的變化評價硒的抗氧化性。

關(guān)于硒蛋白的抗氧化作用，唐玫等[11]研究表明，富硒藻藍蛋白對有機體的SOD 和GSH-Px 活性都有顯著提高，特別是對肝臟GSH-Px 活性有極顯著的提高作用；對堇葉碎米薺含硒蛋白的體外抗氧化研究結(jié)果顯示，硒蛋白有較好的抗氧化活性[12]。本研究的結(jié)果也顯示，在試驗設(shè)置的硒質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，小鼠GSH-Px活力和T-AOC隨硒質(zhì)量濃度的增加而增大，且與血液中的硒水平呈極顯著正相關(guān)；SOD活性也不同程度升高，MDA生成則被抑制。這些結(jié)果提示，硒蛋白提高了小鼠血液中的硒水平，促進了含硒酶的合成及活性，抑制了過氧化物的生成，提高了小鼠的抗氧化能力。

本試驗中，硒質(zhì)量濃度為17.79 μg/mL的硒處理組，灌胃硒量為3.56 μg/(d·只)，超出了小鼠的最大耐受硒量，該硒劑量對小鼠的生長發(fā)育及抗氧化的促進效應(yīng)減小，但仍高于對照，未表現(xiàn)明顯的毒害，這可能是因為蛋白硒以硒代半胱氨酸被吸收，在體內(nèi)由密碼子UGA翻譯編碼進蛋白質(zhì)中[13-14]，其毒性效應(yīng)會降低；此外，小鼠本身具有的防御機制和適應(yīng)能力也可能消除該劑量硒的毒性影響。有研究表明，超營養(yǎng)劑量的硒攝入量可以降低動物和人類癌癥的發(fā)病率[15]。本研究中小鼠體質(zhì)量變化結(jié)果顯示，第1周給藥后，最高硒處理組小鼠體質(zhì)量減少最多，除了灌胃操作影響其生長外，高質(zhì)量濃度的硒溶液應(yīng)該也是其影響因素，之后的體質(zhì)量增加，可能與小鼠的適應(yīng)機制有關(guān)。

綜合來看，小鼠體質(zhì)量的變化趨勢與機體內(nèi)抗氧化活性的變化規(guī)律存在正相關(guān)性。說明適量的堇葉碎米薺硒蛋白可以提高小鼠血液中的硒水平，促進血液及肝臟的T-AOC、GSH-Px和SOD活力；減少肝臟和血清中MDA的生成，抑制脂質(zhì)過氧化，促進小鼠的生長發(fā)育。

志 謝：本研究工作得到了湖北民族學(xué)院的湖北省重點(特色)學(xué)科林學(xué)一級學(xué)科的支持，在此表示感謝！

[1] Iwona Z，Halina Z.Selenium interactions and toxicity [J].Cell Biology and Toxicology，2012,28:31-46.

[2] Flueck W T,Smith-Flueck J M,Mionczynski J,et al.The implications of selenium deficiency for wild herbivore conservation [J].European Journal of Wildlife Research,2012,58:761-780.

[3] 甘 璐，劉 瓊，徐輝碧．硒對大鼠肝臟抗氧化酶活性及基因表達的影響 [J].中國公共衛(wèi)生，2003，19(2):159-160．

Gan L,Liu Q,Xu H B.Effects of selenium on activities of antioxidant enzymes and gene expression in rat’s livers [J].China Public Health,2003，19(2):159-160．(in Chinese)

[4] Thiry C,Schneider Y J,Pussemier L,et al.Selenium bioaccessibility and bioavailability in Se-enriched food supplements [J].Biological Trace Element Research,2013,152:152-160.

[5] 田俊梅，張 丁，付瑞娟，等．大豆硒蛋白與亞硒酸鈉生物利用的比較研究 [J].大豆科學(xué)，2010，29(3)：534-536．

Tian J M,Zhang D,Fu R J,et al.Comparison of the bioavailability of soybean selenoprotein and sodium selenite [J].Soybean Science,2010,29(3):534-536．(in Chinese)

[6] 羅培林，鄭 萍，何 軍，等．不同硒源及硒水平對大鼠生長性能、血清抗氧化能力和組織硒沉積的影響 [J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2012,24(7)：1311-1319.

Luo P L,Zheng P,He J,et al.Different selenium sources and levels affect growth performance,serum antioxidant ability and tissue selenium retention in Wistar rats [J].Chinese Journal of Animal Nutrition,2012,24(7)：1311-1319.(in Chinese)

[7] 李改平，劉子川，王夢亮．有機硒和無機硒對小鼠抗氧作用比較研究 [J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001,2(3)：19-21．

Li G P，Liu Z C,Wang M L.Effects of organic selenium and inorganic selenium on biochemical criterions in mice [J].Journal of Shanxi College of Traditional Chinese Medicine,2001,2(3)：19-21．(in Chinese)

[8] 張勁松，高學(xué)云，邵玉芬，等．煙草硒蛋白質(zhì)工業(yè)化提取及其對免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用的影響 [J].中國煙草學(xué)報，1998，4(2)：29-32．

Zhang J S,Gao X Y,Shao Y F,et al.Industrial extraction of selenoprotein from fresh tobacco leaves and its effects on immune adjustment and antioxidation [J].Acta Tabacaria Sinica,1998，4(2)：29-32．(in Chinese)

[9] 陳春英，張勁松，黃開勛,等.煙葉硒蛋白對人紅細胞的輻射溶血及自由基的作用 [J].中國藥理學(xué)通報,1996,12(4):357-359.

Chen C Y,Zhang J S,Huang K X,et al.Effect of seleno-protein from tobacco leaves on haemolysis of human red erythrocyte and free radical [J].Chinese Pharmacological Bulletin,1996,12(4):357-359.(in Chinese)

[10] 中國營養(yǎng)學(xué)會．中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量 [M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2000．

Chinese Nutrition Society.DRIs(Chinese dietary guide) [M].Beijing:Chinese Light Industry Press,2000．(in Chinese)

[11] 唐 玫，王 曼，郭寶江．富硒藻藍蛋白對小鼠免疫功能及抗氧化活性的影響 [J].營養(yǎng)學(xué)報，2001，23(3)：275-278.

Tang M, Wang M,Guo B J.Effects of selenium-enriched phycocyanin on immune capacity in mice [J].Acta Nutrimenta Sinica,2001,23(3)：275-278．(in Chinese)

[12] Lei H L，Zhou D Z.The antioxidant activityinvitroof selenoprotein in Se-enriched plant [C].Selenium in the environment and human health.London:CRC Press,2013.

[13] Sochor J,Pohanka M，Nedecky B R，et al.Effect of selenium in organic and inorganic form on liver,kidney,brain and muscle of Wistar rats [J].Central European Journal of Chemistry，2012，10(5):1442-1451.

[14] Isabel L H,Maria P，Yolanda M.Selenoproteins:The key factor in selenium essentiality,state of the art analytical techniques for selenoprotein studies [J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2011,400:1717-1727.

[15] Clark J，Combs G，Turnbull B，et al．Effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with carcinoma of the skin：A randomized controlled trial [J].Nutritional Prevention of Cancer Study Group JAMA,1996，276：1957-1963．

Invivoantioxidation of selenoprotein inCardamineviolifolia

LEI Hong-ling,FANG Xiang-liang,ZHOU Da-zhai

(SchoolofBioscienceandBiotechnology,KeyLaboratoryofBiologicalResourcesProtectionandUtilizationofHubeiProvince,HubeiMinzuUniversity,Enshi,Hubei445000,China)

【Objective】 The physiological functions of selenoprotein in hyperaccumulator were investigated to improve the development and utilization of Se-rich plants.【Method】 Selenoprotein,purified from leaves ofCardamineviolifoliain Enshi,Hubei Province,was feed to Kunming mice by gastro gavage for 4 weeks.The mass concentrations of selenium in selenoprotein solution were 2.25,4.45,8.90 and 17.79 μg/mL,respectively.Physiological parameters including weight,blood selenium levels,the total antioxidant capacity,SOD,GSH-Px,and MDA in blood and liver tissue were detected.【Result】 The weight of Kunming mice increased the most when selenium mass concentration was 8.90 μg/mL.Blood selenium levels increased with the increase of selenium concentration.When the mass concentrations of selenium were 4.45-17.79 μg/mL,selenoprotein significantly enhanced the total antioxidant capacity,SOD,GHS-Px activity and inhibition on MDA formation,but the increasing rates decreased when selenium mass concentrations were 8.90-17.79 μg/mL.【Conclusion】 Selenoprotein in leaves ofCardamineviolifoliapromoted the growth and antioxidant ability of Kunming mice,and the optimum selenium mass concentration was 8.90 μg/mL.

Cardamineviolifolia;selenoprotein;blood selenium level;antioxidant activity

2013-08-20

國家自然科學(xué)基金項目(31360498)；湖北省科技計劃項目(2012FFC02501)；國家民委科研項目(12HBZ008)；湖北省教育廳自然科學(xué)研究重點項目(D20131902)；湖北民族學(xué)院博士啟動基金項目(MY2011B006)

雷紅靈(1967-)，女，湖北鶴峰人，教授，博士，主要從事硒生理生化研究。E-mail:leihl123366@163.com

時間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.021

Q493.99

A

1671-9387(2015)01-0201-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.021.html