實驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型研究

實驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型研究

王銀萍1，陳靜2，林海嬌1，衣春光3，王健1*

(1.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,長春 130021;2.長春市中醫(yī)院,長春 130022;

3.長春中醫(yī)藥大學,長春 130117)

摘要：研究表明，實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)與重癥肌無力(MG)在癥狀、病理、免疫及組織學方面相似。EAMG動物模型主要通過主動或被動免疫實驗動物，制備與重癥肌無力患者的臨床表現(xiàn)、免疫組織學、電生理學等相似的動物模型，為臨床診斷及治療提供依據(jù)。但目前EAMG模型仍不完善，仍需進一步探索。

關鍵詞：自身免疫性重癥肌無力；實驗模型；實驗研究

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.068

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A

文章編號：2095-6258(2015)06-1282-04

基金項目：吉林省教育廳科技發(fā)展計劃項目(吉教科合字[2011第58號]);吉林省教育廳科技發(fā)展計劃項目(吉教科合字[2012第62號]);吉林省教育廳“十一五”規(guī)劃項目(吉教科合字[2010第54號])；吉林省科技廳中藥辦項目(20110933)。

作者簡介：王銀萍(1984-)，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科研究。

收稿日期:(2015-09-20)

*通信作者：王健，主任醫(yī)師，電話-15948000772，電子信箱-jian-wang222@163.com

Experimental autoimmune myasthenia gravis animal models

WANG Yinping1，CHEN Jing2，LIN Haijiao1，YI Chunguang3，WANG Jian1*

(1.Affiliated hospital of Changchun university of Chinese medicine, Changchun 130021, China;

2. Changchun Chinese medicine hospital, Changchun 130022, China;

3. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract：Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis, EAMG) animal model mainly through active or passive immunization of Experimental animals, the preparation and clinical manifestation of patients with Myasthenia Gravis, immune histology, electrophysiology and other similar animal models, which provide the basis for clinical diagnosis and treatment. But currently EAMG model is still not perfect, still need to be solved.

Keywords：EAMG；experimental model；experimental research

重癥肌無力(MG)是一種神經(jīng)-肌肉接頭處傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病。據(jù)統(tǒng)計，本病的發(fā)病率為8～20/10萬[1]，且近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，以老年人為著[2]。為進一步研究本病的發(fā)病機制及治療方法，動物實驗越來越被關注[3-5]。筆者現(xiàn)將近幾年有關本病的動物實驗模型制備作一闡述。

1EAMG的免疫方式

1.1主動免疫法1.1.1以AchR蛋白為免疫原目前最為經(jīng)典的造模方法[6]主要是從丁(氏)雙鰭電鰩的電器官分離乙酰膽堿受體(AchR)，通過Folin酚試劑法及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測提取AchR的含量及活性；以提取的AchR與完全福氏佐劑(CFA)充分混合,分別于實驗大鼠的足墊、腹部及背部皮下多點注射乳劑1.5 mL，第4周再次注射上述乳劑免疫大鼠。CFA對照組只接受等量CFA皮下注射 。此種造模方法是目前最為經(jīng)典、成模率最高的一種實驗方法，延續(xù)至今，目前仍有學者應用這一造模方法[7]。但是在實際中卻難以操作，原因是由于雙鰭電鰩本身稀有，難以捕獲，并且從中提取AchR過程復雜，因此在實際實驗中存在著一定的困難，難以推廣使用。1.1.2以人工合成的AChR-α亞基多肽為免疫原AChR是由2個α、1個β和1個γ亞基組成，3個亞基各有其生理功能，但α亞基是引起MG的抗原決定簇。隨著科學技術的迅速發(fā)展，目前市場上已經(jīng)存在多種人工合成的AchR的α亞基多肽，電鰩中提取AchR的α亞基多肽代價太高，人工多肽逐漸被醫(yī)學界接受。目前使用最多的人工多肽[8]：鼠源性乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段、α138-167肽段、α125-147肽段、α129-145肽段、α1-210肽段等，其免疫過程與徐浩鵬等[6]實驗方法基本一致。近10年的實驗研究主要側重此實驗試劑及方法，而近5年的實驗研究更少。但從文獻報道中顯示，每個實驗的動物模型例數(shù)較少，大多30只左右，缺少大批量的實驗動物。筆者通過多次實驗研究，分別采用人工鼠源性乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段、α129-145肽段進行免疫Lewis大鼠，實驗過程嚴格按照徐浩鵬等[6]實驗方法操作,但最終成模率不足30%,顯示人工合成的AchR的α亞基多肽誘導EAMG成功率并不理想。最新文獻報道[9]，使用AchR(m97-116)肽段-CD205融合單鏈抗體進行免疫C57雌性小鼠共2只，成模率100%，但數(shù)量減少，有待于進一步實驗證明。1.2被動免疫法1.2.1采用MG患者血清中AchR抗體MG被動免疫小鼠模型的制備，采用未進行手術或未使用激素及免疫抑制劑治療的陽性血清患者(SPMG)，正常人的血清為陰性血清(SNMG)，每日分別在小鼠腹腔內(nèi)注射SNMG或SPMG患者血清0.6 mL，連續(xù)7 d。所有小鼠在注射血清后24 h腹腔注射環(huán)磷酰胺(30 mg/kg)以抑制免疫反應[10]。 SCHONBECK等[11]通過胸腺移植建立EAMG，通過移植MG患者的胸腺組織至嚴重免疫缺陷小鼠腎被膜下1~2周后，在實驗小鼠血清中可檢測到抗人AchR-Ab，11周時抗人AchR-Ab滴度可升高至重度MG水平。實驗結果表明，MG患者的胸腺組織可以誘導EAMG。由于MG患者血清中存在各種異常的免疫蛋白及炎癥介質(zhì)，所以在模型制備過程中是否存在干擾，目前無人研究，故此種造模方法尚不能被多數(shù)醫(yī)家接受。1.2.2 采用乙酰膽堿受體單克隆抗體建立動物模型此實驗方法選擇的主要抗體是乙酰膽堿受體(nAchR)單克隆抗體mAb35，主要是通過mAb35注射C57BL/6幼年小鼠腹腔內(nèi)進行免疫。具體實驗方案：健康清潔級雌性C57BL/6小鼠48只，4～5周齡，體質(zhì)量12～14 g,參照文獻[12]將實驗動物分為實驗組(E)和對照組(N)，實驗組分為3組(El、E2、E3)，每組12只。分別經(jīng)腹腔注射含0.5、1.0、1.5 mg/kg mAb35的Ringer’s液0.2 mL給B6幼年小鼠，對照組(N)注射不含mAb35的Ringer’s液0.2 mL[13]，3 d后各組小鼠出現(xiàn)不同程度的肌無力表現(xiàn)，重者可導致呼吸肌無力而死亡 。雖然該實驗方法成模率較高，成模速度快，但臨床癥狀消失也快，不符合人類的患病特點，故該實驗方法難以被廣泛應用。1.2.3基因疫苗免疫小鼠建立重癥肌無力動物模型郝志波等[12]用基因疫苗pcDNA2AchRɑ211免疫C57BL/6小鼠建立 EAMG。方法是將人乙酰膽堿受體α亞基N端的主要免疫區(qū)(AChRa 211)的基因片段插入到穿梭載體pcDNA3．0中，構建基因疫苗pcD-NA2AChRɑ211。大量提純質(zhì)粒pcDNA2AChRɑ211后肌肉注射C57BL/6小鼠。用ELISA法檢測小鼠血清中抗AChRa 211的AChR-Ab，并用PCR方法檢測外源基因在小鼠各組織器官中的分布情況。該實驗方法成功率較高，表現(xiàn)較好，但由于該實驗中需要從MG患者中提取AChRa 211基因片段，過程復雜，要求科技水平較高，實際操作中存在著一定的困難。

2模型成功標準

2.1臨床癥狀首先可以通過測量實驗動物的體質(zhì)量來評估，即實驗前及接種后每2周稱重1次。另外可以通過測量肌力來評估，對于輕度肌無力者可通過疲勞試驗來評估，連續(xù)讓實驗動物重復抓握籠頂30 s再測量。分級方法可采用Lennon進行評分，0級:沒有肯定的肌無力表現(xiàn)；1級:撕咬無力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少，且容易疲勞；2級：明顯無力，在抓握前就出現(xiàn)震顫、低頭、隆背、抓握力弱；3級：在抓握前即有嚴重的肌無力表現(xiàn)、無力抓握、瀕死狀態(tài)；4級：死亡。2.2新斯的明試驗法[14]予新斯的明(37.5 μg/kg)和硫酸阿托品(15 μg/kg)分別于大鼠腹腔注射,12 min后成功模型組大鼠可表現(xiàn)為無力癥狀明顯好轉(zhuǎn)，但一般可持續(xù)2～12 h。2.3低頻重復電刺激檢查電衰減反應陽性[15]將麻醉后的小鼠仰臥固定在解剖板上，將其下肢解剖，分離出腓腸肌及跟腱，然后將肌電圖的電極一根插入腓腸肌內(nèi)側頭,另一根插入跟腱皮下,給予3~5 HZ、連續(xù)10次的低頻電刺激,成功實驗模型經(jīng)刺激后肌電圖應呈現(xiàn)為腓腸肌電位及收縮波幅呈衰減波形。2.4測定血清中AchR-ab的含量通過眼球取血法，將血離心分離血清，分裝后-80 ℃保存待測，采用ELISA法檢測，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，在酶標儀上波長為450 nm處測定A值，根據(jù)標準曲線，讀出抗體水平。2.5AChR數(shù)目的計算將正常組及模型組大鼠腓腸肌溶于l%(體積分數(shù))Triton X-100 中，分別加入過量125Ⅰ標記α-銀環(huán)蛇毒的磷酸鹽緩沖液，孵育1～3 h后加入過量兔抗鼠 IgG，所得沉淀物用磷酸鹽緩沖液沖洗2遍，用γ-計數(shù)儀計數(shù)，再用標準曲線求取已結合抗體的 AChR數(shù)。成功的重癥肌無力模型大鼠肌肉中的AChR數(shù)目與正常大鼠比較明顯減少[16]。2.6光鏡將實驗動物處死，迅速取出腓腸肌，使用多聚甲醛固定，石蠟包埋，辣根氧化酶孵育切片1 h，用磷酸鹽緩沖液反復沖洗3次，再用聯(lián)苯二胺雙氧水在室溫下顯色，最后在光鏡下觀察運動終板上AChR數(shù)目的改變。成功模型組光鏡下可見到EAMG動物神經(jīng)末梢和肌纖維處有巨噬細胞浸潤，部分肌細胞呈節(jié)段性壞死，運動終板上AchR數(shù)目減少 。2.7電鏡與光鏡不同的是電鏡使用高碘酸鹽2賴氨酸 2多聚甲醛(PLP)液固定2 h后沿肌纖維走行切成 0.15 cm×0.15 cm×1.1 cm大小塊，用PBS沖洗后再放入辣根氧化酶中，于4 ℃孵育2 h，再用 PBS洗凈，以聯(lián)苯二胺雙氧水顯色。最后在立體顯微鏡下尋找神經(jīng)肌肉接頭的部位，使用戊二醛及鋨酸固定、脫水、環(huán)氧類樹脂包埋、切片，經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后使用電鏡觀察。電鏡下顯示[17]成功模型組模型突觸后膜皺褶退化，突觸間隙加寬。

3小結

重癥肌無力屬于世界疑難性疾病，發(fā)病率較高，但治療局限，僅限于激素、免疫抑制劑、血漿置換，療效不盡人意，最終給家庭及社會帶來沉重負擔。中醫(yī)藥治療本病療效顯著，但其作用靶點仍缺乏大量動物實驗學證據(jù)。研究表明,EAMG與MG在癥狀、病理、免疫及組織學方面相似，因此越來越多的實驗研究逐漸被重視。經(jīng)典的動物實驗模型是自然提取電鰩中AchR蛋白進行免疫Lewis大鼠,成模率較高，但其制備過程難度高，且電鰩稀有，費用昂貴，因此該實驗方法難以推廣應用；人工合成的AchR蛋白倍受醫(yī)學界歡迎，但通過搜索資料及實驗研究表明，應用人工合成的AchR蛋白進行免疫的實驗方法仍較多，但缺少大量成功模型的研究，并且有關EAMG的實驗方法越來越少。因此，成功制備EAMG模型仍是醫(yī)學工作者亟待解決的問題。

參考文獻：

[1]李柱一.重癥肌無力診斷和治療中國專家共識[J].中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志,2012,19(6):401.

[2]MATSUI N, NAKANE S, NAKAGAWA Y, et al. Increasing incidence of elderly onset patients with myasthenia gravis in a local area of Japan[J]. Journal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry, 2009, 80(10): 1168-1171.

[3]楊春曉,王化冰,王維治.實驗性自身免疫性重癥肌無力模型的制備[J].中國臨床康復,2006,10(28):116-117.

[4]劉麗華,王麗華,李杰,等.重癥肌無力動物模型的建立及應用[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2013,21(2):155-158.

[5]王志強,苗娜,李桂芳,等.雷公藤治療實驗性重癥肌無力大鼠的相關性研究[J].新疆醫(yī)科大學學報,2015,38(9):1103-1109.

[6]徐浩鵬,孫曼霽,周廷沖.丁氏雙鰭電鰩電器官煙堿樣膽堿能受體的分離提純[J].生物化學與生物物理學報,1984(5):50-55.

[7]喬文軍,張靜生. 建立實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠模型的一種方法[J],遼寧中醫(yī)雜志,2010,37(11):2246-2247.

[8]劉蘭濤,郭尚福,郎志芳. 雷公藤多苷對實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠的治療作用研究[J],中國醫(yī)院用藥評價與分析,2010,37(11):2246-2247.

[9]孫超,袁媛,鄭鵬飛.小鼠AchR(m97-116)肽段-CD205融合單鏈抗體的表達及活性檢測[J].中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志,2014,12(14):1067-1070.

[10]李保華.血清陰性和陽性重癥肌無力被動轉(zhuǎn)移動物模型的對比觀察[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2003,11(1):25-29.

[11]SEHONBECK S, PADBERG F, H O H, et al. Transplantation of thymic autoimmune microenvironment to serve combined immunenodeficiency mice.A new model of myasthenia gravis[J]. Journal of Clinical Investigation, 1992, 90(1): 245-250.

[12]郝志波.基因疫苗pcDNA2AChRa21l免疫小鼠建立重癥肌無力動物模型[J].中國免疫學雜志,2006,22(3):216-225.

[13]黃志,徐秀娟.nAChR單克隆抗體建立重癥肌無力被動轉(zhuǎn)移小鼠模型的研究[J].第三軍醫(yī)大學報,2006,28(13):1397-1399.

[14]DENG C, GOLUSZKO E, TUZUN E, et al. Resistance to experimental autoimmune myasthenia gravis IL-6 dificient mice is associated with reduced germinal center formation and C3 producetion[J]. Journal of Immunology, 2002, 169(2): 1077-1083.

[15]LENNON V A, LINDSTROM J M, SEYBOLD M E, et al. Experimental autoimmune myasthenia:A model of myasthenia gravis rats and guinca pigs[J]. Journal of Experimental Medicine, 1975, 141(6): 1365-1372.

[16]BURGES J. Passive transfer of esronegative myasthenia gravis to mice[J]. Muscle & Nerve, 1994, 17(12): 1393-1398.

[17]GU D, WOGENSEN L, CALCUTT N, et al. Myasthenia gravis-like syndrome induced by expression of interferon-γ in the neuromuscular junction[J]. Journal of Experimental Medicine, 1995, 181(2): 547-557.