α硫辛酸對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)PKA-CREB信號(hào)通路的影響

楊麗萍，凌書建，張國華，王珊(邯鄲市中心醫(yī)院，河北邯鄲05600;河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

α硫辛酸對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)PKA-CREB信號(hào)通路的影響

楊麗萍1，凌書建1，張國華2，王珊2
(1邯鄲市中心醫(yī)院，河北邯鄲056001;2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

摘要:目的探討α硫辛酸對(duì)Aβ1-42所致阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)PKA-CREB信號(hào)通路的影響。方法24只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和硫辛酸組各6只。模型組和硫辛酸組采用雙側(cè)海馬一次性注射Aβ1-42的方法建立AD模型。各組均采用Morris水迷宮行定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)，檢測(cè)記憶能力(逃避潛伏期)及學(xué)習(xí)能力(跨越平臺(tái)次數(shù));采用Western blotting法檢測(cè)海馬組織中蛋白激酶A(PKA)Ⅱα與p-CREB蛋白。結(jié)果與模型組比較，α硫辛酸組、對(duì)照組及假手術(shù)組逃避潛伏期明顯延長、跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P均＜0.01);海馬區(qū)組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達(dá)明顯升高(P均＜0.01)。其中α硫辛酸組海馬區(qū)組織PKAⅡα、p-CREB蛋白相對(duì)表達(dá)分別為0.739±0.417和0.380±0.329，明顯高于模型組0.520± 0.462、0.219±0.452，P均＜0.01。結(jié)論α硫辛酸能夠明顯提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶和空間探索能力;其機(jī)制可能為活化PKA-CREB信號(hào)通路，提高PKAⅡα、p-CREB蛋白表達(dá)。

關(guān)鍵詞:阿爾茨海默病;蛋白激酶A; cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白;α硫辛酸;大鼠

阿爾茨海默病(AD)是目前神經(jīng)退行性疾病及癡呆的最常見原因，其發(fā)病機(jī)制仍不明確。AD特征性的病理改變是在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域的細(xì)胞外出現(xiàn)以β-淀粉樣蛋白(Aβ)為核心的老年斑、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及選擇性的神經(jīng)元缺失。α硫辛酸(α-LA)是一種獨(dú)特的氧化-還原雙向的氧化應(yīng)激強(qiáng)效抑制劑，主要通過清除自由基，螯合金屬離子，再生其他抗氧化劑和修復(fù)氧化損傷而發(fā)揮抗氧化作用［1］。2012年2月～2013年1月，我們觀察了α硫辛酸對(duì)AD模型大鼠海馬組織蛋白激酶A(PKA)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)表達(dá)的影響，探討α硫辛酸的腦保護(hù)作用及其機(jī)制，為其臨床治療AD提供可能的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠24只，4個(gè)月齡，體質(zhì)量(200±34)g，由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，自由攝取飲食。大鼠立體定位儀(日本東京成茂科學(xué)器械研究所)，水迷宮(北京新天地公司)，紅外線掃描儀(Odyssey Li-cor Gene公司)，Aβ1-42(Sigma公司)，PKA Ⅱα試劑盒(Santa公司)，p-CREB試劑盒(CS T公司)，α硫辛酸(Sigma公司)。

1.2模型制作與干預(yù)按隨機(jī)數(shù)字表將24只大鼠分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和α硫辛酸組各6只。行水迷宮訓(xùn)練3天后，模型組和α硫辛酸組制作AD模型［2］: 10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉。將大鼠固定于腦立體定位儀上，選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)，于前囟向后4.5mm，中線旁開2mm處，鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針2mm，將5 μL聚集態(tài)1 μg/ μL Aβ1-42溶液緩慢注入，留針10min，使Aβ1-42充分浸潤局部組織，緩慢撤針，用骨蠟封閉顱骨創(chuàng)口，縫合切口。正常對(duì)照組不予處理，假手術(shù)組注入等體積生理鹽水。造模后24 h，α硫辛酸組腹腔注射α硫辛酸100mg/(kg·d)，正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，共21天。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試藥物干預(yù)后各組均采用Morris水迷宮行定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)［2］。①定位航行試驗(yàn):將大鼠面向池壁分別從四個(gè)入水點(diǎn)放入水中，2min內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間即為逃避潛伏期。若2min內(nèi)未找到平臺(tái)，則用手牽引幫助其至平臺(tái)上并停留10 s，其逃避潛伏期為2min。每次訓(xùn)練間隔60 s，連續(xù)測(cè)試5天，每天上下午各2次。②空間探索試驗(yàn):測(cè)試第6天撤除平臺(tái)，將大鼠從入水點(diǎn)放入水中，記錄其2min內(nèi)穿越原來平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.3.2海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blotting法。學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試后麻醉大鼠迅速斷頭取腦，分離出海馬組織(冰上操作)，立即置液氮中保存。取50mg海馬組織，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入裂解液500 μL，蛋白磷酸酶抑制劑混合物5 μL，采用超聲勻漿器破碎組織;離心，取上清作為待分析的樣品。用BCA法［3］測(cè)定蛋白濃度。取含60 μg蛋白質(zhì)的樣品經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)到PVDF膜，室溫封閉1 h，與PKAⅡα、p-CREB抗體進(jìn)行雜交，4℃過夜，用TBST洗膜3次，與二抗辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和GAPDH進(jìn)行雜交，避光置于搖床，室溫下孵育1 h，TBST洗二抗，4次，應(yīng)用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)PKAⅡα和p-CREB蛋白表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料檢驗(yàn)正態(tài)分布后，以珋x±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間比較用SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶能力

2.1.1定位航行試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M逃避潛伏期第1～5天下降不明顯，余各組均有明顯下降趨勢(shì)。模型組逃避潛伏期明顯長于正常對(duì)照組及假手術(shù)組(P＜0.01)，且隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，這種差異表現(xiàn)得更為明顯;α硫辛酸組逃避潛伏期明顯短于模型組，但均高于正常對(duì)照組與假手術(shù)組(P均＜0.01);假手術(shù)組與正常對(duì)照組避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);見表1。

表1　各組逃避潛伏期比較(s，)

表1　各組逃避潛伏期比較(s，)

注:與假手術(shù)組及正常對(duì)照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01。

組別　n　　第1天　　第2天　　第3天　　第4天　　第5天正常對(duì)照組　6　69.92±3.97　60.67±1.50　50.83±3.54　41.25±3.08　30.92±3.68假手術(shù)組　6　71.75±3.19　63.33±4.76　53.17±3.93　42.50±3.71　30.42±2.47模型組　6　80.67±4.48*　78.92±4.08*　77.83±3.01*　77.00±3.52*　76.08±3.94*α硫辛酸組　6　75.67±3.96* #　72.08±3.40* #　66.08±3.18* #　60.75±3.16* #　51.50±4.29*#

2.1.2空間探索試驗(yàn)正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、α硫辛酸組2min內(nèi)跨越平臺(tái)的次數(shù)分別為(16.25±3.48)次、(14.75±2.99)次、(5.88± 1.83)次和(9.54±3.09)次，模型組跨越平臺(tái)的次數(shù)明顯少于假手術(shù)組及正常對(duì)照組(P＜0.01)，α硫辛酸組跨越平臺(tái)次數(shù)明顯多于模型組，但少于少于假手術(shù)組及正常對(duì)照組(P均＜0.01)。

2.2各組海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達(dá)明顯降低(P均＜0.01);與模型組比較，α硫辛酸組海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白表達(dá)明顯增多(P均＜0.01)。見表2、圖1、圖2。

表2　各組海馬組織PKAⅡα和p-CREB蛋白表達(dá)比較(相對(duì)表達(dá)量，)

表2　各組海馬組織PKAⅡα和p-CREB蛋白表達(dá)比較(相對(duì)表達(dá)量，)

注:與正常對(duì)照組及假手術(shù)組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01。

組別　n　PKAⅡαp-CREB正常對(duì)照組6　0.910±0.263　0.523±0.526假手術(shù)組　6　0.898±0.279　0.503±0.267模型組　6　0.520±0.462*　0.219±0.452*α硫辛酸組　6　0.739±0.417* #　0.380±0.330*#

3　討論

研究證實(shí)，Aβ沉積于細(xì)胞外所致的神經(jīng)毒性作用是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素［3］。Aβ導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激及誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞變性和凋亡是AD患者認(rèn)知機(jī)能障礙的主要原因［4］。采用Morris水迷宮行為學(xué)方法，測(cè)定各組學(xué)習(xí)記憶能力。模型組平均逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組及正常對(duì)照組，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，提示大鼠出現(xiàn)顯著的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。

圖1　各組海馬組織PKAⅡα蛋白表達(dá)

圖2　各組海馬組織p-CREB蛋白表達(dá)

CREB是多種蛋白激酶的磷酸化底物。因其能刺激基因轉(zhuǎn)錄，故又稱為“轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子”。PKA是

最早被確認(rèn)，也是最重要的蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)，長時(shí)性記憶需要新蛋白質(zhì)的合成［5］，而PKA-CREB信號(hào)通路在新蛋白質(zhì)的合成過程中發(fā)揮重要作用［6］。其中CREB的活化是學(xué)習(xí)記憶的分子標(biāo)志，能夠促進(jìn)長時(shí)性記憶的形成［7～9］?；罨腜KA能夠使CREB的Ser133磷酸化，從而引起其分子構(gòu)像的變化，刺激了CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶基因被大量轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)一步影響促進(jìn)與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的新蛋白質(zhì)合成。在這些新蛋白質(zhì)中包括大量與長時(shí)性記憶相關(guān)的因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、即刻早期基因產(chǎn)物c-Fos、神經(jīng)營養(yǎng)因子、Bcl-2蛋白等，均參與學(xué)習(xí)記憶的形成和維持。實(shí)驗(yàn)證明，Aβ能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶的活化，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低，致使PKA失活，最終使CREB不能磷酸化而抑制LTM的形成［10］。Takeo等［11］報(bào)道PKA抑制劑的使用可明顯阻礙長期記憶的形成。本研究結(jié)果顯示，模型組海馬PKAⅡα及p-CREB蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組，提示其海馬PKACREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活動(dòng)受抑制，損害了大鼠的記憶學(xué)習(xí)能力。

許多學(xué)者認(rèn)為，氧化應(yīng)激在AD發(fā)生的過程中起重要作用，研究顯示Aβ可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞生產(chǎn)氧自由基，認(rèn)為Aβ的神經(jīng)毒作用部分是由自由基介導(dǎo)的［12］。α硫辛酸是已知天然抗氧化劑中效果最強(qiáng)的，被譽(yù)為“萬能抗氧化劑”。α硫辛酸的抗氧化性主要表現(xiàn)在清除活性氧自由基、螯合金屬離子、再生內(nèi)源性抗氧化劑及修復(fù)氧化損傷細(xì)胞等方面。Kenjiro等［13］研究發(fā)現(xiàn)，α硫辛酸能夠在體外能抑制Aβ蛋白聚集，減少Aβ的形成，還能夠使已經(jīng)聚集的Aβ降解。魏文青等［14］對(duì)β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的研究也表明，α硫辛酸可拮抗Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。對(duì)一些轉(zhuǎn)基因AD模型大鼠的研究也表明，大鼠α硫辛酸干預(yù)后學(xué)習(xí)和記憶能力明顯增強(qiáng)［15］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，α硫辛酸組學(xué)習(xí)記憶能力明顯好于模型組，海馬組織PKAⅡα、p-CREB蛋白水平表達(dá)明顯高于模型組，證實(shí)α硫辛酸的神經(jīng)保護(hù)作用確切，其作用可能是通過PKA-CREB信號(hào)通路的活化來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，α硫辛酸能夠抑制Aβ對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的損害，提高AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。其作用機(jī)制可能是上調(diào)PKA、CREB的表達(dá)。

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·臨床研究·

收稿日期:( 2014-12-29)

文章編號(hào):1002-266X(2015)36-0029-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R741

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.010