犬細(xì)小病毒PCR 檢測(cè)方法的建立

黃雪梅 廣西北海市海城區(qū)潿洲鎮(zhèn)漁牧獸醫(yī)站 536004

犬細(xì)小病毒（CPV）是在1978年首次發(fā)現(xiàn)，隨后在全世界范圍內(nèi)流行，因此有關(guān)該病毒的研究工作開(kāi)展得較晚。

為了進(jìn)一步解決CPV 在臨床上的快速診斷問(wèn)題,針對(duì)VP2 基因設(shè)計(jì)特異引物[2]，預(yù)擴(kuò)增片段大小990 bp，并通過(guò)條件優(yōu)化試驗(yàn)確定合適退火溫度、引物濃度、合適Mg2+濃度等，建立一個(gè)特異性好、敏感度高、快速簡(jiǎn)便檢測(cè)CPV 核酸的PCR 方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

疑似犬細(xì)小病毒病的犬糞便、犬細(xì)小病毒CPV、犬流感病毒CIV、犬瘟熱病毒CDV，以及犬副流感病毒CPIV、緩沖液、Taq DNA 聚合酶、dNTPs(each 10 mmol/L)、dNTPs(each 2.5mmol/L)、DL2000 DNA Marker 、實(shí)驗(yàn)儀器等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）引物合成。根據(jù)GenBank 中登錄的犬細(xì)小病毒序列[DQ903936],針對(duì)其VP2 基因,設(shè)計(jì)引物:CPV上游引物5-GTTCTGGGGGTGTGGGGATTT-3；下游引物5-CTCCCCCCCGTCCTGCTGCAA-3，預(yù)擴(kuò)增片段大小990bp。用ddH2O 將引物稀釋為20μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）目的基因產(chǎn)物的PCR 擴(kuò)增。將以上成分混勻后，在UNO-II 型核酸擴(kuò)增儀運(yùn)行。運(yùn)行程序如下。

表1 在25μ 的PCR 擴(kuò)增體系中加入如下成分

（3）PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)。取PCR 產(chǎn)物5μL 加入Loading Buffer 1μL 混勻，加到1%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，并設(shè)置分子量參照標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker DL2000。先用100V 電壓，50mA 電流進(jìn)行電泳，待PCR 產(chǎn)物進(jìn)入凝膠后，再以80V 電壓，40mA 電流繼續(xù)電泳，直到PCR 產(chǎn)物進(jìn)入凝膠一定距離后（約30min），再進(jìn)行凝膠成像拍照分析。

（4）特異性實(shí)驗(yàn)。根據(jù)建立的犬細(xì)小病毒PCR 檢測(cè)方法，抽提犬流感病毒RNA、犬瘟熱病毒DNA，以及犬副流感病毒RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備模板加入到犬瘟熱病毒RT-PCR 反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢測(cè)該方法的特異性。

（5）敏感性實(shí)驗(yàn)。抽提病毒DNA，運(yùn)用核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行DNA 含量測(cè)定，定量的DNA 依10 倍梯度依次進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮腄NA 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢測(cè)該方法的敏感性。

（6）臨床樣品檢測(cè)。對(duì)疑似犬細(xì)小病毒病的15例犬糞便進(jìn)行臨床檢測(cè)。

3 結(jié)果

（1）特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分別以犬瘟熱病毒（CDV）、犬流感病毒（CIV）、犬細(xì)小病毒(CPV)和犬副流感病毒(CPIV)作為樣品，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照作PCR 特異性檢測(cè)，結(jié)果以CPV 陽(yáng)性樣品為模板的泳道出現(xiàn)明顯的大小約為990bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，其他樣品呈陰性。結(jié)果表明，引物對(duì)CPV 具有專(zhuān)一性，可區(qū)分與犬細(xì)小病毒癥狀相似的一些疾病。

（2）敏感性檢測(cè)結(jié)果。運(yùn)用建立的犬細(xì)小病毒PCR 方法對(duì)犬細(xì)小病毒進(jìn)行敏感性檢測(cè)。結(jié)果該引物對(duì)犬細(xì)小病毒DNA 的最低檢出量達(dá)到10pg，表明該檢測(cè)方法對(duì)病毒目的基因擴(kuò)真具有很高的敏感性。

（3）臨床樣品檢測(cè)。在15 例疑似犬細(xì)小病毒的臨床病料檢測(cè)中，能夠檢測(cè)出特異性病毒的結(jié)果顯示，有13 例出現(xiàn)大小約為990bp 擴(kuò)增片段，陽(yáng)性檢出率約為86.66%。

通過(guò)針對(duì)VP2 基因設(shè)計(jì)特異引物,成功建立了特異性好、敏感度高、快速簡(jiǎn)便檢測(cè)CPV 核酸的PCR方法。

94℃3min，1 個(gè)循環(huán)。94℃1 min，55℃1 min，72℃90s；30 個(gè)循環(huán)。72℃8min，1 個(gè)循環(huán)。

在PCR 擴(kuò)增程序運(yùn)行時(shí)，設(shè)立不加模板的陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，取3μL PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)進(jìn)行電泳檢測(cè)。

[1]劉忠華,鐘翎,賀星亮,等.用PCR 技術(shù)鑒定犬細(xì)小病毒弱毒疫苗株[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2003,23(5):444-446.

[2]楊德威,宋延華,劉福安.應(yīng)用套式PCR 在MDCK 細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)犬細(xì)小病毒[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(3):81-82.