篩選自人卵巢癌細胞系HO8910的干細胞生物學特性分析

方麗莎，許君，仇影影，閆洪超，林小滿，黃紅香，韓秋峪(徐州醫(yī)學院，江蘇徐州006;徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

篩選自人卵巢癌細胞系HO8910的干細胞生物學特性分析

方麗莎1，許君1，仇影影1，閆洪超2，林小滿2，黃紅香2，韓秋峪2
(1徐州醫(yī)學院，江蘇徐州221006;2徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

摘要:目的探討篩選自人卵巢癌細胞系HO8910干細胞的生物學特性。方法將前期篩選卵巢癌細胞系HO8910的干細胞在無血清培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，以HO8910細胞作為對照。體外觀察兩種細胞的球體形成能力;將兩種細胞接種于含血清培養(yǎng)基，觀察其分化能力，并檢測干細胞相關(guān)標記物;采用藥敏試驗檢測兩種細胞對順鉑、多柔比星及米托蒽醌的敏感性;將無血清培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)的兩種細胞接種于NOD/SCID裸鼠，觀察其體內(nèi)成瘤情況。結(jié)果HO8910細胞在無血清培養(yǎng)基中的球體形成能力明顯低于卵巢癌細胞(P＜0.05)。卵巢癌干細胞分化前CD133、CD117陽性表達率明顯高于分化后(P均＜0.05)。卵巢癌干細胞分化后ABCG2、Nanog、Oct4、BCRP、E-cadherin表達均低于分化前(P均＜0.05)，與HO8910細胞分化前后上述指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)。0.25、0.5 μg/mL順鉑，0.5、1.5 μmol/L多柔比星，0.05、0.25 μg/mL米托蒽醌作用于卵巢癌干細胞、HO8910細胞48 h時，卵巢癌干細胞的相對活性均高于HO8910細胞(P均＜0.05)。裸鼠接種1×103個卵巢癌干細胞即可成瘤;隨著干細胞接種數(shù)量的增加，成瘤比率逐漸增加，成瘤時間逐漸縮短(P均＜0.05)。結(jié)論篩選自人卵巢癌細胞系HO8910的卵巢癌干細胞具有自我更新和分化、體內(nèi)成瘤、高表達干細胞基因以及對化療耐藥等特性，符合腫瘤干細胞的理論標準。

關(guān)鍵詞:卵巢腫瘤;卵巢癌;腫瘤干細胞; HO8910細胞系; NOD/SCID裸鼠

Identification of biological characteristics of human ovarian cancer cell line HO8910-derived stem cells

FANG Li-sha1，XU Jun，QIU Ying-ying，YAN Hong-chao，LIN Xiao-man，
HUANG Hong-xiang，HAN Qiu-yu
(1 Xuzhoumedical College，Xuzhou 221002，China)

Abstract:ObjectiveTo identify the biological characteristics of human ovarian cancer cell line HO8910-derived stem cells.Methods The pre-screening of ovarian cancer cell line HO8910-derived stem cells were subcultured(HO8910 cells were used as the control group)in serum-freemedium.The capacities of forming spheroids and self-renew were observed.Then ovarian cancer stem cells(CSCs)were seeded inmedium containing serum and cultured to observe thedifferentiation capacity，and the stem cell-specificmarkers were also tested.We tested the sensitivity of stem cells to cisplatin，doxorubicin andmitoxantrone by usingdrug susceptibility test.Finally，we inoculated the ovarian CSCs after passaging from culturing in serum-freemedia to NOD/SCID(non-obesediabetic/severe combined immunodeficientmice)mice in order to observe the tumorigenicity in vivo.Results The forming spheroid capacity of HO8910 cells in the serum-freemedium was significantly lower than that of the ovarian cancer cells(P＜0.05).The positive expression rates of CD133 and CD117 in the ovarian CSCs beforedifferentiation were higher than those afterdifferentiation(all P＜0.05).The expression of ABCG2，Nanog，Oct4，BCRP and E-cadherin in the ovarian CSCs afterdifferentiation was lower than that beforedifferentiation(all P＜0.05).No statistical significance was found in the above indexes before and after HO8910 cellsdifferentiation(all P＞0.05).The relative activities in the ovarian CSCs were higher than in HO8910 cells when they were respectively treated with 0.25 and 0.5 μg/mL cisplatin，0.5 and 1.5 μmol/Ldoxorubicin and 0.05 and 0.25 μg/mLmitoxantrone for 48 h(all P＜0.05).The tumor formed when the nudemouse was inoculated with 1×103ovarian CSCs.With the increase of inoculated stem cells，the tumor formation ratio was gradually increased(all P＜0.05)，and the time was gradually

shortened(all P＜0.05).Conclusion The ovarian CSCsderived from human ovarian cancer cell line HO8910 have the abilities of self-renew，differentiation，in vivo tumorigenicity，highly expressed stem cell genes andmultidrug resistance，whichmeet the standard of tumor stem cell theory.

Key words:ovarian neoplasms; ovarian carcinoma; tumor stem cells; HO8910 cell line; NOD/SCID nudemouse

腫瘤干細胞是一類具有自我更新能力的細胞，能夠進行無限增殖和多向分化，被認為是腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥以及復(fù)發(fā)的根源［1，2］。近年來，隨著腫瘤干細胞的研究進展，人們開始從新的角度重新認識卵巢癌的生物學行為。本課題組前期以人卵巢低分化漿液性囊腺癌細胞株HO8910為研究對象，采用紫杉醇結(jié)合無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，并通過體外及體內(nèi)實驗成功篩選出具有CD+133、CD+117特征的人卵巢癌干細胞［3］。本研究探討篩選自人卵巢癌細胞系HO8910的干細胞的生物學特性。

1　材料與方法

1.1材料細胞:人卵巢低分化漿液性囊腺癌細胞株HO8910及其來源的具有CD+133、CD+117特征的人卵巢癌干細胞，由徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室提供。動物: NOD/SCID雌性裸小鼠，鼠齡4～6周，購自中國科學院上海實驗動物中心。主要試劑: RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，含有表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、Noggi及白細胞抑制因子的無血清培養(yǎng)基(美國Sigma公司)，CD133、CD117、ABCG2、Nanog、Oct4、BCRP及E-cadherin一抗(美國Chemicon公司)，順鉑、多柔比星及米托蒽醌(上海信裕生物科技有限公司)。

1.2細胞培養(yǎng)人卵巢癌干細胞采用含有EGF、bFGF、Noggi及LIF的無血清培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。HO8910細胞采用常規(guī)RPMI 1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清，于37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.3卵巢癌干細胞體外連續(xù)球體形成能力檢測取前期凍存保留的干細胞球體，體外復(fù)蘇。PBS洗滌兩遍后，0.25%胰酶消化并制成單細胞懸液，洗去胰酶后重懸于無血清培基中培養(yǎng)，觀察球體形成的時間和大小。待球體形成后，將球體再次消化并吹打成單細胞懸液，在相同條件下重新予以懸浮培養(yǎng)，觀察再次形成球體的時間和大小。連續(xù)傳代4次，進行后續(xù)實驗。

1.4卵巢癌干細胞的自我更新能力檢測采用0.25%胰酶分別消化干細胞球體和HO8910細胞成單個細胞懸液，臺盼藍染色進行活細胞記數(shù)后，采用無血清培養(yǎng)基分別稀釋細胞懸液至密度為1×103個/mL?；靹蚝螅靡埔簶寣煞N細胞懸液分別轉(zhuǎn)移到96孔板，每組各20孔，每孔100 μL(平均每孔含100個細胞)。每孔分別再添加100 μL無血清培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)，以后每天添加25 μL培養(yǎng)基，7d后計數(shù)每孔形成球體數(shù)。

1.5卵巢癌干細胞的分化能力檢測取傳代培養(yǎng)的干細胞球體或常規(guī)培養(yǎng)的HO8910細胞，0.25%胰酶消化并反復(fù)吸打成細胞懸液，直接接種到含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，使其貼壁生長并分化，顯微鏡下觀察其分化情況。流式細胞儀檢測分化前后CD133、CD117表達，Western blotting法檢測分化前后ABCG2、Nanog、Oct4、BCRP及E-cadherin表達情況。

1.6卵巢癌干細胞對化療藥物的敏感性檢測取傳代培養(yǎng)的干細胞球體(實驗組)或常規(guī)培養(yǎng)的HO8910細胞(對照組)，0.25%胰酶消化并反復(fù)吸打成細胞懸液，臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)后，將干細胞接種于含有無血清培養(yǎng)基的96孔板中(6 000 個/孔)，分別加入順鉑、多柔比星和米托蒽醌。每種藥物取其半數(shù)抑制濃度(IC50)附近2個梯度的濃度，順鉑0.25、0.5 μg/mL，多柔比星0.5、1.5 μmol/ L，米托蒽醌0.05、0.25 μg/mL，每個藥物濃度設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)基吸去，加入10% CCK-8，并設(shè)立調(diào)零孔(只加入CCK-8試劑、不含細胞)。置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用紫外分光光度儀測定450 nm處的光密度(OD)值。細胞相對活性=(OD實驗組－OD調(diào)零孔)/(OD對照組－OD調(diào)零孔)。細胞相對活性越低說明藥物敏感性越高。

1.7卵巢癌干細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力檢測取傳代培養(yǎng)的干細胞球體，0.25%胰酶消化并反復(fù)吸打成細胞懸液，臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)。按2×105、2×104、2×103、1×103個/mL的密度梯度分別接種于5只NOD/SCID雌性裸鼠。每只裸鼠右腋窩皮下接種卵巢癌干細胞，左腋窩皮下接種相同數(shù)量的常規(guī)培養(yǎng)的HO8910細胞。每周2次觀察腫瘤生長情況。成瘤能力用成瘤比率(成瘤的裸鼠數(shù)/接種的裸鼠數(shù))和成瘤時間(從細胞接種到有可觸及的瘤體形成的時間)表示。當瘤體積達到1 cm3左右或接種后4個月仍未成瘤，將裸鼠處死，手術(shù)摘

取成瘤裸鼠皮下的瘤組織。用PBS將瘤組織表面的血液沖洗干凈，用滅菌后的眼科剪將組織塊盡量剪碎，使碎片直徑不超過1mm。將剪碎的組織倒入50mL離心管中，用30mL PBS重懸，1 200 r/min離心5min，去除上清液;用配制好的含有膠原酶Ⅳ(終濃度為1mg/mL)、0.04%dNA酶I的培養(yǎng)基重懸沉淀物，置于37℃恒溫水浴搖床中消化2 h。再將消化好的細胞懸液經(jīng)100 μm濾網(wǎng)過濾，離心，PBS洗滌1次。接種至無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待形成球體后，按照上述方法及濃度再次接種于NOD/ SCID雌性裸鼠體內(nèi)，以常規(guī)培養(yǎng)的HO8910細胞作為對照，觀察其連續(xù)成瘤能力。

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s或中位數(shù)表示，組間比較采用t檢驗或方差分析;計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1卵巢癌干細胞體外連續(xù)球體形成能力觀察復(fù)蘇后第1次傳代的卵巢癌干細胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下從第4天開始形成細胞球體，第9天達到平臺期。經(jīng)過連續(xù)傳代后依然能夠形成球體，培養(yǎng)到第4代時，卵巢癌干細胞從第2天開始形成細胞球體，第5天達到平臺期，且直徑較第1代明顯增大。見插頁Ⅰ圖1。

2.2卵巢癌干細胞的自我更新能力100個HO8910細胞在無血清培養(yǎng)基中可形成(5.36± 1.28)個細胞球體，100個卵巢癌干細胞形成的細胞球體數(shù)為(39.61±3.52)個，兩者比較P＜0.05。

2.3卵巢癌干細胞的分化能力將吹打成細胞懸液的卵巢癌干細胞轉(zhuǎn)移到含血清培基中，4 h后部分細胞開始貼壁分化，但仍有部分細胞維持球體狀態(tài)，貼壁細胞的形態(tài)與HO8910細胞相似; 24 h后可見幾乎所有的細胞均貼壁生長;見插頁Ⅰ圖2。卵巢癌干細胞分化前CD133、CD117陽性表達率分別為87.1%、79.3%，分化后分別為19.6%、21.4%，分化前后比較，P均＜0.05; HO8910細胞分化后CD133、CD117陽性表達率分別為16.9%、19.1%，與卵巢癌干細胞分化后比較，P均＞0.05。卵巢癌干細胞分化后ABCG2、Nanog、Oct4、BCRP、E-cadherin表達均低于分化前(P均＜0.05)，與HO8910細胞分化后比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05);見表1。

表1　卵巢癌干細胞、HO8910細胞分化前后干細胞標志物表達比較(OD值，)

表1　卵巢癌干細胞、HO8910細胞分化前后干細胞標志物表達比較(OD值，)

注:與同組分化前比較，*P＜0.05。

細胞ABCG2　Nanog　Oct4　BCRP　E-cadherin卵巢癌干細胞分化前　0.77±0.32　0.82±0.04　0.81±0.36　0.87±0.18　0.37±0.17分化后　0.31±0.71*　0.27±0.21*　0.25±0.33*　0.39±0.92*　0.69±0.12*HO8910細胞分化前　　－　?。　。　。　。只蟆?.28±0.01　0.23±0.11　0.21±0.79　0.42±0.69　0.73±0.02

2.4卵巢癌干細胞對化療藥物的敏感性0.25、0.5 μg/mL順鉑，0.5、1.5 μmol/L多柔比星，0.05、0.25 μg/mL米托蒽醌作用卵巢癌干細胞、HO8910細胞48 h時，卵巢癌干細胞的相對活性均高于HO8910細胞(P均＜0.05)。見表2。

表2　順鉑、多柔比星、米托蒽醌作用下卵巢癌干細胞、HO8910細胞相對活性比較()

表2　順鉑、多柔比星、米托蒽醌作用下卵巢癌干細胞、HO8910細胞相對活性比較()

注:與HO8910細胞比較，*P＜0.05。

細胞細胞相對活性順鉑(μg/mL)0.25　0.5多柔比星(μg/mL)0.5　1.5米托蒽醌(μg/mL)0.05　0.25卵巢癌干細胞　0.807±0.102*　0.676±0.041*　0.703±0.059*　0.479±0.013*　0.638±0.117*　0.306±0.019*HO8910細胞　0.482±0.131　0.302±0.071　0.511±0.062　0.202±0.097　0.299±0.069　0.097±0.073

2.5卵巢癌干細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力裸鼠接種1×103個卵巢癌干細胞即可成瘤，成瘤比率為2/5，成瘤時間為47～53d;隨著干細胞接種數(shù)量的增加，成瘤比率逐漸增加(P均＜0.05)，成瘤時間逐漸縮短(P均＜0.05)。裸鼠接種至少2×104個HO8910細胞才能成瘤。接種2×104個卵巢癌干細胞的成瘤比率比明顯高于接種2×104個HO8910細胞的成瘤比率(P＜0.05)，且成瘤時間縮短(P＜0.05)。將接種卵巢癌干細胞成瘤的瘤組織制成細胞懸液，重懸于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)7d形成細胞球體，將球體消化制成單細胞懸液后，再次接種于裸鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，裸鼠接種1×103個卵巢癌干細胞即可成瘤，成瘤比率為1/5，成瘤時間為51d;隨著干細胞接種數(shù)量的增加，成瘤比率逐漸增加(P均＜0.05)，成瘤時間逐漸縮短(P均＜0.05)。裸鼠至少接種2×104個HO8910細胞才能成瘤。裸鼠接種2×104個卵巢癌干細胞的成瘤比率高于

接種2×104個HO8910細胞的成瘤比率(P＜0.05)，且成瘤時間縮短(P＜0.05)。見表3。

表3　接種不同數(shù)量卵巢癌干細胞、HO8910細胞的成瘤比率及時間比較

3　討論

目前的研究表明，腫瘤干細胞具有自我更新能力、分化潛能、表達干細胞標志基因、對化療藥物抵抗、免疫缺陷鼠體內(nèi)成瘤等生物學特性［4～10］。本研究對前期篩選出來的卵巢癌干細胞的生物學特性進行檢測，結(jié)果表明，卵巢癌干細胞與普通HO8910細胞比較，具有更強的球體形成能力，且在體外能夠連續(xù)形成細胞球體，提示卵巢癌干細胞在體外具有很強的自我更新能力。在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵巢癌干細胞能夠分化成為與HO8910細胞相似的細胞，分化后的干細胞標記物CD133、CD117、ABCG2、Nanog、Oct4及BCRP表達均低于分化前，分化潛能標志物E-cadherin表達高于分化前，且分化后各標記物表達與HO8910細胞差異均無統(tǒng)計學意義，提示卵巢癌干細胞具有較強的分化潛能，符合卵巢癌起源于卵巢干細胞的觀點。

腫瘤干細胞區(qū)別于成熟、分化細胞的特性之一就是對化療藥物抵抗［11］。本研究選用治療卵巢癌的一線化療藥物順鉑，以及在其他類型腫瘤干細胞研究中使用最多的藥物多柔比星和米托蒽醌，以對比研究卵巢癌干細胞和HO8910細胞藥物敏感性的差異。結(jié)果顯示，卵巢癌干細胞具有明顯的多藥耐藥特性，與其他類型腫瘤研究結(jié)果相符［12，13］。因此推測，在臨床治療中，化療藥物雖然殺死了卵巢癌患者體內(nèi)絕大多數(shù)的腫瘤細胞，但仍有極少比例的卵巢癌干細胞能夠耐受藥物的殺傷力，經(jīng)過一段時間的自我修復(fù)后又開始大量增殖，最終導致腫瘤復(fù)發(fā)。

本研究我們分別將卵巢癌干細胞和HO8910細胞接種于NOD/SCID雌性裸鼠，觀察其體內(nèi)成瘤能力。結(jié)果顯示，卵巢癌干細胞成瘤能力至少為HO8910細胞的20倍，而且經(jīng)過體內(nèi)傳代后的卵巢癌干細胞仍具有連續(xù)形成腫瘤的能力，進一步說明卵巢癌干細胞在體內(nèi)依然具有自我更新和分化能力，其一方面通過自我更新以維持其比例保持恒定，另一方面分化形成大量的HO8910細胞。卵巢癌干細胞經(jīng)過體內(nèi)的自我更新和分化后，重新形成了由少數(shù)強致瘤性的干細胞和多數(shù)弱致瘤性的HO8910細胞構(gòu)成的表型和功能異質(zhì)性的細胞群體，在經(jīng)無血清培養(yǎng)基篩選后保留的少數(shù)強致瘤性的干細胞依然可以形成細胞球體，并具有在裸鼠體內(nèi)連續(xù)形成腫瘤的能力。

綜上所述，來自人卵巢癌細胞系HO8910的卵巢癌干細胞具有自我更新和分化、體內(nèi)成瘤、高表達干細胞基因以及對化療耐藥等特性，符合腫瘤干細胞的理論標準。

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收稿日期:( 2014-12-03)

通訊作者簡介:閆洪超(1973-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要研究方向為婦科腫瘤。E-mail: yanhongchao898@ sina.com

作者簡介:第一方麗莎(1987-)，女，住院醫(yī)師，主要研究方向為婦科腫瘤。E-mail: 120335540@ qq.com

文章編號:1002-266X(2015)36-0017-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R73-3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.006