基因組編輯技術(shù)——CRISPR/Cas系統(tǒng)

陳勇龍，黃華榮，唐平平，羊雪芹，李斐雪，許　杰，張遵義

(1.杭州師范大學(xué)發(fā)育與再生研究所，浙江 杭州 310036；2.石門中心衛(wèi)生院，浙江 嘉興 314512)

基因組編輯技術(shù)——CRISPR/Cas系統(tǒng)

陳勇龍1，黃華榮1，唐平平2，羊雪芹1，李斐雪1，許杰1，張遵義1

(1.杭州師范大學(xué)發(fā)育與再生研究所，浙江 杭州 310036；2.石門中心衛(wèi)生院，浙江 嘉興 314512)

摘要：基因定點編輯技術(shù)包括基于胚胎干細(xì)胞及同源基因片段重組的基因打靶技術(shù)、鋅指結(jié)構(gòu)(ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(TALEN)以及CRISPR/Cas系統(tǒng).CRISPR/Cas系統(tǒng)具有操作簡單、突變率高、成本低，同時可針對多個基因等優(yōu)點；該技術(shù)可進(jìn)行定點修飾, 如敲除、插入、替換等.目前CRISPR/Cas系統(tǒng)已成功應(yīng)用到小鼠、人類細(xì)胞、線蟲、果蠅、斑馬魚、擬南芥、水稻和猴等.文章將對基因修飾技術(shù)發(fā)展脈絡(luò)做統(tǒng)一梳理，并將系統(tǒng)闡述CRISPR/Cas系統(tǒng)的原理、應(yīng)用以及該技術(shù)的優(yōu)缺點.

關(guān)鍵詞：基因修飾；CRISPR/Cas系統(tǒng)；基因編輯

從20世紀(jì)50年代沃森和克里克揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)開始，人們真正從分子水平認(rèn)識了基因，開啟了通過改造基因來改造生物的科學(xué)實踐.1980年,Gordon利用顯微注射的方法獲得了第一例轉(zhuǎn)基因小鼠，標(biāo)志著動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立，也是基因編輯技術(shù)的開始[1].

基因編輯技術(shù)是人們開啟認(rèn)識基因功能的鑰匙.早期研究基因功能主要是利用隨機(jī)插入方式將外源基因整合到生物體內(nèi)或是通過同源重組方式刪除目的基因(圖1)，以獲得遺傳動物修飾模型，這些技術(shù)有諸多不利如周期長、成本高、技術(shù)體系復(fù)雜等；隨著人類基因組計劃的完成，將已知基因的序列與功能聯(lián)系在一起的功能基因組學(xué)研究成為后基因組時代的一大研究熱點.2012入選《Science》十大重要科學(xué)進(jìn)展之一——基因組編輯技術(shù)[2]，方便了研究者構(gòu)建基因修飾模型生物；這些技術(shù)可分為三類：鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)與Cas蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR/Cas).這些技術(shù)的應(yīng)用提高了基因編輯的效率，大大縮短模型生物建立的周期，方便對基因功能的研究.

1傳統(tǒng)基因修飾技術(shù)

傳統(tǒng)的基因修飾技術(shù)主要是利用隨機(jī)導(dǎo)入方式將目的基因整合到基因組上而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因機(jī)體[1]，以及基于胚胎干細(xì)胞與同源基因片段重組的基因打靶方式敲除目的基因而得到轉(zhuǎn)基因機(jī)體[3](圖1).該技術(shù)是過去幾十年并延續(xù)至今的研究基因功能及基因產(chǎn)物與關(guān)聯(lián)疾病機(jī)理的手段.但是這種基因修飾技術(shù)對實驗技術(shù)要求高，時間和資金投入大等缺點限制了其發(fā)展，而近些年來興起的基因組編輯技術(shù)可對目的基因進(jìn)行定點插入或刪除，同時操作步驟更簡化，周期和費用大大降低.

a.同源重組方式刪除目的基因；b.隨機(jī)插入方式整合到基因組圖1　傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理Fig. 1　The theory of traditional transgenic technology

2基因組編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)主要是通過核酸酶在DNA靶位點引起DNA雙鏈斷裂，激活細(xì)胞內(nèi)DNA兩種修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接(Non-homologous End Joining, NHEJ)和同源重組(Homologous Recombination, HR)，對靶點DNA進(jìn)行修復(fù).核酸酶主要依賴于蛋白質(zhì)或RNA與非特異性內(nèi)切酶的組合對目的DNA序列進(jìn)行切割.目前已經(jīng)成熟應(yīng)用的基因組編輯核酸酶有鋅指核酸酶(ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(TALENs),以及2013年以來一項新興的基因組編輯技術(shù)——CRISPR/Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)已逐漸成熟并成功應(yīng)用到多種生物，促進(jìn)了基因功能的研究.

ZFN和TALEN兩個系統(tǒng)的核酸酶分別依靠于鋅指蛋白和類轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白的特異性識別DNA序列，然后依靠非特異性的FokI內(nèi)切酶切割DNA.Yang等利用ZFNs技術(shù)研究導(dǎo)致動脈硬化癥的ApoCIII基因，設(shè)計了8對針對ApoCIII基因的第二個外顯子2的 ZFNs，將mRNA注射到兔的受精卵，體外培養(yǎng)結(jié)果顯示ApoCIII基因突變高達(dá)50%，體內(nèi)驗證ApoCIII突變達(dá)到23.8%[4].Luo等針對中國黃牛的肌生成抑制蛋白基因MSTN設(shè)計了一對ZFNs，靶點位于MSTN的第一個外顯子上，胚胎鑒定結(jié)果顯示，靶點突變率達(dá)20%，等位基因發(fā)生突變達(dá)8.3%[5].Wilson 等使用SSA技術(shù)針對人端粒反轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT設(shè)計了5對特異性的ZFNs，將700 ng ZFN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞內(nèi)，靶點突變達(dá)18.5%[6].ZFN不僅可以修飾目的基因，還可以用于疾病的治療.Xavier等利用借助腺病毒將ZFN和同源序列注射到小鼠腹腔，通過DNA同源重組修復(fù)機(jī)制將突變基因hF9修復(fù)，以達(dá)到治愈乙型血友病[7].同時Soldner在干細(xì)胞水平利用ZFN技術(shù)將突變的α-突觸核蛋白基因功能恢復(fù)正常，該基因的點突變會造成帕金森綜合癥[8].H?her等利用ZFN技術(shù)成功使皮膚起泡致病基因失活，并且發(fā)現(xiàn)高劑量的ZFN對皮膚干細(xì)胞沒有傷害同時仍具有再生活力[9].由此可看出，ZFN在人類疾病的治療方面具有很大的潛力；目前，ZFN進(jìn)行基因治療已應(yīng)用到臨床階段.ZFN在基因編輯方面表現(xiàn)出色，但自身缺點限制了其發(fā)展(表1)，因此，需要一種更為方便的技術(shù)解決ZFN的缺點.

表1　ZFN、TALEN和CRISPR/Cas系統(tǒng)特點

TALEN蛋白和真核生物的轉(zhuǎn)錄因子類似，識別特定的DNA序列調(diào)控基因的表達(dá).歐光朔等利用TALEN技術(shù)修飾線蟲表皮膠原蛋白基因dpy-5，導(dǎo)致線蟲體型較小[10].馬三垣等利用TALEN技術(shù)修飾家蠶的BmBlos2，發(fā)現(xiàn)對目的基因的修飾高達(dá)60%，同時還發(fā)現(xiàn)利用一對TALEN同時注射可以刪除大片段的核苷酸序列[11].劉海亮等針對關(guān)聯(lián)Rett綜合癥發(fā)病基因Mecp2設(shè)計TALEN，將TALEN質(zhì)粒注射到猴受精卵內(nèi)成功將該基因修飾，得到表型與人的Rett綜合癥一致[12].Takada等利用TALEN技術(shù)成功將miR-10a敲除，該技術(shù)是在microRNA的前體上進(jìn)行修飾，造成成熟的microRNA功能喪失[13].TALEN技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到大多數(shù)模式生物，例如猴[12]、果蠅[14]、小鼠[7]、線蟲[10]和斑馬魚[15]等等，可見該技術(shù)沒有物種特異性.雖然無論從時間還是資金方面，TALEN比ZFN較具有優(yōu)勢(見表1)，但是TALEN也存在著不足之處：識別目的基因的成分是蛋白質(zhì)，構(gòu)建識別20 bpDNA的TALEN蛋白可能需要上千個氨基酸，對機(jī)體來說可能會產(chǎn)生免疫反應(yīng)降低TALEN效率.如何高效、廉價、快速地構(gòu)建研究模型，是很多研究者共同關(guān)心的話題.CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)滿足了研究者的這一需求.

3CRISPR/Cas系統(tǒng)

3.1　CRISPR發(fā)現(xiàn)歷史及類型

CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)于1987年，日本研究者在研究EcoliK12堿性磷酸酶序列附近發(fā)現(xiàn)了成簇的短的間隔重復(fù)序列[16]；Grissa等研究表明，大約有40%的細(xì)菌和90%的古生菌的基因組都存在這種序列，定位于染色體或質(zhì)粒上[17].細(xì)菌和古生菌內(nèi)的CRISPR/Cas系統(tǒng)主要用于抵御病毒或噬菌體的入侵，是它們進(jìn)化形成的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng).CRISPR/Cas的組成序列很保守，這些短的重復(fù)序列被短的可變序列所間隔.CRISPR/Cas系統(tǒng)內(nèi)，Cas蛋白將入侵的DNA切割為短的序列并整合到細(xì)菌或古生菌的基因組內(nèi)，這些序列插入到重復(fù)序列之間，當(dāng)病毒或噬菌體再次入侵時，細(xì)菌或古生菌以整合到基因組的序列為模板轉(zhuǎn)錄為crRNA, crRNA引導(dǎo)Cas蛋白切割入侵的細(xì)菌或古生菌的DNA序列.目前已知的Cas蛋白家族已超過40個，他們在crRNA形成、外源DNA的整合以及剪切外源DNA發(fā)揮重要作用.根據(jù)Cas基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3種類型：I型、II型和III型.I型和III型較復(fù)雜，需要多個cas蛋白形成復(fù)合物才能切割靶DNA鏈，而II型只需要一個Cas9蛋白即可對DNA鏈進(jìn)行切割，因此II型也是目前被成功改造的人工核酸酶[18].本文將以II型CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行重點闡述：II型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅含有一個Cas9蛋白和一段20 bp的sgRNA序列，sgRNA用于識別目的序列，Cas9指導(dǎo)前體crRNA的成熟和外源DNA或質(zhì)粒的降解.Cas9蛋白由1 409個氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，包括N端的類Ruc核酸酶結(jié)構(gòu)域和中部NHN核酸酶結(jié)構(gòu)域，NHN結(jié)構(gòu)域可切割與crRNA互補(bǔ)配對的模板鏈，切割位點在PAM序列上游4 bp的位置；Ruc結(jié)構(gòu)域可對另一條鏈進(jìn)行切割，切割位點在PAM序列上游3~8 bp(圖2).

注：綠色部分為RuvC結(jié)構(gòu)域，粉色部分為HNH結(jié)構(gòu)域；↓為DNA序列斷裂位點；黃色序列為sgRNA，藍(lán)色為PAM序列，紅色序列為chimeric guide RNA折疊序列圖2　CRISPR/Cas9 模式圖Fig. 2　The CRISPR/Cas9 model

3.2　CRISPR/Cas9作用原理

II型CRISPR/Cas系統(tǒng)編碼tracrRNA,tracrRNA指導(dǎo)RNaseIII和crRNA前體的成熟；成熟的crRNA與tracrRNA互補(bǔ)配對形成RNA二聚體，介導(dǎo)Cas9蛋白對靶位點進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈的斷裂，引起體內(nèi)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制包括插入/缺失引起的末端連接和同源重組修復(fù)機(jī)制(圖2).插入/缺失機(jī)制會造成原序列缺少一些堿基或在原序列引入一些堿基，無論何種情況都會引起目的基因突變，可能使該基因失去功能.而同源重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)機(jī)制，利用CRISPR/Cas系統(tǒng)將DNA雙鏈切斷，通過引入的一段與目的基因同源序列進(jìn)行同源交換以達(dá)到修復(fù)目的基因.大量實驗證明，CRISPR/Cas9是最行之有效的基因編輯工具,已廣泛應(yīng)用于基因組編輯、基因治療以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控.

3.3　CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯方面具有優(yōu)勢，就II型系統(tǒng)來說僅需要一段20 bp的DNA序列和Cas9蛋白.目前，已有商品化的質(zhì)粒供研究者選擇，僅需將20 bp的sgRNA克隆到CRISPR/Cas9質(zhì)粒即可.Wang等利用該技術(shù)將Cas9 mRNA和sgRNA注射到小鼠的受精卵，結(jié)果顯示80%都發(fā)生了等位基因的突變；CRISPR/Cas9系統(tǒng)打破了在基因組編輯方面一次僅能編輯一個基因的格局，該文章作者設(shè)計5個不同基因的sgRNA的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tet1、Tet2、Tet3和Sry、Uty同時被編輯且效率很高，這對于研究基因家族成員的功能相關(guān)性至關(guān)重要[19].同樣的結(jié)果在斑馬魚[20]、人體細(xì)胞[21]、線蟲[22]、大鼠[23]和猴[24]等也得到了驗證.單奇?zhèn)サ壤肅RISPR/Cas技術(shù)對水稻OsPDS、OsMPK2 以及OsBADH2基因進(jìn)行改造得到了這3個基因的突變株，這對于作物性狀改良及分子定向育種非同尋常[25].

基因能否正常發(fā)揮功能，取決于在轉(zhuǎn)錄水平能否正常轉(zhuǎn)錄.在轉(zhuǎn)錄水平研究基因，對了解功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常有意義.由于CRISPR/Cas系統(tǒng)具有定向識別作用，當(dāng)sgRNA和Cas蛋白形成復(fù)合物結(jié)合到DNA序列上后，復(fù)合體的結(jié)合解開DNA雙鏈可能導(dǎo)致RNA酶及轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合到DNA序列使得轉(zhuǎn)錄受阻.Lei等利用此原理設(shè)計兩個sgRNA，一個結(jié)合在編碼紅色熒光蛋白的序列，另一個結(jié)合在編碼綠色熒光蛋白的序列，兩個蛋白表達(dá)互不干擾的情況下，將兩個sgRNA和Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)兩種蛋白熒光強(qiáng)度均大幅度下調(diào)[26].Gilbert等將抑制因子及激活因子和Cas9蛋白共同表達(dá)，結(jié)果顯示在人的細(xì)胞系和酵母細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄明顯受到抑制或激活；將轉(zhuǎn)錄抑制因子和Cas9蛋白耦合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)很多基因表達(dá)受到抑制[27].因此，iCRISPR (interfere CRISPR )系統(tǒng)是個特異性極強(qiáng)的工具，在不改變傳統(tǒng)遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)上調(diào)控基因的表達(dá).

CRISPR/Cas不僅可以調(diào)控基因的表達(dá)，還可校正突變基因.Urnov等利用ZFN技術(shù)在細(xì)胞水平校正了鐮刀狀貧血病和乙型血友病的突變基因片段，盡管致病基因得到校正，但是通過腺病毒感染人細(xì)胞從而將ZFN和同源序列引入細(xì)胞[28].然而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基因治療提供了一個新的、有力的技術(shù)手段.CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因治療的原理在于同源介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制，將正確的序列替換下突變的序列，從而治愈疾病.李勁松課題組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功將小鼠白內(nèi)障遺傳病治愈[29]； Schwank等利用該技術(shù)校正人干細(xì)胞中一種與囊腫性纖維化相關(guān)聯(lián)的基因缺陷[30].Ebina等利用該技術(shù)將HIV-1啟動子沉默，在感染CRISPR/Cas9質(zhì)粒的人干細(xì)胞細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HIV-1表達(dá)明顯下降[31].因此，可以利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對一些難以治愈的疾病進(jìn)行基因修復(fù)，以恢復(fù)其正常功能.

3.4　CRSIPR/Cas系統(tǒng)利弊

人工核酸酶最吸引人的地方在于個性化的定制及對基因組進(jìn)行定點修飾.目前這三種人工核酸酶在基因組改造方面都有著很高的編輯效率.CRISPR/Cas系統(tǒng)相較于ZFN和TALEN有著明顯的優(yōu)勢：1.CRISPR/Cas系統(tǒng)比ZFN和TALEN在基因組中分布范圍廣，每8 bp就有一個靶點，而TALEN 1/125 bp，ZFN 1/500 bp；2.CRISPR/Cas系統(tǒng)可以一次對多個基因進(jìn)行定點修飾，而ZFN和TALEN則需要多對；3.CRISPR/Cas系統(tǒng)性價比高，僅需將一段20 bp的sgRNA克隆到表達(dá)質(zhì)粒上即可，ZFN和TALEN目前都被公司壟斷——成本高，且需要各種組裝——操作復(fù)雜；4.II型CRISPR/Cas系統(tǒng)易于改造，將Cas9蛋白功能域NHN結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域中的一個進(jìn)行突變，突變的Cas9蛋白只能切割DNA單鏈，增加缺陷基因被修復(fù)的概率；雙突變可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)；還可將其他功能蛋白加到Cas9蛋白末端，例如將轉(zhuǎn)錄抑制因子連接到Cas9蛋白末端等，用于抑制基因轉(zhuǎn)錄[27].因此，研究人員有待對CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行深入研究，使其具有更廣泛的實用性及高效性.

基因組編輯技術(shù)在基因修飾方面有著重要作用，特別是CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物模型構(gòu)建方面的優(yōu)勢更是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)無法達(dá)到的.但無論ZFN還是TALEN，以及性價比很高的CRISPR/Cas系統(tǒng)都無法避開一個問題：脫靶效應(yīng)[32-33].由于II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性取決于PAM前20 bp的sgRNA，理論上脫靶效率會很高，目前很多實驗證實CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶效率低于ZFN和TALEN，特異性很高.但針對不同生物、不同組織、不同細(xì)胞CRISPR/Cas系統(tǒng)作用效率還有差別.CRISPR/Cas系統(tǒng)還面臨另一個問題——很多器官組織及原代細(xì)胞難轉(zhuǎn)染，張鋒課題組構(gòu)建出了慢病毒CRISPR/Cas9，可以高效轉(zhuǎn)染組織和細(xì)胞[34].在原核注射方面，sgRNA和Cas9 RNA的濃度越高，作用效率越高，但是理論上來說可能會給胚胎帶來高毒性； Wang等研究表明，高濃度的RNA給胚胎帶來的毒性很低[19].因此，需要研究者繼續(xù)優(yōu)化以開發(fā)出低脫靶、高效率的CRISPR/Cas系統(tǒng).

4展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)對生命科學(xué)的發(fā)展起著革命性的作用，極大地拓展了研究者對模式生物的研究能力，同時也為探索治愈遺傳性疾病提供了一條路徑.該系統(tǒng)在基因改造方面具有極強(qiáng)的潛力和靈活性，但是，PAM序列的存在限制了II型CRISPR/cas系統(tǒng)的應(yīng)用.如何對 II型CRISPR/Cas系統(tǒng)Cas9蛋白改造最終摒棄PAM序列，以拓展其應(yīng)用范圍？目前，研究者在研究強(qiáng)烈火球菌和硫磺礦硫化葉菌時發(fā)現(xiàn)Cas RAMP模塊(Cmr)系統(tǒng)，由蛋白質(zhì)和30~40 nt堿基組成，修飾對象為RNA；該系統(tǒng)具有高效率、低脫靶[35-36]特點.該技術(shù)還主要集中在對原核生物的研究，相信不久將來，將會應(yīng)用到哺乳類等真核生物.可以預(yù)見，CRISPR/Cas系統(tǒng)在基礎(chǔ)研究、疾病治療以及育種方面具有廣闊的應(yīng)用前景，將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義.

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Genome Editing Techniques—CRISPR/Cas System

CHEN Yonglong1, HUANG Huarong1, TANG Pingping2, YANG Xueqin1, LI Feixue1, XU Jie1, ZHANG Zunyi1

(1.Institute of Developmental and Regenerative Biology, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China;

2.Shimen Central Hospital, Jiaxing 314512, China)

Abstract:Genome editing technologies include gene targeting based on embryonic stem cells and homologous gene fragments recombination, zinc-finger nucleases(ZFN), transcription activator-like effectors nuclease(TALEN) and CRISPR/Cas system. CRISPR/Cas system has merits of operating simply, high mutation rate with low-cost and editing multiple genes simultaneously. It can fixed-point modify, such as knockout, insert and replace genes. This system has successfully applied to a variety of organisms such as mouse, human cells, nematode, fruit fly, zebra fish, arabidopsis, rice and monkey. The paper outlines the development of gene modificative technology, and illustrates the principle, application as well as the merits and demerits of CRISPR/Cas system.

Key words:genomic modification; CRISPR/cas system; genome editing

第14卷第1期2015年1月杭州師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.14No.1Jan.2015

文章編號:1674-232X(2015)01-0060-06

中圖分類號:Q33；Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2015.01.011

通信作者：張遵義(1957—)，男，教授，博士，主要從事動物頭面部器官發(fā)育及新生缺陷形成中的遺傳學(xué)機(jī)理研究.E-mail:zunyizhang@idrbio.org

基金項目:浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目(2014R421071)；杭州師范大學(xué)大學(xué)生科研項目(1283XXM141)；浙江省科技計劃項目(2013C37024)；杭州師范大學(xué)2014研究生創(chuàng)新基金項目.

收稿日期：2014-07-31