典則分析研究柴胡達(dá)原飲不同煎煮方式對化學(xué)成分溶出的影響

王淑玲,余向軍,詹怡飛,趙振坤,龐瀟卿,謝　恬,曾昭武,4

(1．杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310036；2.淳安縣楓樹嶺鎮(zhèn)綜合農(nóng)技服務(wù)中心，浙江 杭州 311717； 3.杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，

浙江 杭州 310012；4.大連華立金港藥業(yè)有限公司，遼寧 大連 116000)

典則分析研究柴胡達(dá)原飲不同煎煮方式對化學(xué)成分溶出的影響

王淑玲1,余向軍2*,詹怡飛3,趙振坤1,龐瀟卿1,謝恬1,曾昭武1,4

(1．杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310036；2.淳安縣楓樹嶺鎮(zhèn)綜合農(nóng)技服務(wù)中心，浙江 杭州 311717； 3.杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，

浙江 杭州 310012；4.大連華立金港藥業(yè)有限公司，遼寧 大連 116000)

摘要：研究柴胡達(dá)原飲多種分煎、合煎方式對柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚5種成分溶出的影響.將柴胡達(dá)原飲方中10味中藥材，按照君臣佐使分為4組：A(黃芩、柴胡)，B(枳殼、桔梗、厚樸、草果、青皮、檳榔)，C(荷葉)，D(炙甘草).按照排列組合排成15種組合方式.采用UFLC檢測提取液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量.運(yùn)用SAS 9.1對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析和綜合評判.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5種成分均能達(dá)到基線分離，各成分均有較寬的線性范圍和良好的線性關(guān)系；枳殼在合煎、分煎中受到的影響與青皮、厚樸是不同的；較佳組合為ACD+B，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量分別為1.3130、0.6370、1.9420、0.8786、0.6110 mg/mL.ACD+B方式分煎，5種成分的溶出最大；相關(guān)分析能較好地揭示各組分的相互關(guān)系.

關(guān)鍵詞：柴胡達(dá)原飲; 合煎; 分煎; 相關(guān)分析; 綜合評價(jià)法

柴胡達(dá)原飲，現(xiàn)代多用于治療流行性感冒、夏秋季無名高熱及不明原因的發(fā)熱而癥見寒熱往來，胸膈痞滿，苔白厚膩，脈弦滑者，療效較好.處方由清代醫(yī)家俞根初首創(chuàng)，出自《重訂通俗傷寒論》，由柴胡、黃芩、枳殼、青皮、厚樸、桔梗、草果、檳榔、荷葉、炙甘草組成.以柴芩為君者，以柴胡疏達(dá)膜原之氣機(jī)，黃芩苦泄膜原之郁火也.臣以枳、桔開上，樸、果疏中,青、檳達(dá)下，以開達(dá)三焦之氣機(jī)，使膜原伏邪從三焦而外達(dá)肌腠也.佐以荷透之；使以甘草和之.整個(gè)處方透表清里，宣暢三焦，透達(dá)募原.枳殼、青皮、厚樸均為此方中的臣藥.柚皮苷、新橙皮苷是枳殼的主要藥用成分；橙皮苷是青皮的主要藥用成分；厚樸酚、和厚樸酚是厚樸的的主要藥用成分.本文通過測定15種組合方式所煎湯劑中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚的含量，研究15種組合方式對這5種成分溶出的影響，選擇溶出度綜合評價(jià)值高的組合方式對于提高全方藥效具有重要意義.

1儀器與材料

超高效液相色譜儀、工作站及紫外檢測器(日本Shimadzu公司)；FA1100型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；甲醇(色譜純，天津四友)，水為去離子雙蒸水(實(shí)驗(yàn)室自制)；柚皮苷對照品(10236472)由中國藥品生物制品鑒定所提供，橙皮苷、新橙皮苷(10191201111)、厚樸酚、和厚樸酚(10191201203)由南昌貝塔生物科技有限公司提供；磷酸(分析純，杭州大方化學(xué)試劑廠).藥材經(jīng)杭州師范大學(xué)王淑玲鑒定，柴胡為傘形科多年生草本植物北柴胡(BupleurumsinensesDC.)和狹葉柴胡(南柴胡BupleurumsachalinenseFr.Schm)的干燥根；黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根；枳殼為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)；青皮為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮；厚樸是木蘭科植物厚樸(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils)或凹葉厚樸(MagnoliaofficinalisRehd. et Wils. var. bilobaRehd. et Wils)的干燥干皮、根皮及枝皮；桔梗為桔?？浦参锝酃?Platycodongrandiflorum( Jacq.) A.DC.)的干燥根部；草果是姜科豆蔻屬植物草果(Amomumtsao-ko)的干燥成熟果實(shí)；檳榔為棕櫚科植物檳榔(ArecacatechuLinn.)的干燥種子；荷葉是睡蓮科植物蓮(NelumbonuciferaGaerth.)的葉；炙甘草為豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、脹果甘草(GlycyrrhizainflateBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabiaL.)的干燥根及根莖.切厚片.切片，蜜炙[1].以上藥材均符合2010版中國藥典標(biāo)準(zhǔn)，由華東大藥房提供.

表1　梯度洗脫條件

2方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

色譜柱為Spherisorb C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，進(jìn)樣量15 μL，體積流量1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長294 nm，流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫條件見表1.

在此色譜條件下，樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚相應(yīng)峰分離良好，且陰性對照無干擾.

2.2　對照品溶液的制備

精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚等對照品適量，干燥后，精密稱定，加色譜級甲醇定容，配制成56、144、88、48、44 μg/mL的混合對照品溶液，備用.

2.3　樣品溶液的制備

柴胡達(dá)原飲處方由柴胡15 g、黃芩15 g、枳殼15 g、青皮15 g、厚樸15 g、桔梗15 g、草果6 g、檳榔10 g、荷葉10 g、炙甘草6 g共10味中藥材組成.方中飲片按君臣佐使組方原則分為4組：A(黃芩、柴胡)，B(枳殼、桔梗、厚樸、草果、青皮、檳榔)，C(荷葉)，D(炙甘草).按照排列組合法，共有15種組合方式(ABCD，A+B+C+D，AB+C+D，AC+B+D，AD+B+C，BC+A+D，BD+A+C，CD+A+B，AB+CD，AC+BD，AD+BC，ABC+D，ABD+C，ACD+B，BCD+A).

將處方中藥材分別粉碎，按處方比例稱取10～20目之間粗粉，進(jìn)行提取.提取3次，時(shí)間依次為30、15、15 min，提取溫度為100 ℃.加水量分別為中藥量的10、8、8倍.提取液分別用4層紗布濾過，分別離心(3 000 r·min-1，20 min)，合并上清液，減壓濃縮并定容.ABCD、B、AB、BC、BD、ABC、ABD、BCD的提取液減壓濃縮定容至500 mL；A、C、D、AC、AD、CD、ACD的提取液減壓濃縮定容至100 mL.吸取ABCD提取液1 mL，至10 mL容量瓶中，加色譜級甲醇定容，搖勻，得ABCD樣品液；從A、B、C、D提取液中分別吸取1、5、1、1 mL.搖勻后吸取1 mL至10 mL容量瓶中，加色譜級甲醇定容，得A+B+C+D樣品液；以此類推制備15種組合方式的樣品液.分別過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得15組供試液.

2.4　陰性對照溶液的制備

按處方比例分別制備缺枳殼、青皮、厚樸的陰性樣品，按2.3項(xiàng)操作，得陰性對照溶液，依2.1項(xiàng)測定.結(jié)果陰性對照在柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚相應(yīng)保留時(shí)間處無干擾.

2.5　線性關(guān)系考察

取制備的混合對照品溶液，進(jìn)樣量依次為1、3、5、10、20 μL，依2.1項(xiàng)測定.以各對照品峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：柚皮苷y=1 300 690x+18 161(r=0.9995)，橙皮苷y=1 254 040x+42 902(r=0.9995)，新橙皮苷y=624 020x+13 852(r=0.9997)，和厚樸酚y=124 912x-12 202(r=0.9999)，厚樸酚y=138 888x-2 612.7(r=0.9999).結(jié)果表明柚皮苷在0.28~5.6 μg，橙皮苷在0.44~8.8 μg，新橙皮苷在0.44~8.8 μg，和厚樸酚在0.24~4.8 μg，厚樸酚在0.22~4.4 μg線性關(guān)系良好.

2.6　精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液15 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，依2.1項(xiàng)測定.計(jì)算得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的RSD分別為0.86%、1.13%、2.02%、1.73%、1.32%，表明儀器精密度良好.

2.7　穩(wěn)定性試驗(yàn)

取ABCD組供試液，分別在 0、2、4、6、8、12 和 24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，測得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD分別為 1.49%、0.81%、0.89%、0.76%、1.85%，表明樣品溶液 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.8　重現(xiàn)性試驗(yàn)

取ABCD組6份，按2.3項(xiàng)操作制備供試液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積.測得樣品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積RSD 為1.23%、2.02%、1.07%、1.10%、1.40%.結(jié)果表明測定方法重現(xiàn)性良好.

2.9　回收率試驗(yàn)

取已知含量的ABCD組供試液6份，每份1 mL，分別按照下表2加入對照品，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，依2.1項(xiàng)測定.結(jié)果見表2.

表2　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10　樣品含量測定

取2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液(圖譜如圖1-圖5所示,其中：1—柚皮苷；2—橙皮苷；3—新橙皮苷；4—和厚樸酚；5—厚樸酚)，分別進(jìn)樣測定，每份平行測定3次，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算，取平均值.結(jié)果見表3.

圖1　混合對照品圖譜Fig. 1　Mixed standard map

圖2　缺枳殼陰性對照圖譜Fig .2　Auranth fructus negative control map

圖3　缺青皮陰性對照圖譜Fig. 3　Citri reticulatae pericarpium viride negative control map

圖4　缺厚樸陰性對照圖譜Fig. 4　Magnoliae officinalis cortex negative control map

圖5　樣品圖譜Fig. 5　Samples map

表3　15種組合方式中5種成分的含量

2.11　5種成分之間的相關(guān)性分析

運(yùn)用SAS9.1[2]系統(tǒng)研究5種成分兩兩之間的相關(guān)性，結(jié)果見表4.

表4　5種成分兩兩之間的相關(guān)性

注：r表示相關(guān)系數(shù);*P<0.05,**P<0.01.

由表4可知:柚皮苷和新橙皮苷存在相關(guān)性；新橙皮苷與和厚樸酚、厚樸酚存在相關(guān)性；和厚樸酚與厚樸酚存在相關(guān)性.由于這些成分均存在于臣藥B中，它們存在相關(guān)性說明分煎、合煎方式對它們?nèi)艹龅挠绊懯且恢碌?同時(shí)，橙皮苷對和厚樸酚與厚樸酚都有相關(guān)性，對柚皮苷和新橙皮苷都沒有相關(guān)性，說明橙皮苷、和厚樸酚與厚樸酚受到的影響是一致的.而柚皮苷對和厚樸酚與厚樸酚無相關(guān)性，新橙皮苷對和厚樸酚與厚樸酚有相關(guān)性，前面已知柚皮苷和新橙皮苷有相關(guān)性，說明此方法分析相關(guān)性具有一定的局限性.

表5　3種藥材的典則相關(guān)分析

注：r表示典則相關(guān)系數(shù)；*P<0.05,**P<0.01.

由于柚皮苷和新橙皮苷存在相關(guān)性，和厚樸酚與厚樸酚存在相關(guān)性，柚皮苷和新橙皮苷是枳殼的主要藥用成分，和厚樸酚與厚樸酚是厚樸的主要藥用成分，將5種成分分為三組：柚皮苷和新橙皮苷、橙皮苷、和厚樸酚與厚樸酚.對這三組數(shù)據(jù)兩兩進(jìn)行相關(guān)分析，即是對藥材枳殼、青皮和厚樸進(jìn)行相關(guān)分析.利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對兩組變量間進(jìn)行相關(guān)分析即典則相關(guān)分析(canonical correlation analysis)，反應(yīng)兩組變量的相關(guān)本質(zhì).分析結(jié)果見表5.

2.12　綜合評價(jià)法選擇較優(yōu)的組合方式

表6　綜合評判Y值

由上表可知，Y值最高的組合為ACD+B.

3討論

1) 15種組合方式供試液的色譜峰個(gè)數(shù)一致，說明該條件下，未檢出合煎、分煎方式產(chǎn)生的新化合物[3-4].

2) 運(yùn)用SAS9.1系統(tǒng)研究5種成分兩兩之間的相關(guān)性，具有一定的局限性.利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中對兩組變量間進(jìn)行典則相關(guān)分析，在數(shù)據(jù)分析上，反應(yīng)兩組變量的相關(guān)本質(zhì).青皮和厚樸存在相關(guān)性；枳殼和青皮、厚樸的相關(guān)性不顯著.可以認(rèn)為枳殼在合煎、分煎中受到的影響與青皮、厚樸是不同的.另外，組合對各味藥其他成分的影響，對整體藥性的影響以及煎出液的藥效方面的影響，還需要進(jìn)一步深入研究.

3) 但從5種成分煎出量角度分析，利用綜合評價(jià)法選擇較優(yōu)的組合方式，Y值最高的組合為ACD+B.而且，B分煎時(shí)的Y值要明顯大于B與其他組分合煎，表明B分煎更有利于藥用成分的溶出.

參考文獻(xiàn):

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[2] 阮敬.SAS統(tǒng)計(jì)分析從入門到精通[M].北京:人民郵電出版社,2009.

[3] Satoh H. Pharmacological characteristics of Kampo medicine as a mixture of constituents and ingredients[J]. J Integr Med,2013,11(1):11-16.

[4] Islam M K, Mahmud I, Saha S,etal. Preliminary pharmacological evaluation of Alocasia indica Schott tuber[J]. J Integr Med,2013,11(5):343-351.

On the Effects of Different Decoction of Chaihudayuan Decoction on the Extract of

5 Chemicals by Canonical Correlation Analysis

WANG Shuling1, YU Xiangjun2, ZHAN Yifei3, ZHAO Zhenkun1, PANG Xiaoqing1, XIE Tian1, ZENG Zhaowu1，4

(1.Medical College, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2.Agro-technical Station of Fengshuling Town,

Hangzhou 311717, China; 3.The People’s Livelihood Pharmaceutical Co., Hangzhou 310012, China;

4.Dalian Holley Kingkong Pharmaceutical Co.,Ltd., Dalian 116000, China)

Abstract:This paper studies the effects of different mixed and separated decoction of Chaihudayuan Decoction on the extract of 5 chemicals, naringin, hesperidin, neohesperidin, honokiol and magnolol. The 10 medicinal herbs used in Chaihudayuan Decoction are divided into 4 groups according to monarch, minister, assistant and guide. The 4 groups have 15 different decoctions and the contents of the 5 chemicals are determined by UFLC. The data is analyzed by SAS 9.1. The results show that the 5 chemicals are well separated and show good linearity. Hovenia dulcis is affected in combined decoctions and separated decoctions differently from green husk, magnolia bark. The best composition is ACD+B, and the contents of naringin, hesperidin, neohesperidin, honokiol and magnolol are 1.313, 0.6370, 1.942, 0.8786, 0.6110 mg/mL respectively. The separated decoction ACD+B is proper for the 5 chemicals. The correlation analysis can deeply reveal the relations between the compositions.

Key words:Chaihudayuan Decoction; mixed decoction; separated decoction; correlation analysis; comprehensive evaluation

第14卷第1期2015年1月杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.14No.1Jan.2015

*共同第一作者

文章編號:1674-232X(2015)01-0049-06

中圖分類號:R284. 1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.01.009

通信作者：王淑玲(1972-)，女，講師，博士，主要從事中藥新技術(shù)、新制劑、新劑型、中藥復(fù)方研究.E-mail：wsling222@163.com

基金項(xiàng)目:杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130432B05，20131232i37)；遼寧省 “百千萬人才工程”資助項(xiàng)目(2013921005)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013E11SF052).

收稿日期：2014-05-17