膠質母細胞瘤干細胞研究進展及其在膠質瘤治療中的作用＊

楊卉慧，趙旭東

中國科學院 昆明動物研究所（昆明 650223）

膠質母細胞瘤干細胞（GSC）具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能等特性。GSC的發(fā)現(xiàn)、分離并證實其存在，是膠質瘤研究中的重大突破；它對膠質母細胞瘤的形成、生長、浸潤、轉移、復發(fā)及治療敏感性起決定性作用［1］，也為靶向治療提供了新的思路。

1 GSC概念的提出以及起源

自上世紀50年代進行的腫瘤細胞移植實驗［2］到后來眾多研究均發(fā)現(xiàn)，只有在免疫缺陷小鼠中植入較大量的腫瘤細胞才能形成移植瘤。傳統(tǒng)理論對此的解釋是，盡管每個腫瘤細胞都可以無限制地生長、形成新的腫瘤，但每個腫瘤細胞形成腫瘤的幾率都很小，因此需要移植較多數(shù)量的腫瘤細胞才能成瘤；另一種觀點認為，腫瘤中有一部分細胞具有自我更新能力，并能產(chǎn)生異質性腫瘤細胞，只有這種細胞才能形成新的腫瘤，即腫瘤干細胞學說［3］。腫瘤干細胞概念最早在上世紀60年代提出，但一直因無直接實驗證據(jù)未能獲得廣泛認可［4］。上世紀90年代，Lapidot和Bonnet等［5－6］首先在急性髓細胞白血病（AML）中分離鑒定了一類具有干細胞特性的腫瘤細胞，證明了腫瘤干細胞的存在。Reya等［7］隨后對其他腫瘤干細胞的特征進行了較全面的預測。2003年終于在實體瘤乳腺癌［8］和腦瘤［9－10］中發(fā)現(xiàn)了具有類似特性的細胞。

得益于成熟的正常神經(jīng)干細胞的分子標記研究和分離培養(yǎng)技術，Singh等［9］從兒童腫瘤死亡率居首位的髓母細胞瘤中，分離培養(yǎng)了可形成神經(jīng)球樣的細胞，這些細胞表達神經(jīng)干細胞分子標記物CD133。2004年，同一研究小組從兒童髓母細胞瘤和成人膠質母細胞瘤中分離出了類似的細胞，并證明了CD133＋細胞具有自我更新能力，可分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞和寡樹突狀膠質細胞樣的細胞，少量此類細胞就可在免疫缺陷的動物中成瘤并重現(xiàn)原腫瘤的分子和病理特征，從而確認了GSC的存在。

目前，腫瘤干細胞已被證明存在于乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、結直腸癌、皮膚癌以及腎癌等許多類型腫瘤中，并具有以下基本特征：自我更新能力、分化形成異質性腫瘤細胞的能力，以及在體內重現(xiàn)原腫瘤的組織學特征、分子遺傳特征的能力［11］。這一理論為我們重新認識腫瘤的起源和本質，以及臨床腫瘤治療提供了新的方向和視角。根據(jù)這一理論，腫瘤干細胞雖然數(shù)量少，卻在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉移中起著重要作用，理應是癌癥研究和治療的主要靶點細胞［12－14］。清除動物模型中的腫瘤干細胞可以阻止腫瘤發(fā)展［15］，但腫瘤干細胞對放療、化療的耐受性高［16－17］，這也成為腫瘤復發(fā)和轉移的主要原因。因此研發(fā)對腫瘤干細胞有良好效果的新型抗癌藥物具有重要價值。

對于GSC的起源目前主要存在兩種假設。1）GSC起源于神經(jīng)干細胞。由于GSC和神經(jīng)干細胞具有非常類似的分子特征和生物學特性，而大腦的腦室下區(qū)是神經(jīng)干細胞主要存在的區(qū)域，同時有研究發(fā)現(xiàn)膠質母細胞瘤的發(fā)生與腦室下區(qū)存在密切的聯(lián)系［18］。Holland等［19］向膠質纖維酸性蛋白陽性細胞和巢蛋白陽性細胞中導入癌基因，結果發(fā)現(xiàn)巢蛋白陽性細胞產(chǎn)生腫瘤的幾率顯著高于膠質纖維酸性蛋白陽性細胞。綜上研究提示GSC是神經(jīng)干細胞惡性轉化而來。2）祖細胞或成熟星形膠質細胞可以通過基因突變、遺傳性狀改變等再次激活調控自我更新的通路，從而提高自我更新能力，形成腫瘤。目前上述假設仍不能完全解釋GSC的起源，GSC的起源問題有待今后進一步研究。

2 GSC的生物學特性

2.1 體外培養(yǎng)條件下的生長特性

Singh等［9］以CD133為標志物，從不同類型的膠質瘤組織中，分離出膠質瘤干細胞，并進行體外培養(yǎng)。在含有生長因子的無血清條件下，GSC呈懸浮樣生長，并且可以維持自我更新和增殖。Lee等［20］對不同培養(yǎng)條件下臨床樣品分離的GSC的遺傳學、基因表達譜等進行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞在長期培養(yǎng)過程中，除神經(jīng)球樣生長外還可維持遺傳學和表達譜等特征穩(wěn)定。Pollard等［21］將 GSC培養(yǎng)在laminin包被的培養(yǎng)皿中，發(fā)現(xiàn)和神經(jīng)干細胞類似，GSC在laminin基質上也生長良好，并可長時間維持腫瘤干細胞特性，為GSC用于高通量藥物篩選提供了有利條件。

2.2 GSC的異質性

由于腫瘤干細胞本身就是一個異質性的群體，因此腫瘤干細胞的存在反映了整個腫瘤細胞群體在增殖能力和分化程度上的異質性。Gerlinger等［22］對實體瘤的大規(guī)模測序分析證實，在個體腫瘤中也存在廣泛的異質性。GSC作為一類腫瘤干細胞群體，可能也存在多方面的異質性，這種異質性不僅體現(xiàn)在不同膠質母細胞瘤的干細胞之間，也可體現(xiàn)在同一GSC群體的內部。

2.3 自我更新和無限增殖特性

與神經(jīng)干細胞相比，腫瘤干細胞的自我更新和增殖能力都明顯強于神經(jīng)干細胞［23－26］。目前認為，檢驗腫瘤干細胞自我更新和無限增殖能力的金標準是動物體內成瘤實驗［27］。Singh等［9］證實：接種100個從膠質母細胞瘤和髓母細胞瘤分選出的CD133＋細胞，便可在免疫缺陷型小鼠體內形成移植瘤，而且再次向免疫缺陷型小鼠體內接種從移植瘤內分離的腫瘤干細胞，又可形成表型相同的移植瘤。與之相比，接種105個CD133－的腫瘤細胞卻未能成瘤。這一研究充分說明膠質母細胞瘤內腫瘤干細胞雖然數(shù)量少，卻是腫瘤發(fā)生、生長和復發(fā)的原動力。

2.4 多向分化潛能和致瘤性

在除去生長因子或添加血清后，體外培養(yǎng)的GSC能貼壁生長并發(fā)生分化，產(chǎn)生的腫瘤細胞可分別表達神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞標志物［28－29］，因此GSC具有類似神經(jīng)干細胞的多向分化潛能。然而不同于神經(jīng)干細胞的是，GSC分化產(chǎn)生的腫瘤細胞一般會有成熟障礙，并且部分細胞可同時表達神經(jīng)元和膠質細胞的標志物，表明GSC的分化機制紊亂，這種異常的分化現(xiàn)象說明GSC是一種惡性轉化細胞［28－29］。Singh等［9］將從膠質母細胞瘤中分離得到的腫瘤干細胞異體移植入免疫缺陷型小鼠腦中，發(fā)現(xiàn)新生成腫瘤與原腫瘤極為相似；應用免疫組化方法檢測，發(fā)現(xiàn)新生成腫瘤與原腫瘤組織均表達能夠反映細胞未分化狀態(tài)的標記物巢蛋白，以及干細胞分化后的神經(jīng)元標記物β微管蛋白，且兩種組織之間各標記物表達程度相當，表明新生成腫瘤分化形成的組織與原腫瘤表型相同。

2.5 抗放射性和抗藥性

根據(jù)腫瘤干細胞學說，很容易想到清除腫瘤干細胞可以達到治療腫瘤的目的，但腫瘤干細胞對常規(guī)放化療具有較高耐受性［15－16］。Bao等［30］對人 膠質母細胞瘤中提取出的腫瘤干細胞進行放射敏感性實驗，結果表明，CD133＋細胞比CD133－細胞更能優(yōu)先激活射線所致DNA損傷的檢驗點，并能有效修復射線誘導的DNA損傷。此外，應用檢驗點激酶Chk1和Chk2的特異抑制劑，可逆轉由CD133＋細胞產(chǎn)生的抗放射性。另有研究顯示，抑制部分DNA依賴性蛋白激酶催化亞單位復合體，則可間接抑制DNA雙鏈修復，提高對射線的敏感性，從而為減少膠質母細胞瘤的抗放射性提供了一種新思路［31］。GSC的放射抗性不僅與DNA的修復能力相關，而且與細胞周期調控、凋亡和增殖的信號傳導通路改變等相關。

CD133＋細胞的體內實驗發(fā)現(xiàn)，GSC和神經(jīng)干細胞一樣，幾乎處于休眠狀態(tài)，停滯于細胞周期中的G0／G1期［32］，這種狀態(tài)可以使其逃避常規(guī)的放療和化療。另外腦腫瘤干細胞能高表達腺苷三磷酸結合盒轉運體，可以將多種藥物轉運出細胞外，因此對化療產(chǎn)生耐藥性［33］。Liu 等［34］發(fā)現(xiàn)，CD133＋細胞的O6－甲基鳥嘌呤－DNA甲基轉移酶（MGMT）表達水平顯著高于CD133－細胞；GSC的耐藥性還可能與其高度表達抗凋亡的基因有關。因此，針對GSC耐藥性的各個環(huán)節(jié)進行干預，可以增強甚至恢復GSC對化療的敏感性，逆轉其耐藥性。

2.6 GSC與微環(huán)境

與正常的干細胞一樣，腫瘤細胞也有獨特的微環(huán)境，兩者的關系相輔相成，即腫瘤干細胞有助于微環(huán)境的維持，微環(huán)境亦能維護干細胞的自我更新［35］。Li等［36］認為干細胞微環(huán)境的異常調控導致了干細胞增殖失控，進而可導致腫瘤發(fā)生。在腫瘤干細胞微環(huán)境內，不斷發(fā)生著一些保持自身內環(huán)境穩(wěn)定的反應，如炎癥、上皮間質轉化（EMT）、缺氧以及血管新生等，這些生物過程決定腫瘤干細胞的命運。

而GSC微環(huán)境中的微血管增殖是膠質母細胞瘤的一個重要特點。膠質母細胞瘤病理級別越高，腫瘤干細胞越多，其微血管結構也越多，三者呈正相關［37］。Calabrese等［37］通過使用多光子激光掃描電子顯微鏡和免疫熒光共染法研究GSC的過程中，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織切片中被標記的干細胞距離毛細血管要比普通腫瘤細胞近得多。在體外，與單獨培養(yǎng)GSC相比，與內皮細胞混合培養(yǎng)的GSC生長速度更快，并且普通的膠質母細胞瘤細胞與內皮細胞混合培養(yǎng)也沒有增殖加快的現(xiàn)象［38］。說明GSC與微環(huán)境中的其他細胞及成分之間有著緊密的聯(lián)系。

2.7 GSC與腫瘤血管形成

惡性膠質母細胞瘤是人體血管化程度最高的腫瘤，血管的生成和增長在膠質母細胞瘤生長和侵襲過程中起重要作用，并與其惡性進展有關。腫瘤血管新生的過程是由許多因素共同決定，其中血管表皮生長因子和血管內皮細胞起到了重要的作用。

血管表皮生長因子（VEGF）的主要作用是增加血管內皮細胞的遷移和促進血管新生。Bao等［39］在體內成瘤試驗中發(fā)現(xiàn)，GSC形成的腫瘤與普通腫瘤細胞移植形成的腫瘤在病理特征和表型上都有明顯的差異。GSC移植形成的腫瘤血管豐富，壞死和出血也比普通的腫瘤要多［39］。進一步的研究表明，GSC能維持VEFG（低氧環(huán)境下）的高水平表達［40］，因此GSC是以VEGF為基礎來調節(jié)腫瘤血管的生成的。

多年來，人們一直認為腫瘤血管主要由正常血管內皮細胞構成，但是最近研究發(fā)現(xiàn)，膠質母細胞瘤中血管內皮細胞具有與腫瘤細胞相同的遺傳變異特性，提示這些血管內皮細胞可能是腫瘤來源的（腫瘤細胞或腫瘤干細胞）［39］。體外研究［41－42］證實，GSC可分化為血管內皮細胞，在小鼠模型中特異性去除腫瘤干細胞來源的血管內皮細胞，可明顯抑制腫瘤血管形成及腫瘤生長。因此GSC可以通過維持VEGF的表達和分化為血管內皮細胞，調節(jié)腫瘤血管的形成。

2.8 GSC與腫瘤惡性等級和預后的關系

因為膠質瘤干細胞能特異性表達CD133和巢蛋白，因此對不同級別、不同病理類型的人膠質母細胞瘤樣本進行CD133、巢蛋白免疫組織化學染色，結果表明，腫瘤的惡性程度與CD133和巢蛋白的表達量成正相關，即膠質母細胞瘤惡性等級越高，CD133、巢蛋白的表達越強，患者的預后就越差，生存率就越低［43］，說明GSC的數(shù)量與腫瘤惡性程度和病人預后密切相關。

3 GSC的臨床意義

3.1 GSC在臨床診斷和預后中的作用

由于腫瘤起源于腫瘤干細胞，因此要做到真正的早診斷就必須盡早發(fā)現(xiàn)體內的腫瘤干細胞，甚至在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前就發(fā)現(xiàn)它。此外，腫瘤生長及擴散轉移速度的快慢和侵襲能力的強弱體現(xiàn)了GSC自我更新、增殖、分化和遷移能力的大小，即GSC決定了膠質母細胞瘤的臨床惡性程度。若GSC的自我更新、增殖、分化和遷移能力較強，則臨床表現(xiàn)為腫瘤生長速度快，容易向周圍組織侵襲和轉移，腫瘤的惡性程度高，患者的預后差；反之亦然［44］。

GSC在腫瘤的侵襲擴散中起著重要的作用。一方面，腫瘤干細胞的一個重要特性就是遷移性；另一方面，干細胞缺乏人類白細胞抗原，移植后可長期存活于受體的多種組織中［45］，GSC可能也缺乏人類白細胞抗原，可以在向其他組織侵襲轉移的過程中逃逸，以逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，避免免疫細胞的攻擊，所以GSC存活的可能性比較大。

3.2 GSC在腫瘤治療中的作用

傳統(tǒng)理論認為，腫瘤細胞具有無限增殖能力，因此針對腫瘤細胞的治療方法有外科手術、化療和放療等，而腫瘤體積是否縮小或消失是衡量治療效果的標準之一。但是許多腫瘤，尤其是膠質母細胞瘤，經(jīng)過一段時間的治療后又會復發(fā)，不能從根本上延長病人的生存期，主要原因在于目前的治療方法均不能有效徹底殺死GSC，特別是已經(jīng)發(fā)生擴散的GSC。GSC決定了腫瘤的惡性程度和是否容易擴散轉移，并且它對化療和放療的耐受性遠遠比普通腫瘤細胞強。動物模型研究［15］證實，清除腫瘤干細胞可以阻止腫瘤發(fā)展，因此高效準確的去除GSC，在腫瘤的治療中有至關重要的作用。

4 依據(jù)GSC治療膠質瘤的方法

4.1 腫瘤干細胞與藥物的發(fā)現(xiàn)

顯而易見，靶向腫瘤干細胞的藥物對治療腫瘤有更好效果，但目前的抗腫瘤藥物都是用腫瘤細胞系篩選出來的，對腫瘤干細胞效果甚微。利用GSC進行藥物篩選有一系列優(yōu)勢：1）大規(guī)模篩選抗腫瘤干細胞藥物的基本要求是擴增培養(yǎng)腫瘤干細胞，以獲得足夠細胞。GSC是最早分離鑒定的實體瘤干細胞之一，也是極少數(shù)能體外長期培養(yǎng)的腫瘤干細胞之一，在腫瘤干細胞研究中具有重要的示范意義。2）GSC除了可懸浮培養(yǎng)形成類似神經(jīng)球樣的細胞團外，也可長期貼壁傳代培養(yǎng)，極有利于高通量篩選［46］。3）與在含血清的培養(yǎng)基中進行膠質母細胞瘤原代細胞培養(yǎng)不同，GSC基因組和基因表達譜在長期培養(yǎng)條件下都極穩(wěn)定［20］。因此GSC是目前篩選抗腫瘤干細胞藥物的理想選擇。

近年來，GSC開始用于抗腫瘤干細胞藥物篩選［47－49］，但這些研究存在一些明顯的缺陷：1）僅能篩選細胞毒性化合物，無法判斷藥物對腫瘤干細胞的分化作用。而根據(jù)腫瘤干細胞理論，除細胞毒性藥物可殺死腫瘤干細胞外，誘導腫瘤干細胞分化的藥物也應對腫瘤治療有理想效果。2）用于篩選的腫瘤干細胞沒有進行遺傳變異檢測，篩選結果不一定具有廣泛適用性。3）用于篩選的細胞中沒有報告基因，給高通量篩選帶來不便。本實驗室用GSC建立了高通量篩選平臺，并用于天然產(chǎn)物庫、經(jīng)典藥物分子庫等的篩選，獲得了一系列結果。

4.2 誘導分化療法

根據(jù)腫瘤干細胞學說，除了傳統(tǒng)的殺死干細胞的藥物外，誘導GSC分化從而失去自我更新能力的藥物，也將具有良好的抗腫瘤效果。Kang等［50］用小分子CG500354處理GSC，發(fā)現(xiàn)CG500354通過細胞周期調節(jié)因子、p53、p21、p27和特殊的周期蛋白等，誘導細胞增殖的停滯并分化為表達Tuji和膠質纖維酸性蛋白的細胞，使GSC處于增殖停滯且分化正常的狀態(tài)。

4.3 免疫療法

特異性針對GSC的免疫靶向治療策略，是利用其干細胞獨特的免疫源性，通過啟動機體免疫系統(tǒng)，并產(chǎn)生各種具有生物活性的物質來調節(jié)和改善人體的免疫功能，抑制和殺死腫瘤細胞。

膠質母細胞瘤的免疫治療主要包括腫瘤疫苗療法、細胞因子療法、過繼免疫細胞療法以及抗體免疫療法等。其中，腫瘤疫苗療法中的樹突狀細胞瘤苗（DC vaccine）療效最佳、應用最廣［51－53］。Pellegatta等［54］首次嘗試將DC疫苗靶向GSC，他們從小鼠膠質母細胞瘤細胞系GL261中富集GSC，并對DC進行抗原負載，制成的DC疫苗與普通GL261細胞負載的DC疫苗相比，組織相容性復合物（MHC）和共刺激分子的表達上升，激活的效應T細胞對腫瘤溶解殺傷的能力增強；負載GSC的DC疫苗能更有效地提高荷瘤小鼠的生存期、治愈率以及瘤內CD4＋／CD8＋T細胞浸潤。臨床I、II期試驗中，應用樹突狀細胞瘤苗法后，患者的生存率及生存期得到了顯著的提高，且沒有出現(xiàn)副作用與自身免疫反應，顯示出其在膠質瘤治療中的巨大應用前景［55］。

4.4 靶向干細胞信號通路

一些重要的信號轉導通路，如對細胞定向分化起調控作用的Hh通路、Notch通路，以及細胞外信號調節(jié)激酶等，它們的異常均可直接或間接引起膠質母細胞瘤的發(fā)生，因此針對這些信號通路進行干預，則可起到促進GSC的分化、抑制腫瘤細胞生長的作用。

Hh通路的異常激活和下游轉錄因子Gli1的增加，均被證實是腫瘤產(chǎn)生的重要驅動因素。胰島素樣生長因子依賴于Hh／Gli1通路的激活，而阻斷Gil1通路足以限制胰島素受體底物－1（IRS1）的蛋白表達，以及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化，從而抑制GSC的增生，限制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，一定程度上抵消了GSC對替莫唑胺的抗藥作用［56］。Notch通路直接介導細胞間的相互作用，在腫瘤發(fā)生過程中，對腦腫瘤干細胞的增殖分化有重要的調控作用。用γ－分泌酶抑制劑（GSI）阻斷該通路，以評估其對GSC的作用，結果表明經(jīng)過該抑制劑處理的GSC，在增殖及自我更新的能力上均有減弱，且有分化為成熟神經(jīng)元的趨勢，表明該通路抑制劑GSI可以作為針對GSC靶向治療膠質母細胞瘤的一種有效手段［57］。

4.5 基因療法

膠質母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展涉及到許多基因的調控，從分子水平上對GSC的基因進行改造，將影響膠質母細胞瘤的增殖、凋亡等一系列生物學行為。

進行干細胞的轉基因治療，目前常用的是胸腺嘧啶脫氧核苷激酶（TK）／甘環(huán)鳥苷（GCV）自殺基因治療方法。將I型單純皰疹病毒編碼TK的基因插入合適的病毒載體，而TK可以將抑病毒藥物GCV轉化為有毒性作用的代謝產(chǎn)物。帶有自殺基因的病毒載體可以在表達載體細胞（VPC）中擴增。將VPC注入大腦后釋放載體，病毒對感染腫瘤干細胞有較高選擇性，并不對周圍的正常組織造成損傷。轉入核內的TK基因產(chǎn)物在胞漿內累積。注射核苷類似物甘環(huán)鳥苷后，在TK作用下GCV轉變?yōu)榫哂卸拘宰饔玫娜姿岣虱h(huán)鳥苷。三磷酸甘環(huán)鳥苷通過抑制DNA聚合酶的活性及錯誤插入復制的DNA鏈中，以阻斷DNA合成，誘導干細胞死亡或凋亡［58－59］。

也有研究表明Nrf2是調節(jié)抗氧化應答元件基因表達的關鍵因子［60］，而在基因和蛋白質層次上，Nrf2在GSC中的表達都明顯高于膠質母細胞瘤細胞系［61］。Nrf2在GSC功能的調節(jié)中起重要作用，例如促血管生成途徑和細胞凋亡等。利用反義基因療法人工合成出與GSC Nrf2mRNA序列互補的反義核酸，將其導入GSC中，通過堿基配對與互補鏈雜交，影響Nrf2mRNA的翻譯過程，抑制其編碼蛋白質的合成，從而抑制GSC基因的表達及增殖，使其進入正?；壍阑蛞鹌涞蛲?，從根源上消除膠質母細胞瘤的發(fā)生或復發(fā)［62］。

5 問題與展望

越來越多的研究表明，GSC在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。GSC為膠質母細胞瘤研究和治療提供了全新視野，很大程度上拓展了人們對膠質瘤發(fā)生、發(fā)展以及放化療耐受機制等方面的認識，有望帶來突破性進展。但有關GSC的研究還有諸多問題亟待解決，如缺乏GSC的分子標記和針對GSC的藥物等。

［1］Binello E，Germano IM.Targeting glioma stem cells：a novel frame－work for brain tumors［J］.Cancer Sci，2011，102（11）：1958－1966.

［2］Moore AE，Rhodads CP，Southam CM.Homotransplantation of human cell lines［J］.Science，1957，125（3239）：158－160.

［3］Wang CY，Dick JE.Cancer stem cells：lessons from leukemia［J］.Trends in Cell Biology，2005，15（9）：494－501.

［4］Bruce WR，Van Der Gaag H.A quantitative assay for the number of murine lymphoma cells capable of proliferation in vivo［J］.Nature，1963，199：79－80.

［5］Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，etal.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice［J］.Nature，1994，367（64646）：645－648.

［6］Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell［J］.Nat Med，1997，3（7）：730－737.

［7］Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，etal.Stem cells，cancer and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414（6859）：105－111.

［8］Al HM，Wicha MS，Benito HA，etal.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（7）：3983－3988.

［9］Singh SK，Clarke ID，Terasaki M，etal.Identification of a cancer stem cell in human brain tumors［J］.Cancer Res，2003，63（18）：5821－5828.

［10］Singh SK，Hawkins C，Clarke ID，etal.Identification of human brain tumour initiating cells［J］.Nature，2004，432（7015）：396－401.

［11］Magee JA，Piskounova E，Morrison SJ.Cancer stem cells：impact，heterogeneity，and uncertainty［J］.Cancer Cell，2012，21（3）：283－296.

［12］Frank NY，Schatton T，F(xiàn)rank MH.The therapeutic promise of the cancer stem cell concept［J］.J Clin Invest，2010，120（1）：41－50.

［13］Croker AK，Allan AL.Cancer stem cells：implications for the progression and treatment of metastatic disease［J］.J Cell Mol Med，2008，12（2）：374－390.

［14］Sabisz M，Skladanowski A.Cancer stem cells in drug resistance and drug screening：can we exploit the cancer stem cell paradigm in search for new antitumor agents？［M］.INTECH Open Access Publisher，2011：423－442.

［15］Chen J，Li Y，Yu TS，etal.A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy ［J］.Nature，2012，488（7412）：522－526.

［16］Beier D，Schulz JB，Beier CP.Chemoresistance of glioblastoma cancer stem cells－much more complex than expected［J］.Mol Cancer，2011，10（11）：128－139.

［17］Altaner C.Glioblastoma and stem cells［J］.Neoplasma，2008，55（5）：369－374.

［18］Barami K，Sloan AE，Rojiani A，etal.Relationship of gliomas to the ventricular wall［J］.J Clin Neurosci，2009，16（2）：195－201.

［19］Holland EC，Celesfino J，Dai C，etal.Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice［J］.Nat Genet，2000，25（1）：55－57.

［20］Lee J，Kotliarova S，Kotliarov Y，etal.Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum－cultured cell lines［J］.Cancer cell，2006，9（5）：391－403.

［21］Pollard SM，Yoshikawa K，Clarke ID，etal.Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor－specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens［J］.Cell Stem Cell，2009，4（6）：568－580.

［22］Gerlinger M，Rowan AJ，Horswell S，etal.Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing［J］.New England Journal of Medicine，2012，366（10）：883－892.

［23］Kennedy JA，Barabe F，Poeppl AG，etal.Comment on：Tumor growth need not be driven by rare cancer stem cell ［J］.Science，2007，318（5857）：1722－1729.

［24］Lgnatova TN，Kukekov VG，Laywell ED，etal.Human conical glioma tumors contain neural stem－like cells expressing astwglim and neuronal markersinvitro［J］.Glia，2002，39（3）：193－206.

［25］Hemmati HD，Nakano I，Lazareff JA，etal.Cancerous stem cells Call arise from pediatric brain tumor［J］.Proe Natl Acad Sci USA，2003，100（25）：15178－15183.

［26］王偉，何理盛，林志熊，等.膠質瘤干細胞生物學特性研究［J］.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2009，8（3）：283－285.

［27］Clarke MF，Dick JE，Dirks PB，etal.Cancer stem cellsperspective on conent status and future direction：AACR workshop on cancer stem cells［J］.Cancer Res，2006，66（19）：9339－9345.

［28］Ignatova TN，Kukekov VG，Laywell ED，etal.Human cortical tumors contain neural stem－like cells expressing astmoial and neural markers in vitro［J］.Glia，2002，39（3）：193－206.

［29］Kondo T，Setoguchi T，Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem－like cells in the C6dioma cell line［J］.Pmc Natl Acad Sci USA，2004，101（3）：781－786.

［30］Bao S，Wu Q，McLendon RE，etal.Glioma stem cells promote radio resistance by preferential activation of the DNA damage response［J］.Nature，2006，444（7120）：756－760.

［31］Zhuang W，Li B，Long L，etal.Knockdown of the DNA－dependent protein kinase catalytic subunit radiosensitizes glioma－initiating cells by inducing autophagy ［J］.Brain Research，2011，1371：7－15.

［32］Qiang L，Yang Y，Ma YJ，etal.Isolation and characterization of cancer stem like cells in human glioblastoma cell lines［J］.Cancer Left，2009，279（1）：13－21.

［33］Dean M，F(xiàn)ojoT，Bates S.Tumor stem cells and drug resistance［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（4）：275－284.

［34］Liu G，Yuan X，Zeng Z，etal.Analysis of gene expression and Chemo－resistance of CD133＋cancer stem cells in glioblastoma［J］.Mol Cancer，2006，5（1）：67－78.

［35］Yang ZJ，Wechslerrera RJ.Hitem where they live：targeting the cancer stem cell niche［J］.Cancer Cell，2007，11（1）：3－5.

［36］Li L，Neaves WB.Normal stem cells and cancer stem cells：the niche matters［J］.Cancer Res，2006，66（9）：1155－1159.

［37］Calabrese C，Poppleton H，Kocak M，etal.A perivascular niche for brain tumor stem cells［J］.Cancer Cell，2007，11（1）：69－82.

［38］Wang HW，Meng QH，Jin P，etal.Effect of brain microvascular endothelial cells on brain tumor stem cells in co－culture system in vitro ［J］. Chinese Journal of Neurosurgery，2010，7：657－660.

［39］Bao S，Wu Q，Sathornsumetee S，etal.Stem cell－like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor［J］.Cancer Res，2006，66（16）：7843－7848.

［40］Jain RK，Duda DG，Clark JW，etal.Lessons from phase III clinical trials on anti－VEGF therapy for cancer［J］.Nat Clin Pract Oncol，2006，3（1）：24－40.

［41］Ricci－Vitiani L，Pallini R，Biffoni M，etal.Tumour vascularization via endothelial differentiation of glioblastoma stem－like cells［J］.Nature，2010，468（7325）：824－828.

［42］Wang R，Chadalavada K，Wilshire J，etal.Glioblastoma stemlike cells give rise to tumour endothelium［J］.Nature，2010，468（7325）：829－833.

［43］Zhang M，Song T，Yang L，etal.Nestin and CD133：valuable stem cell specific markers for determining clinical outcome of glioma patients［J］.J Exp Clinic Cancer Res，2008，27：85.

［44］尹昌林，楊輝.腦膠質瘤干細胞的研究進展及應用前景［J］.中國微侵襲神經(jīng)外科雜志，2006，11（8）：370－373.

［45］Deng W，Han Q，Liao L，etal.Allogeneic bone marrowderived flk－1＋Sca－1－mesenchymal stem cells leads to stable mixed chimerism and donor－specific tolerance ［J］.Exp Hematol，2004，32（9）：861－867.

［46］Pollard SM，Yoshikawa K，Clarke ID，etal.Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumorspecific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens［J］.Cell Stem Cell，2009，4（6）：568－580.

［47］Danovi D，F(xiàn)alk A，Humphreys P，etal.Imaging－based chemical screens using normal and glioma－derived neural stem cells［J］.Biochem Soc Trans，2010，38（4）：1067－1071.

［48］Visnyei K，Onodera H，Damoiseaux R，etal.A molecular screening approach to identify and characterize inhibitors of glioblastoma stem cells［J］.Mol Cancer Ther，2011，10（10）：1818－1828.

［49］Hothi P，Martins TJ，Chen L，etal.High－throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells ［J］.Oncotarget，2012，3（10）：1124－1136.

［50］Kang TW，Choi SW，Yang SR，etal.Growth arrest and forced differentiation of human primary glioblastoma multiforme by a novel small molecule ［J］.Scientific Reports，2014，4：5546－5559.

［51］Cho DY，Lin SZ，Yang WK，etal.Recent advances of dendritic cells（DCs）－based immunotherapy for malignant gliomas［J］.Cell Transplant，2009，18（9）：977－983.

［52］Brown CE，Start R，Martinez C，etal.Recognition and killing of brain tumor stem－like initiating cells by CD8＋cytolytic T cells［J］.Cancer Res，2009，69（23）：8886－8893.

［53］Ardon H，De Vlccschouwer S，Van Calenbcrgh F.etal.Adjuvant dendritic cell－based tumour vaccination for children with malignant brain tomour［J］.Pediatr Blood Cancer，2010，54（4）：519－525.

［54］Pellegatta S，Poliani PL，Como D，etal.Neurospheres enriched in cancer stem－like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell－mediated immune response against malignant gliomas ［J］.Cancer Res，2006，66（21）：10247－10252.

［55］Okada H，Kalinski P，Ueda R，etal.Induction of CD8＋T－cell responses against novel glioma－associated antigen peptides and clinical activity by vaccinations withα－type l polarized dendritic cells and polyino sinic－polycytidylic acid stabilized by lysine and carboxymethylcellulose in patients with recurrent malignant glioma［J］.J Cain Onoal，2011，29（3）：330－336.

［56］Hsieh A，Ellsworth R，Hsieh D.Hedgehog／GLI1regulates IGF dependent malignant behaviors in glioma stem cells［J］.Journal of Cellular Physiology，2011，226（4）：1118－1127.

［57］Hu YY，Zheng MH，Chong G，etal.Notch signaling contributes to the maintenance of both normal neural stem cells and patient－derived glioma stem cells［J］.BMC Cancer，2011，11（1）：82－93.

［58］Kim SU.Neural Stem Cell－based Gene Therapy for Brain Tumors［J］.Stem Cell Rev，2011，7（1）：130－140.

［59］Friedrich W，Gabriele S，Klaus JB，etal.Somatische Gentherapie bei Glioblastoma［J］.Deutsche Medical，2001，18（5）：310－311.

［60］Kensler TW，Wakabayashi N，Biswal S.Cell survival responses to environmental stresses via the Keapl－Nrf2－ARE pathway［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47：89－116.

［61］祝劍虹，王漢東，樊友武，等.Nrf2在膠質瘤干細胞和膠質母細胞瘤細胞系中的差異表達［J］.實用醫(yī)學雜志，2014，30（17）：2709－2711.

［62］Iwami K，Natsume A，Wakabayashi T.Gene therapy for highgrade glioma［J］.Neurologia Medico Chirurgica，2010，50（9）：727－736.